Name: Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Keşfedin modüler hidrojel levha üretimini ve 3D hücre kültürü sistemleri için montaj tekniklerini. Bu yöntem, doku mühendisliğinde kontrollü hücresel mikroortamlar oluşturarak fonksiyonel mühendislik dokuları geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla Ulusal Lider Araştırma Laboratuvarı Programı (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca bir KAIST Systems Sağlık Programını da kabul etmektedir.

1. Mikro Desenli Kalıpların ve Hidrojellerin Hazırlanması
<ol>
	<li>PDMS kalıplarının dökümü için standart iki aşamalı fotolitografi tekniği15,17 ile bir silikon gofretin yüzeyinde SU-8 fotorezist kullanarak istenen mikro ölçekli desenleri üretin. Gösterilen örnek, karaciğer lobül benzeri bir ağ deseni kullanır (Şekil 1).</li>
	<li>PDMS'yi ve 1:5 oranında bir sertleştirici solüsyonu tartın (ör., 12.5 g PDMS ve 2.5 g sertleştirici).</li>
	<li>15 g çözeltiyi iyice karıştırın, kabarcıkları bir vakum odasında gazdan arındırın ve ardından karışık çözeltiyi bir folyo döküm kabı içinde eşit şekilde silikon gofretin mikro desenli bir yüzeyine yayın.</li>
	<li>PDMS'yi sertleştirmek için silikon gofreti 65 °C'de ısıtılmış bir plakaya 90 dakika boyunca düz bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Sertleşmiş PDMS'yi döküm kabından ve silikon gofretten çıkarın.</li>
	<li>PDMS'nin kenarlarını kesin ve mikro desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 100 mm çapında bir petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Birincil sterilizasyon için %70 etanol ve damıtılmış su kullanarak mikro desenli kürlenmiş PDMS'yi petri kabında yıkayın. Daha sonra 65 °C'lik bir fırında 10 dakika boyunca tamamen kurutun.</li>
	<li>O / N 3 g toz iyonik noniyonik yüzey aktif maddeyi 100 ml damıtılmış su içinde çözün ve karıştırın,% 3 (a / h) bir kaplama çözeltisi oluşturun.</li>
	<li>Mikro desenli PDMS kalıplarını bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve sulu sıvıların eklenmesini kolaylaştırmak için hidrofilik bir yüzey oluşturmak için 1 dakika (85 W, 0,73 mbar) temizleyin. Ardından, PDMS'nin yüzeyini bir laboratuvar rocker kullanarak en az 3 saat (veya O/N) boyunca 100 ml yüzey aktif madde çözeltisi ile kaplayın.</li>
	<li>Yüzey aktif madde çözeltisini PDMS kalıplarından yıkayın ve 65 °C'de 10 dakika fırında tamamen kurutun. Ardından, her bir mikro desenli kalıbı 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) radyasyona maruz bırakarak sterilize edin.</li>
</ol>
2. Hücre süspansiyonunu bir hidrojel öncüsünde hazırlayın
<ol>
	<li>Hidrojel öncüsünü hazırlamak için, 0.1 g sodyum aljinat tozunu 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün ve %1 (a/h) bir aljinat öncüsü oluşturun. Tozu tamamen çözmek için inkübe edin ve O/N karıştırın.</li>
	<li>Çözeltiyi 1 ml'lik bir şırıngaya bağlı 0.22 μm'lik bir filtreden süzün.</li>
	<li>HepG2 hücrelerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatörde% 70 -% 80 birleşene kadar% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile geleneksel bir doku kültürü kabında desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamındaki (DMEM) kültürleyin.</li>
	<li>Hücreleri PBS kullanarak bir kez yıkayın ve ardından 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 4 dakika boyunca 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyerek tripsinize edin. Kültür kabından hasat edilen hücreleri 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve süpernatantın çıkarılmasını takiben 1 ml PBS kullanarak yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak PBS'deki tek dağıtılmış hücrelerin sayısını sayın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjlemenin ve PBS'nin çıkarılmasının ardından, kalan hücre peletine 1 ml %1 (a/h) sodyum aljinat çözeltisi ekleyin ve pipetleme kullanarak nazikçe karıştırın. Hücrelerin son tohumlama yoğunluğu 5 x 106 - 107 hücre / ml olmalıdır. Hücre/hidrojel süspansiyonunu 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde inkübe edin.</li>
</ol>
3. Hücre/Hidrojel Süspansiyonunun Yüklenmesi ve Çapraz Bağlanması
<ol>
	<li>Bir çapraz bağlama reaktifi üretmek için 1.47 g kalsiyum klorür dehidratı 100 mlddH2O'daçözün (ör., ddH2O içinde 100 mM CaCl2 · 2H2O).</li>
	<li>Bir nemlendiricinin içini% 70 etanol kullanarak ultrasonik dönüştürücü ile durulayın ve 200 ml çapraz bağlama reaktifi ile doldurun. Nemlendirici 110 mm genişliğinde, 300 mm uzunluğunda ve 170 mm derinliğindedir (yani 110 mm x 300 mm x 170 mm (G x Y x D)).</li>
	<li>Mikro desenli PDMS kalıplarını bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve hidrofilik bir yüzey oluşturmak için 85 W'ta 1 dakika boyunca temizleyin.</li>
	<li>Kalıptaki mikro desenin kenarına 7,2 μl'lik iyi karıştırılmış hücre/hidrojel süspansiyonunu sabit bir şekilde yükleyin. Gösterilen örnek, karaciğer lobül benzeri bir ağ deseni kullanır (Şekil 1). Süspansiyonun hacmi topografik desene bağlıdır.</li>
