Name: İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin yarı otomatik antikor kokteyli hazırlama yöntemiyle insan periferik kan immünfenotipik analizi için güvenilir sonuçlar elde etmeyi. Bu teknik, reagent dağıtımındaki değişkenliği azaltarak immünoloji araştırmalarında tutarlılığı artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sistem tasarımı ve konfigürasyonu konusundaki yardımları için Hannah Puzas'a ve teknik tavsiyeleri için Kevin Khovananth'a teşekkür ederiz. Bu çalışmanın finansmanı The Hearst Foundations ve Providence Portland Medical Foundation tarafından sağlandı.

<ol><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Craig, F. E., Foon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+for+hematologic+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms.</a> Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).</li>
<li>Johansson, U., Bloxham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+the+use+of+multicolour+flow+cytometry+in+the+diagnosis+of+haematological+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms.</a> Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).</li>
<li>Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TruCount+Absolute-Count+Tubes+for+Determining+CD4+and+CD8+Cell+Numbers+in+Human+Immunodeficiency+Virus-Positive+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults.</a> Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).</li>
<li>Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%2C+immunology%2C+and+HIV+infection%3A+Three+decades+of+strong+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions.</a> Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).</li>
<li>Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Major+Peripheral+Blood+Leukocyte+Populations+for+Multicenter+Clinical+Trials+Using+a+Whole+Blood+Phenotyping+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay.</a> J. Vis. Exp. (67), e4302(2012).</li>
<li>Streitz, M., Miloud, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+whole+blood+immune+phenotype+monitoring+for+clinical+trials%3A+panels+and+methods+from+the+ONE+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Res%22%5BJournal%5D)">Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study.</a> Transplant. Res. 2 (1), 17(2013).</li>
<li>Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+whole+blood+phenotyping+assay+for+enumeration+of+peripheral+blood+leukocyte+populations+in+multicenter+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials.</a> J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).</li>
<li>Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+I+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).</li>
<li>O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+II+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).</li>
<li>Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+quality+control+of+immunophenotyping+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).</li>
<li>Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+for+flow+cytometric+immunophenotyping%3A+a+report+from+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases%2C+Division+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS.</a> Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).</li>
<li>Biancotto, A., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+human+immunome%3A+the+complexity+of+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).</li>
<li>Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+costimulation+in+antibody+deficiencies%3A+ICOS+and+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency.</a> Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).</li>
<li>Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare-Event+Analysis+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Med%22%5BJournal%5D)">Rare-Event Analysis in Flow Cytometry.</a> Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).</li>
<li>Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dimensional+flow+cytometry+for+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping+%28CLIP%29+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).</li>
<li>Villanova, F., Di Meglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Lyoplate+Based+Flow+Cytometry+and+Computational+Analysis+for+Standardized+Immunological+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery.</a> PloS One. 8 (7), e65485(2013).</li>
<li>BD biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Optimizing+Experiments+Using+BD+Horizon+Brilliant+Polymer+Conjugates%22">Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates</a>. , (2014).</li>
<li>Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+a+Phospho-STAT5+Staining+Procedure+for+Flow+Cytometry+for+Application+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery.</a> J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).</li>
<li>Hasan, M., Beitz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+and+standardized+cytometric+procedures+for+multi-panel+and+multi-parametric+wholeblood+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping.</a> Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+harmonizing+flow+cytometry+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+immunol%22%5BJournal%5D)">A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials.</a> Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).</li>
</ol>

YK, ILG, TLM, WLM, DPH ve KSB: Hayır rakip mali çıkarları. ANT Beckman Coulter bir çalışanı, bu video makalenin A.Ş. Yayın Beckman Coulter, Inc. tarafından desteklenmektedir

