Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu
20 Ocak 2016
Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Bu protokol, belirli bir genomik bölge ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması için tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyonu (enChIP) gerçekleştirme prosedürlerini açıklar.
Bu prosedürün genel amacı, genomik bölge ile etkileşime giren moleküllerin tanımlanması için moleküler etkileşimleri koruyarak belirli bir genomik bölgeyi izole etmektir. Bu yöntem, transkripsiyon ve epigenetik düzenleme gibi genomik fonksiyon alanlarındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir genomik bölge ile etkileşime giren moleküllerin doğrudan tanımlanmasını sağlamasıdır.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yardımcı doçent olan Toshitsugu Fujita olacak. Metin protokolünü takiben, ilgilenilen DNA bağlayıcı molekülleri tasarlayın. Bu, ilgilenilen gBlock dizisinin oluşturulmasını ve örneğin üç FLAG-dCas9 ile komplekslenmiş kılavuz RNA'yı üretmek için bir retrovirüse yerleştirilmesini gerektirir.
Alternatif olarak, hedef diziyi tanıyan üç FLAG-TAL proteini üretilebilir. Daha sonra, metin protokolünü takiben, hazırlanan retrovirüs ile hücreleri enfekte edin. Tasarlanmış DNA bağlayıcı moleküllerin ekspresyonunu onaylayın ve hücre hattını oluşturun.
Şimdi, hücreleri formaldehit ile çapraz bağlayarak devam edin. 20 milyon transfekte edilmiş hücreyi 30 mililitre normal kültür ortamında askıya alın ve% 1'lik bir son konsantrasyon için 810 mikrolitre% 37 formaldehit ekleyinKarışımı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, 3.1 mililitre 1.25 molar glisin ekleyerek çapraz bağlama reaksiyonunu öldürün.
Devam etmeden önce hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Daha sonra, hücre tüpünü soğutmalı bir santrifüjde beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücre peletini karıştırarak ve santrifüjleyerek 30 mililitre PBS'de yıkayın.
İki PBS yıkaması gerçekleştirin. Gerekirse, sabit hücrelerin yıkanmış peleti eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Devam ederek, kromatini hücrelerden toplayın.
Onları 10 mililitre lizis tamponunda askıya alın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, soğutulmuş bir santrifüj kullanarak, hücreleri toplayın ve süpernatanı dikkatlice atın. Şimdi, hücre peletini nükleer lizis tamponunda askıya alın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Kuluçka sırasında her birkaç dakikada bir, karışımı kısaca girdaplayın. Yine, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Şimdi, peleti 10 mililitre PBS ile yıkayın ve yıkama solüsyonunu başka bir santrifüjle çıkarın.
Bu, kromatin fraksiyonunu üretir ve istenirse flaş dondurulabilir ve eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Kromatin peletini 800 mikrolitre modifiye lizis tamponu üç içinde askıya alarak devam edin ve süspansiyonu daha küçük bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Şimdi, sürekli görev ile üçüncü seviye güçte bir sonikasyon probunu çalıştırın.
Kromatini parçalamak için, 10 saniye sonikasyon ile buz üzerinde 20 saniye arasında manuel olarak geçiş yapın. Her 5. veya 6. döngüde, numunenin aşırı ısınmaması için buz fazını iki dakikaya uzatın. Bu sonikasyon döngüsünü 10 ila 18 kez gerçekleştirin, numunenin köpürmesini önlemek için probun ucunu tüpün altından uzak tutun.
Sonikasyondan sonra, numuneyi hızlı bir soğutmalı santrifüjleme ile toplayın. Ardından, parçalanmış kromatini içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Parçalanmanın nasıl değerlendirileceğine ilişkin metin protokolüne bakın.
İmmünopresipitasyona hazırlanmak için önce antikorları Dynabeads ile konjuge edin. Bu immünopresipitasyon, 20 milyon hücreden türetilen örneklere ölçeklendirilir. % 1 Triton'luk bir nihai konsantrasyon elde etmek için parçalanmış kromatine Triton X-100 ile 1/5 hacim modifiye lizis tamponu üç ekleyin.