	<li>Hücre/hidrojel süspansiyonunun jelleşmesini sağlamak için, nemlendiriciyi açın ve nemlendiricinin çapraz bağlama reaktifinden bir sis ürettiğini doğrulayın. Çapraz bağlama reaktifini, PDMS kalıplarının topografik yüzeyini 5 cm. aralığında kaplayacak şekilde hidrojel öncüsü üzerine püskürtün
	Not: 5 cm'den daha uzun ve daha kısa mesafeler sırasıyla eksik ve düzensiz jelleşmeye neden olabilir. Nemlendiricinin 250 ml/saat püskürtme hızına sahip olduğundan ve 5 dakikada 20 ml çapraz bağlama reaktifi sisi ürettiğinden emin olun.</li>
	<li>Çapraz bağlama işleminin ardından nemlendiriciyi kapatın ve PDMS kalıplarını PBS ile doldurun.</li>
</ol>
4. Tek Modüler Hidrojel Levhaların Kullanımı
<ol>
	<li>200 μl'lik bir pipet ucu kullanarak PBS'yi hidrojel tabakasının etrafına nazikçe pipetleyerek sertleştirilmiş her bir hidrojel tabakasını mikro desenli kalıplardan ayırın.</li>
	<li>Her bir yüzen hidrojel tabakasını, uçtan kesilmiş 1.000 μl'lik bir pipet ucu kullanarak alın. Her karaciğer lobül benzeri ağ hidrojel tabakası 8 mm x 8.7 mm boyutlarındadır ve 100 - 200 μm kalınlığındadır.</li>
	<li>Hidrojel tabakasının tek bir katmanını 12 oyuklu bir plakada 1 ml DMEM'e aktarın ve hücreleri in vitro olarak kültürleyin hidrojel yapısını 12 oyuklu plakada bir birim bileşen olarak bir hafta boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde bir bileşen olarak kullanın. Kültür ortamını her gün değiştirin.</li>
</ol>
5. Çok Katmanlı Hidrojel Levhaların Montajı
<ol>
	<li>18 mm x 18 mm x 4 mm (G x Y x D) boyutlarında ve alt yüzeyinde 170 μm yüksekliğinde sütun yapıları içeren bir PDMS çerçevesi oluşturmak için 1.1 ila 1.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Adım 1.2'deki ile aynı oranda 42 g PDMS ve sertleştirici madde karışımı kullanın. 8 mm x 9 mm x 2 mm (G x Y x D) boyutlarında bir iç çerçeve oluşturmak için PDMS çerçevesi için silikon gofret üzerine özel bir polikarbonat kalıp yerleştirin.</li>
	<li>PDMS çerçevesini ve 180 μm gözenekli naylon filtre kağıtlarını damıtılmış su ve cımbıza batırılmış halde otoklavda 121 °C'de 15 dakika sterilize edin.</li>
	<li>Sterilize edilmiş PDMS çerçevesini 60 mm çapında bir petri kabında çeyrek parça naylon filtre kağıdına (5 cm çapında) yerleştirin.</li>
	<li>Uçtan kesilmiş 1.000 μl'lik bir pipet ucu kullanarak modüler bir hidrojel tabakayı PDMS çerçevesinin içine aktarın. Montaj için kullanılan hidrojel levhalar, imal edildikten sonra en az bir gün kültürlenmelidir.</li>
	<li>Boş bir 200 μl pipet ucu kullanarak her modüler hidrojel tabakanın kenarını PDMS çerçevesiyle hizalayın.</li>
	<li>4 - 6 katmandan oluşan bir yığın oluşturmak için modüler hidrojel levhalar kullanarak 5.4 ve 5.5 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Kültür ortamını, PDMS çerçevesinin altındaki sütun yapılarından dışarı akıtarak çıkarın. Daha sonra çok katmanlı yapının bir köşesine 2 μl aljinat çözeltisi (a/h% 2) ekleyin.</li>
	<li>Her katmanın kenarlarını diğerininkilerle tutturmak için çok katmanlı yapıya 30 saniye boyunca çapraz bağlama reaktifinden bir sis püskürtün. Çapraz bağlama reaktifinden 2 ml sis kullanın (250 ml / saat püskürtme hızında).</li>
	<li>Çok katmanlı yapıyı 400 μl DMEM ile nazikçe durulayın ve cımbız kullanarak PDMS çerçevesini çıkarın.</li>
	<li>4 ml DMEM ilavesini takiben bir hücre kaldırıcı ile hafifçe silerek çok katmanlı yapıyı filtre kağıdından ayırın.</li>
	<li>Çok katmanlı yapıyı, filtre kağıdı kullanarak 3 ml DMEM içeren 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve hücreleri in vitro olarak yüzer bir şekilde kültürleyin, hidrojel yapısı 6 oyuklu plakada çok ölçekli bir hücresel iskele olarak bir hafta boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde Kültür ortamını her gün değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li>
<li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li>
<li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li>
<li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).</li>
<li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol%E2%88%92Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li>
<li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li>
<li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li>
<li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li>
<li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li>
<li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, modüler hidrojel levhaların üretilmesi ve bunların 3 boyutlu hücresel yapı iskeleleri oluşturacak şekilde birleştirilmesi için basit bir yöntem sağlar.
Kısa sürede net desenli aljinat yapıları oluşturmak için, kalıptaki karmaşık mikro desenleri korumak ve ayrıca hücre canlılığını ve metabolizmasını sürdürmek için yeterince sert yapılar oluşturabilen bir çapraz bağlama süreci tanımlamalıyız. Sis şeklinde bir nemlendirici kullanarak çapraz bağlama reaktifini püskürtmek için sol-jel ...