Periferik kan İmmünofenotipleme immünoterapi bireysel tepkiler içgörüler kazanmak için büyük önem taşımaktadır. Meydan deneme-to-deney değişkenlik 1,14 kontrol etmek için deney standardizasyonu yatıyor. değişkenlik bir ana kaynağı örnekleri arasında insan manipülasyonu yatmaktadır. Nedenle, örnek işleme kısmi veya tam otomasyon deneme-to-denemede değişkenliği 1,14 dramatik bir azalma kolaylaştıracak düşünülebilir. Bu protokol, biz tam kan immünofenotiplendirme örnek boyama 2D barkod okuyucu ile donatılmış otomatik bir sıvı işleyici getirerek tahlil değişkenliği en aza indirmek için başarılı bir çaba rapor. tasarımda, bizim yöntem çok yönlüdür ve onları tanımlamak için ek &quot;Baz kokteyli&quot; ekleyerek diğer bağışıklık altkümelerini izleyebilirsiniz. Bu alt-gruplar T yardımcı hücreleri, regülatör T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri, dendritik hücreler ve monositler (el yazması dahilHazırlık) 18. Biz ek işaretçileri 1 tanıtarak konsorsiyumun tavsiye edilen antikor paneller uyarlanmış. Biz uyarılabilir antijenlerin tespiti için bu kanalları ayırmak istediği gibi hücre popülasyonları, dedektörleri parlak mor 421 (BV421) içine en az emisyonla fluorochromes konjuge &quot;Baz Kokteyl&quot;, fikoeritrin (PE) kullanılarak tespit ve allofikosiyanin (APC) bulundu. Bu özellik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu durumunu izlemek için yüksek duyarlılık sağlayan, ancak, aynı zamanda, bu üç fluorochromes en sık olarak uyarılabilir belirteçleri karşı antikorlar ile eşlenik olarak yeni bir aktivasyon işaretleme maddelerinin esnek konaklama sağlar sadece. Bu nedenle, yöntem, sadece tam kan immünofenotiplendirme kokteyl hazırlanması için uygun olan, fakat, aynı zamanda tasnif edilmiş dokular (örneğin, tümör) elde periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ve hücreler de dahil olmak üzere, diğer örnekleri boyama için kullanışlıdır. başarılı introBizim yöntemin duction özel laboratuvar hazırlık adımlara dikkat ve programlama ve yöntemin uygulanmasını gerektirir. 2D barkod tüplerin hazırlanması insan tarafından okunabilir etiket ve belirlenen tüplere antikorların aktarılması ile etiketleme içerir. hataların girişini önlemek için, biz iki kişi ile bunu tavsiye ederiz. elektronik tablolar değiştirirken, araştırmacılar yöntemi düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmelidir. programlama sırasında uygun pipetleme yöntemleri seçme başarılı sıvı aktarımı sağlar. LLS biz P50 veya P200 iletken ipuçları birini kullanın hangi antikor tüpleri, altından çöktürülmüş enkaz almadan pipetleme sağlar. LLS P1000 ipuçları ile daha hassas ve bazen yanlış kabarcıklarının varlığı ile tetiklenen olarak LLS P1000 ipuçları için iyi bir seçenek olmayabilir. ipuçları kenarı arasında yeterli boşluk yoksa laboratuvar tanımı Heights, örneğin, olduğu gibi optimal sıvı transferi meydana gelebilir her araç için ayarlanabilir olmalıdırve tüplerin alt. Şekil 12&#39;de gösterildiği gibi, &quot;Base kokteyl&quot; ve / veya &quot;Aktivasyon kokteyl&quot; İyice vortekslendi takdirde, bu optimal lekelenme neden olabilir. Biz reaktif 19 dağıtım ile ilgili değişkenliği azaltmak için alternatif bir yaklaşım olarak hücre boyama Liyofilize reaktifler kullanılarak düşündüm. Bununla birlikte, parlak mor boyalar polimer konjugeleri birbirlerine neden spesifik olmayan sinyal ile etkileşim için bilinmektedir. Bu şekilde, liyofilize edilmiş reaktifler fazla iki polimer konjügatları (örneğin, BV421 ve BV650 gibi) spesifik olmayan sinyal neden olabilir eklenmesi (örneğin, BV421 + popülasyonda BV650 plan sinyalinin artış) 20. Ayrıca, liyofilize reaktifler, yeni boyama dahil olmak üzere esnekliği eksikliği. Genellikle daha pahalıdır ve bir toplu sipariş gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, 2D barkod tüpleri ile donatılmış otomatik sıvı işleyici kullanmayı seçti. o t rağmenakes zaman kurmak ve bu faktörlerin verimlilik artışı ve testlerin tekrarlanabilirliği ile telafi edilecektir uzun vadede, enstrüman satın almak için bir ön yatırım gerektirir için. Aslında, bir kaç gruplar önceden immünofenotiplendirme veya benzeri uygulamalar 21,22 onların iş akışı içine otomatik sıvı işleyici başarılı entegrasyon bildirdi. flow sitometri analizi için otomatik çözümler de ticari kaynaklardan (FACS SPA III, Otomatik Kokteyl Hazırlama İstasyonu ve FlowStainer) edinilebilir. Bu da immünofenotiplendirme için otomatik bir kokteyl hazırlanması için büyük bir ihtiyaç olduğunu gösteriyor. Bu tekniği mastering sonra, biz tam otomatik tam kan immunfenotiplemenin gelişimi, deneme-to-denemede değişkenliği azaltacak ve hatta 23 ayar çok merkezli klinik çalışmada tam kan immünofenotipleme mümkün hale olabilir öngörülüyor. Biz zaten bir lize oldu kullanmaya başladıh yardımcısı parçalama ve yıkama adımlarını otomatikleştirmek için. Biz de 2D barkod tüpleri antikor hacmi ve reaktif dağıtımın izleme otomatik tespiti büyük ölçüde sırasıyla antikorların envanter ve bizim yöntemi üzerinde kalite kontrol artıracağını öngörülüyor.

