Name: Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Keşfedin, ışık duyarlı konjuge polimerler kullanarak hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesini görünür ışıkla kontrol etme yöntemini. Bu teknik, optogenetik alternatifi olarak minimal invazivlik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA projesi aracılığıyla AB tarafından desteklenmiştir, 
Telethon - İtalya (GGP12033 ve GGP14022 hibeler), Fondazione Cariplo (hibe kimliği 2013-0738).

Fotoaktif Substratlar hazırlanması 1. <ol><li> Bir P3HT hazırlayın: PCBM çözeltisi: benzen (1 ağ / ağ 1) 20 g / L&#39;lik bir konsantrasyonda P3HT. 60 ° C&#39;de en az 4 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı ile çözelti karıştırın. Her bir taban hazırlanacak çözeltinin 150 ul&#39;lik bir hacim düşünün. </li><li> Temiz İTO kaplı cam slaytlar bir sonikatöre deiyonize su, aseton ve izopropanol ardışık banyolar ile (R, s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, kalınlık 170 um) (her bir aşama için 10 dakika). Bir azot tabancası ile lamelleri kurulayın. 10 dakika boyunca 100 W gücünde bir plazma temizleyici örnekleri koyun. </li><li> Döndürmeli kaplama ile temizlenmiş alt tabakalar üzerinde aktif tabakanın ince bir film oluşturur. <ol><li> Bir Elmas ucu olan, İTO kaplı yüzeylerde aynı yanal boyutları bir mikroskop cam slayt, (kalınlık ≈ 1 mm) kesti. Sıcak plakadan PCBM çözeltisi ve bu, ortam sıcaklığına kadar soğuması: P3HT çıkarın. </li><li> Iki st ayarlamaeps spin-lak programı: i) 800 rpm&#39;de 30 sn; ii) 1600 rpm&#39;de 30 saniye. Spin-kaplayıcının aynanın slayt yerleştirin ve bunu düzeltmek için vakum başlar. İTO kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde slayt aseton bir damla ve daha sonra temizlenmiş substrat, koyun. Fazla aseton kurtulmak için spin-lak rotasyon başlatın. </li><li> Yüzeylerde PCBM çözümü ve tekrar spin-kaplayıcı (1.3.2 açıklanan aynı protokolü kullanın) başlatın: P3HT 150 ul koyun. </li><li> Spin-kaplayıcı bittikten sonra, örneği kaldırmak ve dikkatle cam slayt kaplı alt tabakayı çıkarın. Aseton batırılmış bir bez ile temiz oda substrat arkasını temizleyin. Not: kullanılana kadar fotoaktif alt-tabakalar ile karanlık bir kutu içinde birkaç gün muhafaza edilebilir. Daha uzun süreler için, soy gaz ile bir eldiven kutusu içinde tutmak. </li></ol></li></ol> Hücre Kültürü Orta ve Elektrofizyoloji Çözümleri 2. Hazırlık <ol><li> Tam büyüme ortamı (CGM) hazırlayınHEK-293 hücreleri: Dulbecco&#39;nun Eagle ortamında ısı ile inaktive edilmiş olup% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş (DMEM) değiştirildi. 4 ° C &#39;de 0.2 um filtrasyon sistemi ve mağaza ile orta sterilize edin. </li><li> 135 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 Glikoz, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2: ultra-saf su (mM olarak konsantrasyonlar) hücre dışı çözelti hazırlayın. NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. 4 ° C &#39;de 0.2 um filtrasyon sistemi ve mağaza ile çözelti sterilize edin. </li><li> (MM konsantrasyonları) hücre içi ultra saf su ile çözüm hazırlayın: 12 KCI, 125 K-Glukonat, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. ATP-Na 2 ısıya duyarlı olduğunu unutmayın ve en son ekleyin. NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. -20 ° C&#39;de, bir 0.2 mikron filtre sistemi ile bir çözüm, kısım 1 ml&#39;lik tüplerde ml ve mağaza sterilize edin. </li></ol> 3. Kaplama HEK-293 hücreleriAktif Yüzeyler üzerinde <ol><li> Bir cam kabın alüminyum ya da kapalı bir Petri kabı kapatıldı ve sterilizasyon için 2 saat boyunca 120 ° C&#39;de bir fırına konulur olarak fotoaktif substrat yerleştirin. Itibaren bu andan