Hidrojeller özellikle biyomalzemeler umut vericidir, ve temel biyoloji, farmakolojik deneyleri ve tıpta önemli olması beklenmektedir. 1 hidrojel tabanlı hücresel yapıları Biofabrication hayvan deneyleri kullanımını azaltmak için ileri sürülmüştür, 2,3, 4 transplante dokuların yerini ve geliştirmek Hücre bazlı deneyler. 5,6 su-ihtiva eden (hidro) viskoelâstik malzemelerin (jeller), hücrelerin geniş bir sayısı kapsüllenmiş ve 3B, hücresel mikro-kontrol etmek için bir iskele yapısı içinde muhafaza edilmesini sağlar. Mikroakışkan ya micropatterning teknolojileri yönlendirmesi ile birlikte, hidrojel yapıları geometrisi kesin hücresel ölçekte kontrol edilebilir. Tarih, parçacıkların dahil hidrojellerin şekiller, çeşitli, 7-9 lifler, 10-12 ve levhalar, 13-15 aşağıdan yukarıya beğenme yapı birimi olarak kullanılmıştırMakro ölçekli çok hücreli mimarilerinin imalat için ağrıyor. Hidrojel-bazlı partiküller ve elyaflar Hem mikroakışkan cihazlar kullanılarak akışkan kontrol grubu ile, mikro ölçekli hücre ortamları gibi uygulamalar için kolaylıkla ve hızlı bir şekilde imal olmuştur. Bununla birlikte, mühendislik dokuların temel birimleri olarak, onları yeniden düzenlemek ve makro ölçekli yapıları olarak hacmini büyütmek için. 16 mikron büyüklüğünde temel modülleri üretmek için daha Makro ölçekli yapıları elde etmek daha zordur karmaşık olacaktır. Hidrojel-bazlı yapıların Levha benzeri birimler basit bir montaj işlemi ile iskeleler hacmini artırmak için de kullanılabilir. Neticesinde, hidrojel levha istiflenmiş katmanları bir hacimsel artış, aynı zamanda 3D uzayda geometrik uzantısı sadece sağlar. Çoklu yumurtlama içine montajı ile birlikte 15 - Daha önce, 13 micropatterned hidrojel tabakaları imal edilmesi için bir yöntem bildirmiştirola- rak hücresel mimarileri. Teknik, çok katmanlı yapıların istifleme işlemi yoluyla karmaşık micropatterning ve hücresel yapıları modüler tasarımı sağlar. Micropatterned edilir istiflenmiş modüler hidrojel levha, imalatı ile, kontrollü bir makro-ölçekte, hücresel mikro-3 boyutlu bir hücre kültür sistemi gerçekleştirilebilir. Bu video protokol insan karaciğer karsinoma hücre hattında (HepG2) göre modüler hidrojel tabakaları oluşturmak için kullanılabilen basit ama güçlü bir üretim yöntemi açıklanmaktadır. Bu tarifnamede, basit olan bu desenli modüler hidrojel tabakaların manipülasyonu ve bir çok-tabakalı yapı halinde asamblajı göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Toz halinde noniyonik yüzey aktif madde&nbsp;</td></tr><tr><td>Aljinik asit sodyum tuzu, düşük viskoziteli</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik nemlendirici</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Modifiye ekipman, Maksimum püskürtme hızı: 250 ml / saat</td></tr><tr><td>Naylon net filtre hidrofilik, 180 & mu; m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat kalıp</td><td></td><td></td><td>PDMS çerçeve deseninin imalatı için özelleştirilmiş kalıp</td></tr></tbody></table>