İnsan periferik kan İmmünofenotipleme immün hücre alt 1 nicel ve nitel değişiklikleri tespit eder. Bu eylem ve direniş, öngörü biyomarkırların yardımcıları keşif mekanizmaları içgörü sağlar ve kombinasyon immünoterapilerin gelişimini kolaylaştırır. Bu nedenle, immunfenotiplemenin doğrulama ve standardizasyon akademik araştırmacılar, klinik laboratuarlar ve sanayilere önemli bir ilgi alanıdır. Akış sitometrik yöntemlerle periferik kan immünofenotipleme şu anda hematolojik malignitelerde 2,3 ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu 4,5, immünoterapi talepleri için periferik kan güvenilir immünofenotiplendirme çünkü o doğrulama ve standardizasyon belirli düşüncelerin klinik yönetimi için kullanılmasına rağmen bağışıklık hücre alt grupları ve aktivasyon / inhibitör reseptörleri 1,6-8 üzerinde daha geniş kapsama alanı gerektirir. successful immünofenotiplendirme enstrüman kurulum ve hücre boyama işlemi 9,10 ilgili deney-to-deney değişkenliği en aza indirmek için dikkatli standardizasyon gerektirir. Flow sitometri için cihaz ayarlarının standardizasyon iyi eski endişe 9,11,12 adresine yerleşmiş olmakla birlikte, bağışıklık hücre alt ve aktivasyon durumu kapsama kısıtlamadan hücre boyama ile ilgili değişkenliği en aza indirmek için nasıl belirsizliğini korumaktadır. antijenlerin sayısı artar tespit edilecek, bu nedenle de hata ve değişkenlik optimal reaktif dağıtılması ve çapraz kontaminasyon nedeniyle fırsatı yok. antikoagüle tam kan phenoptypic analiz yöntemleri klinik laboratuar deneylerinde kullanım için 1980&#39;lerin sonunda tespit edilmiştir. Bu aynı yöntemler numune hazırlama için araştırma laboratuarında ihtiyaçlarına hizmet. Önemlisi, klinik laboratuvarda kullanılan antikor kokteyller tipik az karmaşık ve ava vardırilable önceden titre edilmiş ve üretici önceden karıştırılmış. önceden karıştırılmış antikor kokteylinin sadece tek bir transfer gereklidir. araştırma ortamında, 10-16 antikorların antikor kokteyller tipiktir. Her kokteyl laboratuar tarafından istikrar için onaylanmış veya her bir deneyde önce taze hazırlanmış olmalıdır. Bir örnek için birden fazla antikor kokteyller hazırlamak 50-80 bireysel antikorların pipetlenmesini, sıkıcı ve hata eğilimli hem bir görev gelmesine yol açabilir. kokteyl hazırlama Otomasyon gibi daha az hata olarak manuel kokteyl hazırlama üzerinde birçok avantajı vardır, pipetleme doğruluğu artmış, ve hatta reaktif israfını azalmıştır. Burada, Numune Hazırlama ile ilgili değişkenliği en aza indirmek için immunfenotiplemenin hücre boyama işlemi bir iki boyutlu (2D) barkod okuyucu ile donatılmış bir otomatik sıvı işleyici başarılı bir giriş sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>Akış sitometresi</td><td></td></tr><tr><td>NXp Span-8 Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonu&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31839</td><td>Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Insert, Tüp, 11 mm, Beyaz, 1,5 ml Mikrofüj Tüpleri için (25'li kutu)</td><td>Beckman Coulter</td><td>373696</td><td>Mikrofüj tüplerini yerleştirmek için 24 Konumlu Tüp Rafı için Aksesuar.</td></tr><tr><td>LLS kiti</td><td>Beckman Coulter</td><td>719262</td><td>Sıvı seviyesi algılamayı etkinleştirmek için güvertenin altını Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonuna takın</td></tr><tr><td>24 Konumlu Tüp Rafı</td><td>Beckman Coulter</td><td>373661</td><td>Antikor kokteylleri veya kan için mikrofüj tüplerini tutmak için tüp rafı</td></tr><tr><td>BIOHAZARD OTOKLAV TORBALARI 12 x 24 İNÇ KIRMIZI</td><td>LabMart</td><td>M111416</td><td>Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonu</td></tr> <tr><td>için tek kullanımlık otoklav torbalarıVisionMate Yüksek Hızlı 2D Barkod Okuyucu</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1850</td><td>2D barkod okuyucu</td></tr><tr><td>8 Kanallı El Vidalı Kapaklı Kapak/Decapper</td><td>Thermo Scientific</td><td>4105MAT</td><td>2D barkod tüplerinin kapağını açmak ve kapatmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-335</td><td>Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonunda kokteyl yapmak veya kan örneği almak için CoolRack</td></tr><tr><td>XT CFT24</td><td>biyozyon</td><td>BCS-534</td><td>Numune tüplerini tutmak için.