itibaren, steril şartlarda tüm işlemleri gerçekleştirmek. Steril bir kaput örnekleri koymak ve onları soğumasını bekleyin. </li><li> Coat bir yapışma tabakası ile fotoaktif yüzey yüzey hidrofobikliğini azaltmak ve hücre yapışmasını teşvik etmek. <ol><li> Bir P35 Petri kabındaki aktif yüzeylerde veya 6 çukurlu plaka koyun. Konjuge polimer tabakasının hidrofobisitesi göz önüne alındığında, bir polidimetilsiloksan (PDMS) iyi örnek düzeltmek ve çözümler sınırlandırmak için yapmak. <ol><li> Viskoz bir bulamaç elde etmek için, bir cam çubuk ile 1 oranında a 10 PDMS ve katalizör karıştırılır. </li><li> Her bir yarısı karşılamak için yeterli bir miktar dağıtma, 6 oyuklu bir plaka içerisinde bulamaç dökün. </li><li> Oda sıcaklığında PDMS polimerizasyonu için bekleyin. </li><li> Obta için ortada vulkanize PDMS KesilmişPolimer numunenin aynı boyutta bir kare şekli ining. </li><li> En az 30 dakika boyunca% 70 etanol-su karışımı içine daldırma ile PDMS kuyu sterilize edin. </li></ol></li><li> Iyi PDMS kullanıyorsanız, iyi hücre kültürü sonrası PDMS sökerken tüm katmanın ayrılmasını önlemek için, sivri cımbız ile kuyunun bütün sınır boyunca fotoaktif tabaka çizmeyin. </li><li> Fibronektin çözeltisi (PBS içinde 2 mg / L) ile, her numunenin tüm yüzeyini kaplar. Bir PDMS iyi (: 15x15 mm 2 de net yüzeyini) kullanıldığı takdirde numune başına 500-750 ul arasında bir hacim genellikle yeterlidir. De PDMS olmadan fibronektin çözeltinin yaklaşık 2 mi numuneyi tamamen sokmak için gerekli olan; çözeltisi eklenirken alt-tabaka taşmaması açısından dikkat edin. En az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir cam pipet ile fibronektin çözeltisi çıkarın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkanır. </li></ol></li><li> Pl15.000 hücre / tam büyüme ortamında cm2 yoğunluğunda fibronektin tedavi edilen örnekler üzerinde HEK-293 hücreleri yedi. Bir kullanıldığında iyi PDMS, aksi takdirde 2-3 mi CGM&#39;nin gerekli olan, her bir örnek için CGM&#39;nin 750-1,000 ul bir hacim kullanın. 24-48 st için CO 2 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5. </li></ol> 4. Optik Uyarım Protokol ve Elektrofizyolojik Ölçümler <ol><li> Isıtmaları için 37 ° C&#39;da bir su banyosu içinde, hücre dışı çözelti koyun; , hücre içi bir çözüm çözülme 34 gauge iğne ile 1 ml şırınga koymak ve ATP bozulmasını önlemek için buz ile temas halinde tutun. </li><li> Dikkatle PDMS kaldırarak de eğer mevcut, inkübatör hücre kaplı alt tabaka atın. Bir cam pipet ile büyüme ortamı çıkarın ve ekstrasellüler çözümü ile numuneyi durulayın. Hücre dekolmanı önlemek için yavaş yavaş ilerleyin. </li><li> Hücre dışı solutio ile elektrofizyoloji istasyonunun numune tutucu içine cihazı koymakn ve referans elektrot. Bir çekici ile yama-kelepçe taze cam mikropipetler hazırlayın (ideal direnç aralığında 2-4 M? Içindedir). Hücre içi çözelti ile pipet yarısını doldurun ve mikromanipülatör monte edilir. </li><li> Cihaz üzerinde yama sağlıklı bir hücrenin arayın. Fotoaktif substratın istenmeyen uyarma önlemek için, mikroskop aydınlatıcının önünde uzun dalga boylu geçiş filtresi (örneğin, bir kesik dalga boyu λ = 750 nm görünür emen polimerler için kullanılabilir) yerleştirilmesi, görüntüleme için IR aydınlatma kullanıldığında. </li><li> Seçili hücreyi yama ve mikroskobu (Şekil 1) floresan uyarma yol üzerinden numune ışık sunarak optik uyarılması için istenen protokolü uygulamak. Patch-clamp protokolünün detaylı tarifi burada referans 20 bulunabilir. <ol><li> Bir mikrometrik manipülatör ile hücre zarına yakın yama pipet yerleştirin. Yer belirleme sırasında, overpressur geçerlidirsırayla pipet e ucunda kir yapışmasını önlemek için. Pipet