micropatterned makro ölçekli 3d hücresel mimarlık modüler hidrojel levhaların İnşaatı

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hidrojeller, bir in vivo benzeri üç boyutlu (3D), doku yapısının sağlanması için mikro-akışkan veya micropatterning teknolojileri kullanılarak mikro ölçekte desenli olabilir. Elde edilen 3D hidrojel-bazlı hücresel yapılar gelişmiş biyolojik çalışmalar, farmakolojik tahliller ve organ nakli uygulamaları için hayvan deneylerinde alternatif olarak sunulmuştur. Hidrojel-bazlı partiküller ve elyaflar, kolayca imal edilebilir, ancak, bu doku onarımı için bunları işlemek oldukça zordur. Bu videoda, biz kontrollü hücresel mikroçevresinin ile makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturmak için kendi montaj ile birlikte, micropatterned aljinat hidrojel sayfaları için bir fabrikasyon yöntem açıklanmaktadır. 200 um ve hassas micropatterns ile - kalsiyum jelleştirme maddesinin bir sis formu, ince hidrojel levha kolayca 100 aralığı içinde bir kalınlığa sahip olarak oluşturulur. Hücreler daha sonra hidrojel yaprak geometrik rehberlik ile kültüre edilebilirduran koşullar. Ayrıca, hidrojel levha hali hazırda bir uç kesim ucu ile bir mikropipet kullanılarak manipüle edilebilir ve desenli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kare kullanarak istifleme tarafından çok tabakalı yapılar halinde monte edilebilir. , Basit bir işlem kullanılarak imal edilebilir Bu modüler hidrojel levha, mikro ve makro ve doku yeniden üzerindeki fonksiyonel çalışmalarda da dahil olmak üzere in vitro ilaç deneylerinde ve biyolojik çalışmalar, potansiyel uygulamaya sahiptir.

