Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Bu yöntemin genel amacı, görünür ışık darbeleri ile uyarıldığında hücre zarı potansiyelini kontrol etmektir. Fototransdüksiyon işlemine, ışığa duyarlı bir konjuge polimer aracılık eder. Bu yöntem, canlı hücrelerin aktivitesinin optik kontrolü için optogenetik ve termal stimülasyon gibi mevcut yöntemlere değerli bir alternatif sunduğu için teknoloji alanında yeni bir araç sağlar.

Bu tekniğin ana avantajları, herhangi bir elektrofizyolog tipi ile hızlı entegrasyon yeteneği, potansiyel olarak yüksek özel ve zamansal çözünürlük, invaziviteyi azaltır. Dahası, optogenetiğin gerektirdiği bir gen transferinden kaçınmaya izin verir. Yöntemimiz burada in vitro hücre kültürünün fotostimülasyonu için açıklanmıştır.

Ancak in vivo uygulamalar için de ilginç fırsatlar yaratabilir. Prosedürü gösterenler, Caterina Bossio ve Susana Vaquero Morata'nın sırasıyla biyolojik ve fiziksel kimya geçmişine sahip laboratuvarlarımızdan doktora sonrası çalışmaları olacak. Başlamak için, P3HT ve PCBM'yi klorobenzin içinde bire bir nispi konsantrasyonda karıştırarak ışığa duyarlı konjuge polimerin bir çözeltisini hazırlayın.

Çözeltiyi 60 santigrat derecede en az dört saat manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın. Daha sonra, indiyum kalay oksit kaplı cam slaytları bir sonikatör içinde art arda 10 dakikalık deiyonize su, aseton ve izopropanol banyoları ile temizleyin. Kapak kızaklarını bir nitrojen tabancası ile kurutun ve ardından alt tabakaları bir plazma temizleyici ile işlemden geçirin.

Temizledikten sonra, sürgüyü ITO kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde bir spincoater'ın aynasına yerleştirin. Ardından, slayta 150 mikrolitre P3HT PCBM çözeltisi ekleyin ve numuneyi eğriltin. Spincoat kaplandıktan sonra, numuneyi çıkarın ve alt tabakanın arkasını temizlemek için asetona batırılmış bir temiz oda çubuğu kullanın.

Fotoaktif substratları kapalı ısıya dayanıklı bir kaba koyarak ve iki saat boyunca 120 santigrat derecede ısıtarak sterilize edin. Daha sonra numuneleri steril bir davlumbaza aktarın ve soğumaya bırakın. Bu noktadan itibaren numunelerin sterilitesini koruyun.

Fotoaktif substratları altı oyuklu bir plakaya yerleştirin. Konjuge polimer tabakasının hidrofobikliği göz önüne alındığında, numuneyi sabitlemek için bir polidimetilsiloksan kuyusu yapın ve çözeltileri beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi sınırlayın. Daha sonra, fotoaktif substratları plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve her bir numunenin tüm yüzeyini PBS'de litre başına iki miligram fibronektin çözeltisinden 500 ila 750 mikrolitre ile kaplayın.

Numuneleri 37 santigrat derecede en az bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, fibronektin çözeltisini çıkarmak için bir cam pipet kullanın ve ardından substratları bir kez iki mililitre PBS ile yıkayın. İlk olarak, kuyu başına toplam 750 ila 1.000 mikrolitre tam büyüme ortamı ekleyin.

Daha sonra, her bir kuyucuğa fotoaktif substratın santimetre karesi başına 15.000 AGK293 hücresi yerleştirin. Ardından, hücreleri 24 ila 48 saat inkübe edin. Hücreler, fibronektin gibi uygun bir yapışma tabakasının biriktirilmesi şartıyla, fotoaktif substratlar üzerinde kolayca kültürlenebilir.

Başlamak için, hem hücre dışı hem de hücre içi çözeltileri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Solüsyonları 0,2 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin. Ardından, hücre dışı çözeltiyi 37 santigrat derecede bir su banyosuna koyarak önceden ısıtın.

Ayrıca, bir mililitrelik bir şırıngayı hücre içi çözelti ile doldurun ve 34 gauge bir iğne ile donatın. ATP'nin bozulmasını önlemek için hücre içi çözeltiyi buzla temas halinde tutun. Ardından, inkübatörden hücre kaplı bir alt tabaka alın ve PDMS'yi dikkatlice çıkarın.