hücre üzerinde birkaç mikron olmalıdır. </li><li> Yama kontrol yazılımı üzerinde pipet direnci kontrol ederken hücre zarının doğru pipet düşürücü başlayın. Pipet direnci yaklaşık 1 M? Arttığında pipet ve hücre zarı arasında gigaseal oluşturmak üzere, bir hafif bir emme uygularken, pipet fazla basıncı çıkarın (yani, ölçülen direnç 1 GΩ daha yüksek değerlerde artmalıdır) . </li><li> Mühür istikrara kavuşturmak için potansiyel (HEK293 -40 potansiyeli hücre için mV kullanılabilir) istirahat beklenen hücreye yakın pipet bir negatif potansiyel uygulayın. Nedeniyle yama amplifikatörü ve / veya yama kontrol yazılımı göreli komutlarla pipet kapasitans kapasitif transientler dengeleyin. </li><li> Kısa ve yoğun emme darbe uygulayarak hücre sitoplazması elektrik erişime izin vermek için membran kırınpipet. Hücre membran potansiyeli izlemek için (hücreye enjekte hiçbir geçerli olan, yani I = 0) geçerli kelepçe moduna yama amplifikatör ayarlayın. Hücre potansiyeli kararlı olup olmadığını görmek için birkaç dakika bekleyin. </li><li> Hücreye istenen aydınlatma protokolünü uygulayın ve membran potansiyeli üzerindeki etkisini kaydedin. Not: aydınlatma mikroskop mimarisine bağlı olarak alttan veya üstten ya numune teslim edilebilir. <ol><li> De aktif madde tarafından emilir bir eksitasyon dalga boyu seçin; P3HT için iyi: PCBM harmanı, 450-600 nm aralığında bir dalga boyunda kullanılabilir. Uygun photoexcitation yoğunlukları aralığı 10-100 mW / mm 2 bulunmaktadır. Not: Sonuç (10-20 msn altında) Işığın Kısa darbeleri hücrenin geçici depolarizasyon, uzun süreli aydınlatma ise ışığı kapatılana kadar sürekli hiperpolarizasyon görülmektedir (milisaniye veya daha uzun bakliyat yüzlerce). </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li>
<li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li>
<li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+Light+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+semiconductors+for+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li>
<li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic-based+tristimuli+colorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509(2007).</li>
<li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+Organic+Electronics+in+Biology%3A+Materials+and+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li>
<li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li>
<li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li>
<li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rise+of+Organic+Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li>
<li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate%3A+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li>
<li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li>
<li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501(2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly%283-hexylthiophene%29+Layers+for+Sensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li>
<li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+P3HT%2FOxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li>
<li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hücrelerin optik uyarımı esas olarak ışığa duyarlı polimer seçimi, ısıl sterilizasyon parametreleri, yoğunluğu ve ışık uyaranlara süresini ilgilidir in vitro için rapor edilen protokol kritik adım. Bir P3HT: iyi zamansal ve elektrokimyasal stabiliteyi garanti beri PCBM ince film, burada seçildi. Ancak, bir bütün ışığa duyarlı polimerler aydınlatma üzerine daha spesifik, 22 analog performansları sunabilir dikkat etmelidir. Buna ek olarak, bu durumda parametre polimerin optoelektronik özellikleri olduk...