Serbest duran hücresel hidrojel tabakalarının üretimi ve manipülasyonunu tanımladık. Şekil 1'de gösterildiği gibi, mikro desenli PDMS kalıplar ürettik ve hücre içeren hidrojeli bu kalıpların hidrofilik yüzeyine yükledik; ardından jelleştirici ajanın aerosolize bir sisi oluşturmak için bir nemlendirici kullanarak çapraz bağladık. Kalıplardan çıkarıldıktan sonra, HepG2 hücreleri çeşitli desenlere sahip serbest duran hidrojel tabakalarında kültüre edildi (Şekil 2</st...

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bu prosedürün genel amacı, 3D hücre kültürü sistemi için modüler hidrojel tabakaların basit üretimini, manipülasyonunu ve montajını göstermektir. Bu yöntem, kültürlenmiş mikro ortamlar ile in vivo benzeri daha fonksiyonel mühendislik dokularının nasıl oluşturulacağı gibi doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücresel hidrojel konstrüktların herhangi bir maliyet artışı olmaksızın üretilebilmesidir.3D hücre kültürü koşulları, her bir modüler hidrojel tabakaya bağlı olacaktır. Bu tekniğin etkileri, 3D hücresel mikro ve makro ortamların çeşitli geometrilerini ve bileşimlerini sağlayabilmesi nedeniyle, geliştirilmiş hücre tabanlı analizlere ve biyolojik çalışmalara kadar uzanmaktadır. Bu yöntem in vitro hücre tabanlı analizler hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, 3D doku modelinin nakledilebilir iskelesi gibi başka bir sisteme de uygulanabilir.Standart fotolitografi tekniklerini kullanarak istenen mikro ölçekli desenlerin üretilmesiyle başlayın. Bu videoda gösterilen örnekte, burada gösterilene benzer karaciğer lobül benzeri bir ağ deseni kullanılacaktır. Ardından, 2,5 gram PDMS ve 2,5 gram kürleme ajanı çözeltisi tartın ve bileşenleri iyice karıştırın.Çözeltiyi bir vakum odasında gazdan arındırın ve ardından karışım çözeltiyi, bir folyo döküm kabı içerisinde silikon gofretin mikro desenli yüzeyine eşit şekilde yayın. Daha sonra, kabı 65 °C'ye ısıtılmış bir plakanın düz yüzeyine 90 dakika boyunca yerleştirerek PDMS'yi kürleyin. Kürleme işlemi tamamlandığında, PDMS'yi döküm kabından çıkarın ve silikon gofretten dikkatlice soyun.PDMS'in kenarlarını kesin ve desenli kısmı, mikro desenli yüzey yukarı bakacak şekilde 100 mm çapında bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, ön sterilizasyon için mikro desenli PDMS'i önce %70 etanol, sonra distile su ile yıkayın. Sonrasında, düzeneği 65 °C'deki bir fırında 10 dakika boyunca tamamen kurutun.Ardından, hidrofilik bir yüzey oluşturmak için mikrodessetli PDMS kalıbı bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve bir dakika boyunca temizleyin. Bu işlem, sulu sıvıların yüklenmesini kolaylaştıracaktır. Daha sonra PDMS yüzeyini, Materyaller Tablosunda listelenen sürfaktan çözeltisinden 100 mililitre ile kaplayın.Numuneleri bir laboratuvar sarsıcısında en az üç saat inkübe edin. Ardından, PDMS kalıplardaki sürfaktan çözeltisini steril su kullanarak yıkayın ve bunları 65 °C'deki bir fırında 10 dakika boyunca tamamen kurutun. Daha sonra, her bir mikro desenli kalıbı 30 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakarak sterilize edin.Standart teknikleri kullanarak HepG2 hücrelerini kültürleyerek başlayın. Hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştığında, hücreleri bir kez PBS kullanarak yıkayın. Ardından, 1 mL %0,5 tripsin EDTA ekleyerek ve 37 °C'de dört dakika inkübe ederek hücreleri hasat edin.Hücreler ayrıldıktan sonra, bir santrifüj tüpüne toplayın ve 250 g'de üç dakika boyunca çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve ardından hücreleri bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak PBS içindeki tekil dağılmış hücre sayısını belirleyin.Ardından, hücreleri 250 g'de üç dakika boyunca tekrar pelletleyin. PBS süpernatantını uzaklaştırın ve hücrelere, nihai ekim yoğunluğu mililitre başına beş ile on milyon hücre arasında olacak şekilde yeterli miktarda yüzde bir sodyum aljinat çözeltisi ekleyin. Hücre çözeltisini bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın ve ardından hücre hidrojel süspansiyonunu 