</td></tr><tr><td>1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tüpler Mandal Raflarında</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741AMB</td><td>Floresan boya kojuge antikorları depolamak için 2D barkod tüpleri</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P1000 Uçlar, İletken, Bariyerli Pre-steril, 1.025 ve mikro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>987925</td><td>Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonu için İpuçları&nbsp;</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P50 Uçlar, İletken, Bariyerli Pre-steril, 50 & l (10 raflı kasa)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01091</td><td>Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonu için İpuçları&nbsp;</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P250 Uçlar, İletken, Bariyerli Pre-steril (10 raflı kasa)</td><td>Beckman Coulter</td><td>394627</td><td>Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonu için İpuçları&nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACS Lizasyon Çözeltisi 10x Konsantre</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>RBC lizis</td></tr><tr><td>Falcon Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td>Numune tüpleri</td></tr><tr><td>Anti-CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td>Efektör T hücre paneli (baz)</td></tr> <tr><td>Anti-CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0038-42</td><td>Efektör T hücre paneli (taban)</td></tr> <tr><td>Anti-CD4 PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341654</td><td>Efektör T hücre paneli (taban)</td></tr><tr><td>Anti-TCRgd BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564156</td><td>Efektör T hücre paneli (taban)</td></tr><tr><td>Anti-TCRab BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563825</td><td>Efektör T hücre paneli (baz)</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>Efektör T hücre paneli (baz)</td></tr><tr><td>Anti-CCR7 PE-CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562381</td><td>Efektör T hücre paneli (baz)</td></tr> <tr><td>Anti-CD45RA PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337167</td><td>Efektör T hücre paneli (baz)</td></tr> <tr><td>Anti-HLA-DR BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562804</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr> <tr><td>Anti-CD278 (ICOS) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557802</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr> <tr><td>Anti-CD38 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340439</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr> <tr><td>Anti-CD279 (PD1) BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562516</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr> <tr><td>Anti-CD357 (GITR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5875-42</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr> <tr><td>Anti-CD137 (41BB) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550890</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr> <tr><td>Anti-CD69 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562884</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr><tr><td>Anti-CD314(NKG2D) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557940</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr><tr><td>Anti-CD134(OX40) APC</td><td>BioLegend</td><td>350008</td><td>Efektör T hücre paneli (aktivasyon)</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Sodyum Heparinli Plastik Kan Alma Tüpleri: Konvansiyonel Tıpa</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Kan</td></tr> <tr><td>toplamak içinAlbümin, Sığır Serumu, Fraksiyon V, RIA ve ELISA Sınıfı</td><td>EMD Millipore</td><td>126593</td><td>Akış yıkama tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>Akış yıkama tamponu için</td></tr><tr><td>Heparin, sodyum tuzu</td><td>Affimetrix</td><td>16920</td><td>Akış yıkama tamponu</td></tr><tr><td>için Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 1x, Kalsiyum, Magnezyum, Fenol Kırmızısı olmadan</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30588.02</td><td>Akış yıkama tamponu için</td></tr></tbody></table>

