Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Bu prosedürün genel amacı, bir 3D hücre kültürü sistemi için modüler hidrojel levhaların basit imalatını, manipülasyonunu ve montajını göstermektir. Bu yöntem, kültürlenmiş mikro ortamlarla daha fazla in vivo benzeri fonksiyonel mühendislik dokularının nasıl oluşturulacağı gibi doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücresel hidrojel yapılarının herhangi bir maliyetli artış olmadan üretilebilmesidir.

3D hücre kültürü koşulları, her bir modüler hidrojel tabakasına bağlı olacaktır. Bu tekniğin etkileri, geliştirilmiş hücre bazlı tahlillere ve biyolojik çalışmalara doğru uzanır, çünkü teknik, 3D hücresel mikro ve makro ortamların çeşitli geometrilerini ve bileşimini sağlayabilir. Bu yöntem, in vitro hücre bazlı tahliller hakkında fikir verebilse de, 3D doku modelinin nakledilebilir iskelesi gibi başka bir sisteme de uygulanabilir.

Standart fotolitografi tekniklerini kullanarak istenen mikro ölçekli desenleri üreterek başlayın. Bu videoda gösterilen örnek, burada gösterilene benzer bir karaciğer lobül benzeri ağ deseni kullanacaktır. Daha sonra 2,5 gram PDMS ve 2,5 gram sertleştirici solüsyonu tartın ve bileşenleri iyice karıştırın.

Çözeltiyi bir vakum odasında gazdan arındırın ve ardından karışık çözeltiyi bir folyo döküm kabı içinde silikon gofretin mikro desen yüzeyine eşit şekilde yayın. Ardından, çanağı 65 santigrat derece ısıtılmış bir plakanın düz yüzeyine 90 dakika boyunca yerleştirerek PDMS'yi sertleştirin. Sertleştikten sonra, PDMS'yi döküm kabından çıkarın ve silikon gofretten dikkatlice soyun.

PDMS'nin kenarlarını kesin ve desenli kısmı, mikro desen tarafı yukarı bakacak şekilde 100 milimetre çapında bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, birincil sterilizasyon için mikro desenli PDMS'yi %70 etanol ve ardından damıtılmış su ile yıkayın. Daha sonra, kurulumu 65 santigrat derecelik bir fırında 10 dakika boyunca tamamen kurutun.

Ardından, mikro desenli PDMS kalıbını bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve hidrofilik bir yüzey oluşturmak için bir dakika boyunca temizleyin. Bu, sulu sıvıların yüklenmesini kolaylaştıracaktır. Daha sonra PDMS'nin yüzeyini Malzeme Tablosunda listelenen 100 mililitre yüzey aktif madde çözeltisi ile kaplayın.

Numuneleri bir laboratuvar külbütöründe en az üç saat inkübe edin. Daha sonra, yüzey aktif madde çözeltisini PDMS kalıplarından steril su kullanarak yıkayın ve 65 santigrat derecede bir fırında 10 dakika boyunca tamamen kurutun. Ardından, her bir mikro desenli kalıbı 30 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakarak sterilize edin.

Standart teknikler kullanarak hepg2 hücrelerini kültürleyerek başlayın. Hücreler %70 ila %80 birleştiğinde, hücreleri PBS kullanarak bir kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri% 05 tripsin edta'nın bir milileter ekleyerek ve 37 santigrat derecede dört dakika inkübe ederek hasat edin.

Ayrıldıktan sonra, hücreleri bir santrifüj tüpünde toplayın ve üç dakika boyunca 250 g'da pelet haline getirin. Süpernatanı çıkarın ve ardından hücreleri bir milileter PBS'de yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak PBS'deki tek dağıtılmış hücrelerin sayısını sayın.

Ardından, hücreleri tekrar 250 g'da üç dakika boyunca peletleyin. PBS süpernatantını çıkarın ve hücrelere yeterince yüzde bir sodyum aljinat çözeltisi ekleyin, böylece nihai tohumlama yoğunluğu milileter başına beş ila on milyon hücre arasında olur. Hücre çözeltisini bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın ve ardından hücre hidrojel süspansiyonunu 37 santigrat derecede yüzde beş CO2 nemlendirilmiş inkübatörde inkübe edin.