37 °C'de, yüzde beş CO2'li nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.Hücreler inkübe olurken, hidrofilik bir yüzey oluşturmak için mikrodesenli PDMS kalıpları bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve 85 watt gücünde bir dakika boyunca temizleyin. Hücre hidrojeli süspansiyonunu, pipetle nazikçe yukarı-aşağı çekerek karıştırın ve ardından kalıptaki mikrodesenin kenarına 7.2 microliters süspansiyonu istikrarlı bir şekilde yükleyin. Daha sonra, nemlendirici ile çapraz bağlayıcı reaktifi saatte 250 milliliters hızında sis şeklinde üreterek beş dakika boyunca hidrojel öncülünün üzerine püskürtün ve hücre hidrojeli süspansiyonunu jelleştirin.Bu prosedürün, PDMS kalıbın topografik yüzeyini beş santimetrelik bir aralıkta kapsadığından emin olun. Çapraz bağlanma işleminin ardından nemlendiriciyi kapatın ve PDMS kalıbı PBS ile doldurun. Sertleşmiş hidrojel tabakalarının her birini ayırmak için 200 µL'lik bir pipet kullanarak, hidrojellerin kenarlarına nazikçe PBS ekleyin.Ardından, ucu kesilmiş 1.000 µL'lik bir pipet ucu kullanarak yüzen her bir hidrojel tabakasını alın. Her bir hidrojel tabakasını, yüzeyde yüzmelerini sağlamak amacıyla, bir mL önceden ısıtılmış DMEM içeren 12 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Hücreleri, kültür ortamını gün aşırı değiştirerek bir hafta boyunca bu şekilde kültüre edin.Ardından, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere alt yüzeyinde 170 µm yüksekliğinde sütun yapıları içeren bir PDMS çerçeve hazırlayın. Fabrikasyon sırasında, sekiz mm genişliğinde, dokuz mm yüksekliğinde ve iki mm derinliğinde bir iç çerçeve oluşturmak için silikon gofret üzerine PDMS çerçeve için özelleştirilmiş bir polikarbonat kalıp yerleştirin. Sterilize edildikten sonra, PDMS çerçeveyi 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirilmiş naylon filtre kağıdı parçasının dörtte birinin üzerine yerleştirin.Hidrojel tabakaları inkübatörden çıkarın ve modüler hidrojel tabakalarının ilkini, ucu kesilmiş 1.000 µL pipet ucu kullanarak PDMS çerçevenin içine aktarın. Modüler hidrojel tabakasının kenarını, boş bir 200 µL pipet ucu yardımıyla PDMS çerçeve ile hizalayın. Dört ila altı tabakalı bir yığın elde edilene kadar bu işlemi diğer hidrojel tabakalarıyla tekrarlayın.Ardından, kültür ortamını PDMS çerçevenin altındaki sütun yapıları üzerinden akıtarak uzaklaştırın. Daha sonra, çok katmanlı yapının bir köşesine iki mikrolitre yüzde iki'lik alginat çözeltisi ekleyin. Bir nemlendirici kullanarak, her katmanın kenarlarını birbirine tutturmak için çok katmanlı yapıya otuz saniye boyunca saatte 250 mililitre hızla çapraz bağlayıcı reaktif sisi püskürtün.Ardından, çok katmanlı yapıyı 400 µL DMEM ile nazikçe durulayın ve PDMS çerçeveyi bir cımbız yardımıyla çıkarın. Daha sonra, dört mL daha DMEM ekleyin. Çok katmanlı yapıyı, bir hücre kaldırma aparatı (cell lifter) ile nazikçe silerek filtre kağıdından ayırın ve ardından üç mL DMEM içeren altı kuyucuklu bir plakaya aktarmak için filtre kağıdı kullanın.Hücreleri, altı kuyucuklu plakada çok ölçekli bir hücresel iskele olarak hidrojel konstrükt ile yüzer durumda en az bir hafta boyunca kültüre edin. Kültür ortamını gün aşırı değiştirin. Burada, yeşil floresan yayan insan karaciğer karsinom hücrelerinin ve kırmızı floresan yayan NIH-3T3 fibroblastlarının birleştirilmiş bir ağ üzerinde birlikte ko-kültür edildiği, karaciğer lobülü benzeri mikro desenli hidrojel tabakaların katman katman montajı sonucu gösterilmektedir.Burada sunulan teknik kullanılarak, 100 ila 200 mikrometre mertebesinde ince bir hidrojel yapı formunda altıgen sütunlar, ince ağlar, tam diziler ve çoklu mikro tarak benzeri mikro fiberler dahil olmak üzere birçok desen varyasyonu oluşturulabilir. Bu yapılar, birçok farklı hücre tipi için zengin bir 3D kültür ortamı sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo benzeri 3D kültür sistemlerini aşağıdan yukarıya mühendislik yöntemleriyle oluşturmak için hücresel hidrojel tabakalarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