Daha sonra, karışımı normal fare IgG'ye konjuge edilmiş manyetik boncuklara ekleyin. Reaksiyonu soğutmalı bir döndürücü üzerinde bir saat inkübe edin. Daha sonra, boncukları bir mıknatıs standı üzerinde üç dakika boyunca çözeltiden çekin.
Ardından, süpernatanı toplayın. Süpernatanı, anti-FLAG antikorlarına konjuge edilmiş manyetik boncuk tüpüne aktarın. Bu konjugasyon reaksiyonunu gece boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde çalıştırın.
Ertesi sabah, boncukları toplamak için tüpe üç dakika boyunca bir mıknatıs uygulayın. Ardından, süpernatanı pipetleyin ve atın. Şimdi boncukları yıka.
Onları bir mililitre düşük tuzlu tamponda askıya alın ve dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde beş dakika inkübe edin. Kuluçkayı takiben, boncukların manyetizasyonunu izole edin ve süpernatanı atın. Bu yıkama adımını düşük tuzlu tampon ile bir kez daha tekrarlayın.
Aynı tekniği kullanarak, yüksek tuz tamponu kullanarak iki yıkama daha yapın. Boncukları lityum klorür tamponunda iki kez yıkamak için yöntemi kullanmaya devam edin. Son olarak, boncukları TBS-IGEPAL CA-630 ile sadece bir kez yıkayın.
Yedi yıkama adımından sonra, boncukları 200 mikrolitre elüsyon tamponunda askıya alın ve 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Ardından, boncukları manyetize ederek çekin ve süpernatanı yeni bir tüpe toplayın. Verimi artırmak için bu elüsyon adımını tekrarlayın.
Ardından, verimi tahmin etmek için DNA'nın yaklaşık% 5'ini saflaştırın. Elüatın büyük kısmını bir çökeltme reaksiyonuna karıştırarak başlayın. Kromatini gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökeltin.
Ertesi gün, numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti mililitre% 70 etanol ile durulayın ve santrifüjlemeyi 10 dakika boyunca tekrarlayın. Ardından, süpernatanı atın ve peleti 40 mikrolitre 2x numune tamponunda askıya alın.
Şimdi, süspansiyonu tam beş dakika boyunca girdaplayın. Ardından, çapraz bağlanmayı denatüre etmek ve tersine çevirmek için 100 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kaynattıktan sonra, 40 mikrolitre numuneyi bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın.
Genellikle dört ila %20'lik bir gradyan kullanılır. Boya kuyunun bir santimetre altına geçene kadar jeli çalıştırın. Ardından, jeli boyayın ve yaklaşık 2 milimetre uzunluğunda beş parçaya kesin.
Proteini jel parçalarından seyreltin ve kütle spesifikasyon analizi için kullanın. RNA'nın saflaştırılması ve ardından dizileme analizi, metin protokolünde ele alınmaktadır. Genel olarak, hedef genomik bölgelerin %10'a kadarı enChIP kullanılarak saflaştırılabilir.
Burada, spesifik olmayan Sox2 lokusu ile karşılaştırıldığında IRF-1 geninin promotör bölgesini hedef alan analizlerin sonuçları görülmektedir. Başka bir örnek, spesifik olmayan gama-uydu lokusuna karşı hedefleme telomerleridir. enChIP SILAC, interferon gama spesifik bir şekilde IRF-1 promotörü ile ilişkili birkaç proteini tanımladı.
Telomer bağlayıcı proteinler ayrıca kütle spektrometresi ile birleştirilmiş enChIP ile tanımlandı. enChIP RNA dizilimi daha sonra telomerlerle ilişkili RNA'ları tanımlamak için kullanıldı. Geliştirildikten sonra bu teknik, transkripsiyon ve epigenetik düzenleme alanlarındaki araştırmacıların çeşitli biyolojik sistemlerde bu tür mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.
