Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, genomik bölgeyle etkileşime giren moleküllerin tanımlanması için moleküler etkileşimleri koruyarak belirli bir genomik bölgeyi izole etmektir. Bu yöntem, transkripsiyon ve epigenetik düzenleme gibi genomik fonksiyonlar alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir genomik bölgeyle etkileşime giren moleküllerin doğrudan tanımlanmasına olanak tanımasıdır.

Prosedürü, laboratuvarımdan yardımcı doçent Toshitsugu Fujita uygulamalı olarak gösterecek. Yazılı protokolle paralel şekilde, ilgili DNA bağlayıcı molekülleri tasarlayın. Bu işlem, ilgili gBlock dizisinin oluşturulmasını ve örneğin, üç FLAG-dCas9 ile komplekslenmiş rehber RNA üretmek için bunun bir retrovirüse yerleştirilmesini kapsar.

Alternatif olarak, hedef diziyi tanıyan üç adet FLAG-TAL proteini üretilebilir. Ardından, metin protokolünü takip ederek hücreleri hazırlanan retrovirüs ile enfekte edin. Mühendislik ürünü DNA bağlayıcı moleküllerin ekspresyonunu doğrulayın ve hücre hattını oluşturun.

Şimdi, hücreleri formaldehit ile çapraz bağlayarak devam edin. 20 milyon transfekte hücreyi 30 mililitre standart kültür ortamında süspande edin ve son konsantrasyon %1 olacak şekilde 810 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin. Karışımı 37 derece Celsius'da beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika sonra, 3,1 mililitre 1,25 molar glisin ekleyerek çapraz bağlama reaksiyonunu durdurun.

Devam etmeden önce hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Ardından, hücre tüpünü soğutmalı bir santrifüjde 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve hücre peletini, karıştırarak ve santrifüjleyerek 30 mililitre PBS ile yıkayın.

İki kez PBS ile yıkama işlemi gerçekleştirin. Gerektiğinde, fikse edilmiş hücrelerin yıkanmış peleti -80 °C'de saklanabilir. Devamında, hücrelerden kromatini toplayın.

Bunları 10 mililitre lizis tamponunda süspande edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından, soğutmalı bir santrifüj kullanarak hücreleri toplayın ve süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Şimdi, hücre peletini nükleer lizis tamponunda süspande edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyon sırasında birkaç dakikada bir karışımı kısa süreliğine vorteksleyin. Hücreleri tekrar santrifüjle toplayın. Şimdi, peleti 10 milliliters PBS ile yıkayın ve yıkama solüsyonunu başka bir santrifüj işlemiyle uzaklaştırın.

Bu işlem kromatin fraksiyonunu oluşturur ve istenirse şok dondurularak -80 °C'de saklanabilir. Kromatin peletini 800 µL modifiye lizis tamponu 3 içerisinde süspanse ederek işleme devam edin ve süspansiyonu daha küçük bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın. Şimdi, bir sonikasyon probunu seviye üç güçte ve sürekli çalışma modunda çalıştırın.

Kromatini fragmente etmek için, 10 saniyelik sonikasyon ve 20 saniyelik buz üzerinde bekletme işlemlerini manuel olarak döngüsel şekilde uygulayın. Numunenin aşırı ısınmasını önlemek için her 5. veya 6. döngüde buz aşamasını iki dakikaya uzatın. Numunenin köpürmesini önlemek için prob ucunu tüpün tabanına değdirmeden, bu sonikasyon döngüsünü 10 ila 18 kez tekrarlayın.

Sonikasyonun ardından, örneği hızlı soğutmalı santrifüj ile toplayın. Daha sonra, fragmente kromatin içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve pellet kısmını atın. Fragmantasyonun nasıl değerlendirileceği ile ilgili metin protokolüne bakınız.

İmmünopresipitasyona hazırlanmak için öncelikle antikorları Dynabeads ile konjuge edin. Bu immünopresipitasyon, 20 milyon hücreden elde edilen örneklere göre ölçeklendirilmiştir. Fragmente edilmiş kromatine, son konsantrasyon %1 Triton olacak şekilde, Triton X-100 içeren modifiye liz tamponu üç'ten 1/5 hacminde ekleyin.