construction-modular-hydrogel-sheets-for-micropatterned-macro-scaled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Bu makalede sürekli sigara degrade statik suşlar doku mühendisliği için hücre hizalama düzenleyen konsantrik bir hücre yüklü hidrojel Tarih sağlamak için basit bir yaklaşım sunar.

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Üç boyutlu hücre kültürü uygulamaları için sentetik hidrojel matrislerinin ışık aracılı oluşumu ve ardından biyokimyasal modellemesi için sıralı bir süreci tanımlıyoruz. Hidrojellerin sitouyumlu fototıklama kimyası ile yapımı ve modifikasyonu gösterilmiştir. Ek olarak, bu hidrojeller içindeki kalıpları ölçmek ve gözlemlemek ve hücre canlılığını belirlemek için basit teknikler sunulmaktadır.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Bu rapor, biyolojik araştırmalar için mikroakışkan kanalları hücreler ve substratlarla doldurmak için düşük basınçlı vakum kullanan basit, uygulaması kolay bir tekniği açıklamaktadır.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Biz bir tekrarlanabilir model formasyonu elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde kontrol etmek için bir yordam mevcut. İki farklı hydrogels içeren bir küp aygıtı doku Desen oluşumu için çok yönlü görüntüleme elde etmek için istihdam edilmektedir.

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Tamamlayıcı reaktif gruplara sahip mikrojel çubuklar, sulu çözeltide birbirine bağlanma kabiliyetine sahip mikroakışkanlar yoluyla üretilir. Anizometrik mikrojeller, küresel tabanlı sistemlere kıyasla daha büyük gözeneklere sahip kararlı yapılara sıkışır ve birbirine bağlanır. GRGDS-PC ile modifiye edilmiş mikrojeller, hücre kültürü için kullanılabilecek makrogözenekli 3D yapılar oluşturur.

Mikrojel Çubuklardan Birbirine Bağlı Makrogözenekli 3D İskeleler

Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.

İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

Keşfedin modüler hidrojel levha üretimini ve 3D hücre kültürü sistemleri için montaj tekniklerini. Bu yöntem, doku mühendisliğinde kontrollü hücresel mikroortamlar oluşturarak fonksiyonel mühendislik dokuları geliştirmeye yardımcı olur.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Daha fazla video keşfet