Hücreler inkübe edilirken, mikro desenli PDMS kalıplarını bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve hidrofilik bir yüzey oluşturmak için 85 watt'ta bir dakika boyunca temizleyin. Hücre hidrojel süspansiyonunu hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından kalıptaki mikro desenin kenarına 7,2 mikrolitre süspansiyonu sabit bir şekilde yükleyin. Daha sonra, nemlendirici ile saatte 250 mililitre hızında çapraz bağlama reaktifinin bir sisini üreterek ve beş dakika boyunca hidrojel öncüsü üzerine püskürterek hücre hidrojel süspansiyonunu jelleştirin.

Bu prosedürün PDMS kalıbının topografik yüzeyini beş santimetrelik bir aralıkta kapladığından emin olun. Çapraz bağlama işleminin ardından nemlendiriciyi kapatın ve PDMS kalıbını PBS ile doldurun. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, hidrojellerin her birini ayırmak için PBS'yi sertleştirilmiş hidrojel tabakalarının kenarlarına nazikçe dağıtın.

Ardından, uçtan kesimli, 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak her bir yüzen hidrojel tabakasını alın. Hidrojelin her bir tabakasını, ortamın yüzeyinde yüzecek şekilde bir milileter önceden ısıtılmış DMEM içeren 12 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına aktarın. Hücreleri bir hafta boyunca bu şekilde kültürleyin, kültür ortamını her gün değiştirin.

Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi alt yüzeyde 170 mikron yüksekliğinde sütun yapıları içeren bir PDMS çerçevesi oluşturun. İmalat sırasında, sekiz milimetre genişliğinde, dokuz milimetre yüksekliğinde ve iki milimetre derinliğinde bir iç çerçeve oluşturmak için PDMS çerçevesi için silikon gofret üzerine özel bir polikarbonat kalıp yerleştirin. Sterilize edildikten sonra, PDMS çerçevesini 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirilmiş bir naylon filtre kağıdının dörtte birine yerleştirin.

Hidrojel tabakalarını inkübatörden çıkarın ve modüler hidrojel tabakaların ilkini, uçtan kesilmiş 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak PDMS çerçevesinin içine aktarın. Boş bir 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak modüler hidrojel tabakasının kenarını PDMS çerçevesiyle hizalayın. Dört ila altı katmandan oluşan bir yığın elde edilene kadar bu işlemi ek hidrojel tabakalarla tekrarlayın.

Ardından, kültür ortamını PDMS çerçevesinin altındaki sütun yapılarından geçirerek çıkarın. Ardından, çok katmanlı yapının bir köşesine yüzde iki aljinat çözeltisinden iki mikrolitre ekleyin. Bir nemlendirici kullanarak, her katmanın kenarlarını birbirine yapıştırmak için otuz saniye boyunca çok katmanlı yapıya saatte 250 militer hızında çapraz bağlama reaktifinin bir sisini püskürtün.

Ardından, çok katmanlı yapıyı 400 mikrolitre DMEM ile nazikçe durulayın ve bir cımbız kullanarak PDMS çerçevesini çıkarın. Ardından, dört mililitre daha DMEM ekleyin. Çok katmanlı yapıyı bir hücre kaldırıcı ile nazikçe silerek filtre kağıdı ile ayırın ve ardından üç mililitre DMEM içeren altı oyuklu bir plakaya aktarmak için filtre kağıdı kullanın.

Hücreleri, en az bir hafta boyunca altı oyuklu plakada çok ölçekli bir hücresel iskele olarak bir hidrojel yapısı ile yüzer bir şekilde kültürleyin. Kültür ortamını her gün değiştirin. Karaciğer lobül benzeri mikropörtlü hidrojel tabakalarının katman katman montajının sonucu, yeşil floresan insan karaciğer karsinomu hücrelerinin ve kırmızı floresan NIH-3T3 fibroblastlarının kombine bir ağ üzerinde ko-kültürde birlikte büyütüldüğü burada gösterilmektedir.

Burada sunulan tekniği kullanarak, altıgen sütunlar, ince ağlar, tüm diziler ve 100 ila 200 mikrometre mertebesinde ince bir hidrojel yapısı şeklinde çoklu mikro tarak benzeri mikrofiberler dahil olmak üzere birçok desen varyasyonu oluşturulabilir. Bu yapılar, birçok farklı hücre tipi için zengin bir 3D kültür ortamı sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, aşağıdan yukarıya doğru in vivo benzeri 3D kültür sistemlerinde mühendislik için hücresel hidrojel levhaların nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.