Hassas bir uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücre aktivitesini işlemek için bir olasılık sinirbilimsel araştırma ve nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların tedavisinde çok önemli bir strateji temsil eder. 1 geleneksel metotlar çevresinde veya temas sağlayacak şekilde yerleştirilmiş elektrotlar kullanılarak hücrelerin elektrik stimülasyonu dayanmaktadır (in vivo beyin dokularında, tek hücre, hücresel şebeke, beyin dilimleri) farklı karmaşıklık olabilir hedeflenen sistem, 2. Geçtiğimiz yüzyılda, yama-kelepçe, metal ve yüzey entegre elektrotların kullanılması fizyolojisi ve tek nöronların ve sinir ağları işleyişi mekanizmalarının patofizyolojisi detaylı bir resmini sağladı. Ancak, elektriksel uyarım önemli sınırlamalar muzdarip. İlki nedeniyle kolayca adapte olamaz elektrotlar ve sabit geometri fiziksel boyutlar, bir genellikle kötü uzamsal çözünürlük ile ilgilidirBiyolojik dokuların gibi karmaşık organize sistemlere. Ayrıca, elektrotlar empedansına ve stimülasyon ve kayıt sistemler arasında çapraz konuşma ile ilgili sorunlar ölçümlerinin son sinyal-gürültü oranını etkileyebilir. 3 Öte yandan, stimülasyon için ışık kullanılması bir çok sınırlamalar üstesinden gelmeye yardımcı olabilir Elektrik yaklaşım. Her şeyden önce, bu mümkün, belirli hücre tipleri ve hatta alt-hücre bölmeleri hedef yapım görülmemiş uzaysal (&lt;1 mikron) ve temporal çözünürlük (&lt;1 msn) sunmaktadır. Bu ilgi doku ile herhangi bir fiziksel temas önler ve kayıttan stimülasyon disentangles beri ek olarak oldukça non-invaziv olduğunu. Ayrıca, ışık yoğunluğu ve dalga boyu, hem tam olarak kontrol edilebilir ve bu şekilde, farklı stimülasyon protokolleri uygulanabilir. 3,4 Bununla birlikte, hayvan hücrelerinin büyük bir çoğunluğu ışığa herhangi bir hassasiyet göstermezler. Optik stimulatio için çeşitli stratejilern, böylece, her iki yakın veya hücre içinde, ışığa duyarlı bir molekül mediatörler istismar veya hücre yakınında harici olarak yerleştirilen fotoaktif cihazı kullanılarak önerilmiştir. Birinci kategori görünür veya kızılötesi (IR) ışık ile uyarılması, hem de photocleavable / photoisomerizable bileşikler ya da ışığa molekül aktüatörler (optogenetics) &#39;deki genetik ekspresyonu ya da kullanımı gibi endojen mekanizmaları belirtmektedir. Bu ikinci tür inorganik nano / mikro-parçacıklar ya da foto-iletken silikon alt tabakaların kullanılması ile elde edilen dışsal uyan tekniklerini içerir. 5 Bununla birlikte tüm bu sistemler, parlak taraf ve dezavantajları vardır. Özellikle, görünür aralığında hücrelerin endojen emme, zayıf ve güvenilir değildir ve reaktif oksijen türlerinin üretimi eşlik hücre için zararlı olabilir. Genel olarak, İR nedeniyle su emme yerel termal ısıtma indüklemek için kullanılır, ancak suyun yok olma katsayısı dolayısıyla st gerektiren küçük,Standart mikroskop optik aracılığıyla teslim etmek ve in-vivo uygulamalar için güvenlik endişeleri oluşturabilecek zordur (onlarca W / mm 2 yüzlerce) rong kızılötesi ışık. Diğer taraftan, foto-değiştirilebilir kafes bileşikleri süresi sınırlı bir etkiye sahip olduğu ve çoğu zaman, sınırlı doku penetrasyonu sunmak için çok UV ışığı gerektirir. Ayrıca onlar aydınlatılmış alanı dışında photolysis üzerine aktive bileşiklerin difüzyon sorunları muzdarip. Son olarak, optogenetic araçları belirli hücresel subpopülasyonu ve alt bölmeleri hedef bilim adamları izin ve hızla sinirbilimsel araştırma anahtar teknolojilerden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Ancak, viral vektör yoluyla eksojen DNA segmentini ekleyerek özellikle insan hastalarda benimsenmesi açısından önemli güvenlik sorunlarını ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenlerle 5,6, hücre optik manipülasyon yeteneğine sahip yeni malzemeler ve cihazlar üzerinde araştırmalar son derece sıcak bir konudur. Son yıllarda, yenietkin bir şekilde hücre elektriksel aktivitenin bir modülasyon giren bir optik uyaran transdüse mümkün ışığa duyarlı konjuge polimerlerin kullanımına dayalı bir yaklaşım, ileri sürülmüştür. 7 Onlar, biyouyumlu yumuşak ve uyumlu ve onların mekanik esneklik dokusu ile samimi bir arayüze sağlar; onlar görünür aralığında ışığa özünde duyarlıdır: Polimer Photoexcitation Hücre Stimülasyon (CSPP) tekniği, tipik organik yarı iletkenler birçok anahtar sağlayan özellikleri patlatır in-vitro ve in-vivo olarak her iki 8-10. Bunun dışında, onlar kolayca daha sondalama ve yeteneklerini algılama, belirli uyarma etkinleştirmek için canlı hücreler ile arayüzüne uyum, ve fonksiyonel hale getirilebilir. 11,12 Ayrıca, kombinasyon için idealdir, iyonik ulaşım yanı sıra elektronik destekleyen elektronik reklam biyoloji. İlginçtir 13,14, onlar harici önyargı f uygulamak gerek kalmaz, fotovoltaik modda çalışabilirya da verimli hücre optik uyarım. 15 CSPP tekniğinin güvenilirliği daha önce primer nöron, 15,16 astrositler, 17, ikincil hücre çizgileri 18 ve eksplante retina dokular da dahil olmak üzere, çeşitli sistemlerde ortaya konmuştur. Bu çalışmada 16, gerekli olan bütün aşamalar, ışığa duyarlı bir biyo-polimer imal etmek için in vitro sistemlerin optik uyarılması için bir arayüz 19 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. Olarak hareket eden bir elektron vericisi olarak işlev uygulama durumlarında, bölge normal poli (3-hexylthiophene) içindeki bir prototip organik fotovoltaik harmanı (rr-P3HT), ve fenil-C61-butirik asit-metil ester (PCBM) olarak elektron alıcısı kullanılır. Biyolojik bir sistem olarak, insan embriyonik böbrek (HEK-293) hücreleri kullanılır. Elektrofizyolojik ölçümler yoluyla hücre aktivitesi göreli kayıt ile photostimulation protokolünün bir örneği temin edilmiştir. Tarif platformuBununla birlikte, genel geçerliliğinin ve kolayca düzgün hücre kültürü protokolü değiştirilmesi istenen işlem ve zamanı kaplama ile, farklı hücre tipleri ((uygun çözelti hazırlama süreci ve çökelme parametrelerini ayarlayarak) diğer birleşik polimerlerin kullanılması uzatılabilir Hücre tohumlama ve çoğalması) ve farklı stimülasyon protokolleri (ışık dalga boyu, uyarı sıklığı ve süresi, photoexcitation yoğunluğu) için.