İnsan periferik kan immünfenotipik analizi antikor kokteyller hazırlama a yarı-otomatik yaklaşım

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

akış ile periferik kan İmmünofenotipleme sitometri hastalık ve tedavi sırasında periferik lökositlerin sıklığı ve aktivasyon durumundaki değişiklikleri belirler. Bu terapötik etkinlik tahmin ve yeni tedavi hedefleri tespit etme potansiyeline sahiptir. Tam kan boyama numune hazırlama sırasında meydana gelebilecek eserler minimize unmanipulated kan kullanır. Bununla birlikte, tam kan lekeleme da numunenin bütünlüğünü sağlamak için yeni toplanmış kan yapılmalıdır. Ayrıca, tandem-boyalar potansiyel istikrarsızlık önlemek ve parlak mor boyalar arasındaki reaktif etkileşimi önlemek için aynı gün antikor kokteyller hazırlamak için en iyisidir. Bu nedenle, tam kan boyama içi ve inter-deneysel değişkenliği kontrol etmek için dikkatli bir standardizasyon gerektirir. Burada, Antibod yapma, standart bir işlemle bir iki boyutlu (2D) barkod okuyucu ile donatılmış bir otomatik sıvı işleyici dağıtım raporflow sitometri için y kokteyller. Antikorlar, bir veri tabanında bulunan derlenmiş, 96 gözlü bir format ve içerikleri düzenlenmiş 2D barkod tüplere transfer edilmiştir. Sıvı işleyici sonra veritabanı içinde antikor isimleri başvurarak kaynak antikor şişeleri bulmak olabilir. Bizim yöntem kaynak antikor tüplerin yerleştirilmesi için sıkıcı koordinasyon ortadan kaldırmıştır. Bu kullanıcının kolayca her bir deney için yazılım yönteminde komut yeniden yazmadan veritabanı değiştirerek bu tür spesifik kullanmak için antikor, ses ve hedef olarak antikor dağıtım sürecinde detayların herhangi sayısını değiştirmek için izin yönlülük sağladı. kavram deney bir kanıtı deneyi sitometri 11 renkli, 17-antikor akışının tekrarlanan hazırlanması gösterdiği olağanüstü arası ve içi tahlil hassasiyet, elde etti. Bu metodolojiler deneyleri flow sitometri için genel verimliliği artmış ve ayrıntılı fenomenoloji için gerekli olan karmaşık antikor kokteyller günlük hazırlanmasını kolaylaştırmıştırtaze toplanmış Antikoagüle periferik kan typic karakterizasyonu.

Tam kan İmmünofenotiplemesi, insan bağışıklık sistemini izlemek için vazgeçilmezdir. Bununla birlikte, gerekli reaktiflerin sayısı ve önceden karıştırılmış kokteyllerdeki spesifik florokromların kararsızlığı, günlük reaktif hazırlığını gerektirir. Burada, boyama antikor kokteylinin yarı otomatik olarak hazırlanmasının, reaktif dağıtımındaki değişkenliği en aza indirerek güvenilir immünofenotipleme oluşturmaya yardımcı olduğunu gösteriyoruz.