Ardından, karışımı normal fare IgG ile konjuge edilmiş manyetik boncuklara ekleyin. Reaksiyonu, soğutmalı bir rotatör üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, boncukları bir mıknatıs standı üzerinde üç dakika boyunca çözeltiden ayırarak toplayın.

Ardından, süpernatanı toplayın. Süpernatanı anti-FLAG antikorları ile konjuge edilmiş manyetik boncukların bulunduğu tüpe aktarın. Bu konjugasyon reaksiyonunu, bir rotatör üzerinde dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca sürdürün.

Ertesi sabah, boncukları toplamak için tüpe üç dakika boyunca bir mıknatıs uygulayın. Ardından, süpernatanı pipetle çekip atın. Şimdi, boncukları yıkayın.

Bunları bir mililitre düşük tuzlu tampon çözeltide süspanse edin ve dört santigrat derecede bir rotatör üzerinde beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, boncukları mıknatıslama yoluyla izole edin ve süpernatanı atın. Bu yıkama adımını düşük tuzlu tampon çözelti ile bir kez daha tekrarlayın.

Aynı tekniği kullanarak, yüksek tuzlu tampon ile iki yıkama daha gerçekleştirin. Boncukları lityum klorür tamponu ile iki kez yıkamak için yöntemi uygulamaya devam edin. Son olarak, boncukları sadece bir kez TBS-IGEPAL CA-630 ile yıkayın.

Yedi yıkama adımından sonra, boncukları 200 µL elüsyon tamponunda süspande edin ve 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. Ardından, boncukları mıknatıslama yoluyla çekin ve süpernatantı yeni bir tüpe toplayın. Verimi artırmak için bu elüsyon adımını tekrarlayın.

Ardından, verimi tahmin etmek için DNA'nın yaklaşık %5'ini saflaştırın. Elüatın büyük kısmını bir çöktürme reaksiyonuyla karıştırarak başlayın. Kromatini -20 °C'de gece boyunca çöktürün.

Ertesi gün, örneği santrifüj edin ve süpernatanı atın. Peleti 1 ml %70 etanol ile yıkayın ve santrifüj işlemini 10 dakika boyunca tekrarlayın. Ardından, süpernatanı atın ve peleti 40 µL 2x örnek tamponu içinde süspanse edin.

Şimdi, süspansiyonu tam beş dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, çapraz bağlamayı geri çevirmek ve denatüre etmek için 100 °C'de 30 dakika inkübe edin. Kaynatma işleminden sonra, örneğin 40 µL'sini bir SDS-PAGE jelinde yürütün.

Genellikle %4 ila %20'lik bir gradyan kullanılır. Boya, kuyucuğun 1 cm altına inene kadar jeli çalıştırın. Ardından jeli boyayın ve yaklaşık 2 mm uzunluğunda beş parçaya bölün.

Jel parçalarındaki proteini seyreltin ve kütle spektrometrisi analizi için kullanın. RNA saflaştırması ve ardından yapılan sekanslama analizi, metin protokolünde ele alınmıştır. Genel olarak, enChIP kullanılarak hedef genomik bölgelerin %10'una kadarı saflaştırılabilir.

Burada, non-spesifik Sox2 lokusu ile karşılaştırıldığında IRF-1 geni promoter bölgesini hedefleyen analizlerin verimleri görülmektedir. Bir diğer örnek ise telomerlerin, non-spesifik gamma-uydu lokusuna karşı hedeflenmesidir. enChIP SILAC, interferon gamma-spesifik bir biçimde IRF-1 promoteri ile ilişkili birkaç protein tanımlamıştır.

Telomer bağlayıcı proteinler ayrıca kütle spektrometrisi ile kombine edilmiş enChIP yöntemiyle tanımlanmıştır. Ardından, telomerlerle ilişkili RNA'ları belirlemek için enChIP RNA dizileme kullanılmıştır. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, transkripsiyon ve epigenetik regülasyon alanlarındaki araştırmacıların, çeşitli biyolojik sistemlerde bu tür mekanizmaları incelemelerinin önünü açmıştır.