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO kaplı yüzeyler</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>klorobenzen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C Nano-CPCBM-BF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aseton&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>izopropil alkol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK hücreleri</td><td>LGC standartları srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standartları srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>LGC standartları srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

konjuge polimerler tarafından hücreler elektrik etkinliği yaşam optik kontrol

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Organik yarı iletkenler ve canlı dokular arasındaki hibrit arayüzler, in-vitro ve in-vivo uygulamalar için yeni bir aracı temsil eder. Özellikle, konjuge polimerler, biyolojik sistemler için substratlar olarak iyi biyouyumluluk, mükemmel mekanik özellikler, ucuz ve kolay işleme teknolojisi ve hafif, ince ve esnek substratlar üzerinde biriktirme olasılığı gibi çeşitli optimal özellikler gösterir. Bu malzemeler, nöral problar, nöral aktivitenin uyarılması ve kaydedilmesi için transistörler, ilaç salınımı için biyosensörler ve aktüatörler gibi hücresel arayüzler için kullanılmıştır. Son deneyler, hücrelerin elektriksel aktivitesinin tamamen optik modülasyonu için konjuge polimerlerin kullanılması olasılığını da göstermiştir. Birincil nöronal ağlar, astrositler ve ikincil hat hücreleri dahil olmak üzere çeşitli in vitro çalışma vakaları bildirilmiştir. Ayrıca, organik polimerlerin aracılık ettiği sinyal foto-transdüksiyonunun dejenere retinalarda ışık hassasiyetini geri kazandırdığı gösterilmiştir, bu da bu cihazların gelecekte yapay retina protezleri için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, ışığa duyarlı konjuge polimerler, hücresel aktivitenin optik modülasyonu için yeni bir yaklaşımı temsil eder.
Bu çalışmada, canlı hücrelerin optik uyarılması için bir biyo-polimer arayüz üretmek için gereken tüm adımlar açıklanmaktadır. Aktif arayüzün işlevi, ışık uyaranını hücre zarı potansiyelinin bir modülasyonuna dönüştürmektir. İn vitro çalışmalar için yararlı bir çalışma vakası olarak, fonksiyonel, ışık emici tabaka olarak bir politiyofen ince film kullanılır ve arayüzün biyolojik bileşeni olarak İnsan Embriyonik Böbrek (HEK-293) hücreleri kullanılır. Farklı sürelerde ışık darbeleri ile stimülasyon üzerine hücre zarı potansiyelinin başarılı bir şekilde kontrol edilmesinin pratik örnekleri verilmiştir. Özellikle, ışık uyaranının süresine bağlı olarak hücre zarı üzerinde hem depolarize edici hem de hiperpolarizan etkilerin elde edilebileceği gösterilmiştir. Rapor edilen protokol genel geçerliliğe sahiptir ve doğrudan diğer biyolojik preparatlara genişletilebilir.