Daha sonra büyüme ortamını bir cam pipetle çıkarın ve hücre ayrılmasını önlemek için numuneyi hücre dışı çözelti ile yavaşça durulayın. Her oyuğa üç mililitre hücre dışı çözelti ekleyin ve ardından plakayı elektrofizyoloji istasyonunun numune tutucusuna aktarın. Yerleştirildikten sonra, referans elektrodunu test edilecek kuyuya yerleştirin.

Ardından, bir mikropipet çektirmesi kullanarak yama kelepçesi için yeni bir cam mikropipet hazırlayın. Pipetin yarısını hücre içi çözelti ile doldurun. Yama pipetini seçilen hücre zarına yakın bir yere yerleştirmek için mikromanipülatörü kullanın.

Konumlandırma sırasında, uca kir yapışmasını önlemek için pipete aşırı basınç uygulayın. Pipet hücrenin birkaç mikron üzerindeyken, yama kontrol yazılımındaki pipet direncini kontrol ederken pipeti hücre zarına doğru indirmeye başlayın. Pipet direnci yaklaşık bir megaohm arttığında, aşırı basıncı kaldırın ve pipet ile hücre zarı arasında gigaseal oluşturmak için hafif bir emme uygulayın.

Ardından, sızdırmazlığı stabilize etmeye yardımcı olmak için pipete negatif 40 milivoltluk bir negatif potansiyel uygulayın. Pipet kapasitansından kaynaklanan kapasitif geçiciliği, yama üzerindeki ilgili komutlarla telafi edin amplifier ve/veya yama kontrol yazılımı. Zarı kırmak ve hücre sitoplazmasına elektriksel erişim sağlamak için pipete kısa ve yoğun bir emme darbesi uygulayın.

Ardından, yama amplifikatörünü akım kelepçesi moduna ayarlayın, böylece hücreye akım enjekte edilmez. Akım kelepçesi modunda, hücre zarı potansiyelini takip edin ve stabilize olması için birkaç dakika bekleyin. Stabil hale geldikten sonra, hücrenin altındaki fotoaktif zarı 450 ila 600 nanometre aralığında ışıkla aydınlatarak hücreye istenen aydınlatma protokolünü uygulayın.

Işığın membran potansiyeli üzerindeki etkisini kaydedin. 10 ila 20 milisaniye civarındaki kısa ışık darbeleri, hücrenin geçici bir depolarizasyonuna neden olurken, yüzlerce milisaniye mertebesinde uzun süreli aydınlatma ile ışık kapatılana kadar hiperbolizasyon gözlenir. Fotoaktif substratların aracılık ettiği hücrelerin optik stimülasyonu, ışık uyaranının süresine bağlı olarak hücre zarı üzerinde farklı etkilere neden olabilir.

Burada gösterildiği gibi hızlı bir artışı, onlarca milisaniye mertebesinde geçici bir depolarizasyon takip eder. Işık kapatıldığında kısa ışık darbeleri için zıt bir davranış gözlenir. Bu sinyaller, ışık emilimini takiben yerel ısınmaya bağlı olarak membran kapasitansındaki bir değişikliğe bağlanmıştır.

Uzun süreli aydınlatma için, ilk depolarizasyon bir hücre hiperpolarizasyonuna dönüşür. Bu fenomen yine termal bir kökene sahiptir, ancak bu durumda, artan sıcaklığın neden olduğu iyon kanalının iletkenliklerindeki bir değişiklik nedeniyle zar denge potansiyelindeki bir değişiklik ile ilgilidir. Bu tekniğin oldukça esnek olduğunu ve örneğin fotoksik polimeri, üretim sürecini veya aydınlatma protokolünü değiştirerek belirli bir deneyin özel ihtiyaçlarına uyarlanabileceğini belirtmek önemlidir.

Bununla birlikte, protokolü değiştirmeden önce, aktif polimerin biyouyumluluğu, sterilizasyon işlemine uygunluğu, elektrokimyasal ve zamansal stabilitesi gibi önemli özellikleri doğrulanmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bağ polimerleri ve canlı hücreler arasında hibrit bir arayüzün nasıl gerçekleştirileceğini ve hücre aktivitesinin optik kontrolü için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu tekniğin aynı zamanda in vitro araştırmalar için nörobilimde tamamlayıcı bir araç olmayı ve aynı zamanda in vivo uygulamalarda yeni bir bakış açısı açmayı vaat ettiğine inanıyoruz.

Bununla birlikte, protokolü iyileştirmek için, malzeme bilimcileri ve sinirbilimciler, fizikçiler ve tıp doktorlarının güçlü ve ortak bir çabası zorunludur.