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Bu yarı otomatik boyama antikor kokteyli hazırlama protokolünün genel amacı, reaktif dağıtımının değişkenliğini en aza indirmek için güvenilir bir immünofenotipleme yöntemi oluşturmaktır. Bu yöntem, immünomonitörizasyon alanındaki aşağıdakiler gibi temel sorunların ele alınmasına yardımcı olabilir: reaktif dağıtımından kaynaklanan deney içi ve deneyler arası değişkenliğin nasıl kontrol edileceği. Bu tekniğin temel avantajı, kokteyl hazırlamanın otomasyonunun pipetleme doğruluğunu artırırken manuel kokteyl hazırlama hatalarını azaltmasıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Iliana Gonzalez olacak. Prosedüre başlamadan önce, 2D barkod tüplerine insan tarafından okunabilir etiketler uygulayın. Daha sonra, her bir antikor şişesinin tüm içeriğini, kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek uygun karşılık gelen 2D barkod tüplerine aktarın. Antikorlar transfer edildiğinde, tüpleri okumak için 2D barkod okuyucuyu kullanın. Ardından, antikor adlarını ve barkod okumalarını içeren bir elektronik tablo oluşturun ve elektronik tabloyu virgülle ayrılmış değerler dosyası olarak kaydedin. Şimdi, 2D barkod okuyucuyu ve ardından otomatik sıvı işleyiciyi başlatın. Otomatik sıvı işleyicinin şırıngalarını doldurmak için, Alet altında, Home All Axes'ı seçin.Şırıngaların hiçbirinin görünür hava kabarcıkları içermediğini onaylayın. Şırıngalar doldurulduğunda, otomatik sıvı işleyici yazılımında temel kokteyli ve aktivasyon kokteylini yapma yöntemlerini açın. Daha sonra, yapılacak baz ve aktivasyon kokteyllerinin sayısına uygun olarak, baz kokteyli ve aktivasyon kokteyli için mikrofüj tüplerini küçük tüp raflı mikrofüj tüplerine yerleştirin. Tüp raflarını güverteye yerleştirmek için cihaz kurulum şemasını referans olarak kullanın. Tampon rezervuarını güvertenin uygun bölümüne yerleştirin ve antikorları içeren 2D barkod tüplerinin kapağını açmak için sekiz kanallı vidalı kapaklı bir decapper kullanın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için, kapakları uygun sırada tutmak için her bir kapağı çıkarılırken bir kapak tutma tepsisine yerleştirin. Ardından P50 LLS filtre uçlarını, P200 LLS filtre uçlarını, P1000 uçlarını ve Matrix 1 mL tüp rafını güverteye uygun konumlarına yerleştirin. Yöntemi başlatmak için başlat simgesine tıklayın. Açılır pencere göründüğünde, güvertedeki tüm öğelerin yöntem için cihaz kurulum şemasıyla eşleştiğini onaylayın. Her şey yerindeyse, Tamam'ı tıklayın. Otomatik sıvı işleyici, tamponu rezervuardan mikrofüj tüplerine aktaracaktır. Matrix 1 mL tüp rafı 2D barkod okuyucuya geçecek ve barkodlar okunacaktır. Tüm barkodlar okunduğunda, antikor transferini başlatmak için açılır pencerede Tamam'a tıklayın. Aktarımın tamamlanmasının ardından, 2D barkod tüplerini yeniden kapatmak için sekiz kanallı vidalı kapak decapper'ı kullanın ve tüpleri 4'e geri getirin

a-semi-automated-approach-to-preparing-antibody-cocktails-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, bir serum örneğindeki çeşitli antikor izotiplerini aynı anda tespit etmek için farklı antijenlerle birleştirilmiş floresan manyetik boncuklar veya mikroküreler kullanan bir immünolojik test tekniği açıklanmaktadır. Test, bir enfeksiyon sırasında veya aşılama sonrası serokonversiyonun anlaşılmasında yardımcı olur.

Multianalit İmmünoboncuk Testi: İnsan Serum Numunesinde Çoklu Antikor Alt Tiplerinin Eşzamanlı Tespiti için Akış Tabanlı Bir İmmünoassay Tekniği

Bu video, antikor salgılayan B hücrelerinin, ASC'lerin işlevini değerlendirmek için ELISpot testinin kullanımını göstermektedir. ASC'ler tarafından salgılanan antikorlar, enzim konjuge IgG veya IgM antikorları tarafından tespit edilen zara bağlı poliklonal antikor fragmanları ile etkileşime girer. Her bir oyukta üretilen renkli nokta, B hücrelerinin salgı aktivitesi ile ilişkili olan spesifik antikorun izotipinin varlığını gösterir.

Antikor Salgılayan B Hücrelerinin ELISpot Testi Kullanılarak Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Burada, megakaryosit farklılaşmasının karakterizasyonu için bir immünofenotyping stratejisi sunuyoruz ve bu stratejinin floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcısı ile megakaryositlerin farklı aşamalarda sıralanmasına nasıl izin verdiğini gösteriyoruz. Metodoloji insan birincil dokularına uygulanabilir, aynı zamanda kültür in vitroundaüretilen megakaryositlere de uygulanabilir.

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

Öğrenin yarı otomatik antikor kokteyli hazırlama yöntemiyle insan periferik kan immünfenotipik analizi için güvenilir sonuçlar elde etmeyi. Bu teknik, reagent dağıtımındaki değişkenliği azaltarak immünoloji araştırmalarında tutarlılığı artırır.

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Daha fazla video keşfet