Hücreler P3HT kolayca kültürlenebilir: PCBM substratları (tarif edilen protokol aşama 3,2 kullanılan fibronektin benzeri) uygun bir tutunma katmanı yatırılır koşuluyla. P3HT: Görünür spektrumun yeşil kısmında PCBM optik soğurma zirveleri; bununla birlikte diğer ışığa duyarlı eşlenik polimerler Tercih edilen photostimulation dalga boyları aralığında (Şekil 2) göre seçilebilir. . PCBM filmi gösterilmiştir: Bu alt-tabakaların Biyouyumluluk, sadece hücre çizgileri nöronlar <...

İn vitro hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesinin görünür ışıkla uyarılması için organik yarı iletken polimerlerin kullanımına dayalı bir yöntem tarif edilmiştir.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Bu yöntemin genel amacı, görünür ışık darbeleriyle uyarılma üzerine hücre membran potansiyelini kontrol etmektir. Fototransdüksiyon süreci, ışığa duyarlı konjuge bir polimer aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu yöntem, canlı hücre aktivitesinin optik kontrolü için optogenetik ve termal stimülasyon gibi mevcut yöntemlere değerli bir alternatif sunduğundan, teknoloji alanında yeni bir araç sağlamaktadır.Bu tekniğin temel avantajları, her türlü elektrofizyolog tipiyle hızlıca entegre edilebilmesi, potansiyel olarak yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğü ve invazivliği azaltmasıdır. Dahası, optogenetik için gerekli olan gen transferinden kaçınılmasını sağlar. Yöntemimiz burada in vitro hücre kültürünün fotostimülasyonu için açıklanmıştır.Ancak bu durum, in vivo uygulamalar için de ilginç fırsatlar sunabilir. Prosedürü uygulamayı, laboratuvarlarımızdan sırasıyla biyolojik ve fiziksel kimya geçmişine sahip doktora sonrası araştırmacılar Caterina Bossio ve Susana Vaquero Morata gerçekleştirecektir. Başlamak için, P3HT ve PCBM'yi klorobenzen içinde bir bire bir bağıl konsantrasyonda karıştırarak ışığa duyarlı konjuge polimer çözeltisini hazırlayın.Çözeltiyi, 60 °C'de en az dört saat boyunca m

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, nöronal hücrelerde farklılaşmayı ve hücre içi kalsiyum aktivitesini uyarmak için altın nanoçubukların optik absorpsiyonu ile ilişkili geçici ısınmanın nasıl kullanılacağını ana hatlarıyla belirtir. Bu sonuçlar potansiyel olarak nöral protezlerde ve nörobilimdeki temel çalışmalarda yeni uygulamalar açmaktadır.

Altın Nöronal Hücrelerde optik Uyarım Nanorod destekli

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Bir iletişim kuralı Optoelektronik oluşan jelleri analizi için polimer poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) küçük kullanarak Birleşik ve ultra-küçük açı nötron saçılma varlığı ve yokluğu aydınlatma sunulur.

Aydınlatma nötron saçılma kullanarak konjuge polimer jelleri yapısını etkilerinin izlenmesi

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.

Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Burada, ışık iletimi için optik fiberlere ve nöral kayıt için bir elektrot dizisine sahip bir optrode sisteminin üretim yöntemini sunuyoruz. Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden transgenik farelerle yapılan in vivo deneyler, eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesini göstermektedir.

Eşzamanlı Optogenetik Modülasyon ve Elektriksel Nöral Kayıt için Optrode Dizisi

Bu protokol, hücresel dağılımını ve ışık stimülasyonuna tepkisini doğru bir şekilde izlemek için cAMP sensörlerinin ve optogenetik bir protein olan bPAC-nLuc'un transfekte edilmesini içerir. Bir nokta tarama sistemi kullanarak bir cAMP yanıt haritası oluşturmaya yönelik yenilikçi yaklaşım, farklı alanlarda optogenetik proteinlerle yapılan araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir.

Bir Işık Stimülasyon Izgarası Kullanarak Bir Optogenetik Proteinin Hücresel Dağılımının Haritalanması

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Keşfedin, ışık duyarlı konjuge polimerler kullanarak hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesini görünür ışıkla kontrol etme yöntemini. Bu teknik, optogenetik alternatifi olarak minimal invazivlik sağlar.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Daha fazla video keşfet