Genel Bakış
Bu protokol, spesifik genomik bölgelere ilişkin proteinleri ve RNA'ları tanımlamak için mühendislik DNA-bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünoçökeltme (enChIP) tekniğini özetlemektedir. Genomik fonksiyonları anlamak için gerekli moleküler etkileşimlerin izole edilmesi için detaylı bir metodoloji sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genomik
- Epigenetik
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Genomik bölgelerdeki moleküler etkileşimleri anlamak, düzenleyici mekanizmaları açıklamak için gereklidir.
- enChIP, belirli genomik alanlarla etkileşime giren moleküllerin doğrudan tanımlanmasına olanak tanır.
- Bu yöntem, transkripsiyon ve epigenetik düzenleme çalışmalarında uygulanabilir.
- Kompleks genomik fonksiyonları inceleme yeteneğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Belirli genomik bölgeleri izole etmek ve etkileşime giren molekülleri tanımlamak.
- Transkripsiyonel ve epigenetik düzenlemeyi incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- enChIP tekniğini etkili bir şekilde göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- gBlock dizileri ve retrovirüsler kullanarak DNA-bağlayıcı moleküllerin mühendisliği.
- Hücrelerin çapraz bağlanması ve kromatin izole edilmesi.
- Soniasyon yoluyla kromatin parçalanması.
- Konjuge antikorlarla immünoçökeltme gerçekleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Transfekte edilmiş hücrelerden kromatinin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Belirli genomik bölgelere ilişkin proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması.
- enChIP kullanılarak hedef genomik bölgelerin etkili bir şekilde saflaştırılmasının gösterilmesi.
- Kitle spektrometri analizi yoluyla verim tahmini.
Sonuçlar
- enChIP, spesifik genomik sitelerdeki moleküler etkileşimleri incelemek için güçlü bir araçtır.
- Yöntem, transkripsiyonel ve epigenetik düzenleme hakkında bilgiler sağlar.
- Genomik araştırmalarda çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
enChIP enables direct, unbiased identification of proteins and RNAs interacting with specific genomic regions, supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach enhances predictive confidence by linking genomic loci to functional molecular interactions in transcription and epigenetic regulation. It provides a scalable method for early discovery biology to inform portfolio triage and reduce late-stage biological risk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying direct molecular interactors of genomic regions of interest.
- Operational Value: Enables functional target validation through unbiased proteomic and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying pathway context and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromatin inputs for downstream molecular interaction screening.
- Operational Value: Standardizes isolation of specific genomic regions with quantifiable yield (up to 10% purification efficiency).
- Scalability: Supports platform reuse across loci (e.g., promoters, telomeres) using TAL or CRISPR-dCas9 engineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage genomic findings to disease-relevant mechanisms via associated molecule identification.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned follow-up through mass spectrometry or RNA sequencing of isolated complexes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical target prioritization by revealing context-specific interactors (e.g., interferon gamma-specific IRF-1 associations).
Pipeline & Workflow Integration
enChIP fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing molecular interaction data that bridges genomic annotation and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating genomic regions while preserving native molecular interactions.
- Screening: Generates assay-ready chromatin fractions for interaction profiling with chemical or genetic perturbations.
- Analytics: Enables quantitative comparison of associated molecules across conditions via mass spec or RNA-seq readouts.
- Translational Research: Connects genomic loci to phenotypic mechanisms through identified proteins and RNAs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for locus-specific interactome mapping across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genomic function studies through direct interactor identification.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized isolation of tagged genomic regions using antibody-based immunoprecipitation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target mechanism early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on molecular context of genomic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to engineer TAL or gBlock-CRISPR DNA-binding molecules.
- Needs access to sonication equipment, magnetic separation tools, and downstream analytics (mass spec, RNA-seq).
- Demands cross-team standardization for epitope tagging (e.g., FLAG) and antibody conjugation workflows.
- Must account for chromatin accessibility and epitope efficiency across diverse genomic regions and cell types.
- Practical limitation: Efficiency depends on successful tagging and expression of engineered DNA-binding molecules in target cells.
