Spri, Nano-Spri ELISA Tahliller Kullanma Serum İnsan Büyüme Hormonu Karşılaştırmalı Analizi

Bu çalışmanın genel amacı, serumdaki biyobelirteçlerin tespitinde doğrudan ve amplifiye edilmiş yüzey plazmon rezonans görüntülemenin veya SPRi tahlillerinin tanısal potansiyelini değerlendirmek ve bunu doğrudan ticari olarak temin edilebilen enzime bağlı immünosorbent test kiti ile karşılaştırmaktır. Bu yöntem, bir hastalığın erken evresini vurgulamak ve terapötik etkinliği izlemek için araçlar sağlamak gibi biyomedikal bir alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. SPRi'nin ana avantajı, sensör yüzeyine bitişik kırılma indisindeki değişiklikleri kaydederek biyomoleküler etkileşimlerin etiketsiz, gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve görselleştirilmesine izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri, serumdaki hGH seviyelerinin teşhisine kadar uzanır, çünkü endojen hGH, insan büyümesini ve gelişimini etkileyen çok sayıda tıbbi bozuklukla ilişkilendirilmiştir. Biyoçip yüzey kimyası hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve herhangi bir hata sonuçları büyük ölçüde etkileyebileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Metin protokolüne göre çözeltiler ve protein örnekleri hazırladıktan sonra, altın çipi 90 dakika boyunca 50 santigrat derecede sonikasyon ile temizlemek için 120 mililitre stabilize piranha çözeltisi kullanın.

Çipi durulamak için su kullanın ve beş dakika boyunca suda sonikasyon yapın. Ardından çipi etanol ile durulayın ve kurutmak için bir nitrojen akışı kullanın. Kirleticileri gidermek için altın çipi 30 dakika boyunca bir UV ozon odasına yerleştirin.

Daha sonra, çipe destek sağlamak için plastik bir kapak ve çözeltiyi homojen bir şekilde karıştırmak için bir karıştırma çubuğu içeren bir test tüpünde 20 mililitre etanole 150 miligram 11-merkaptoundekanoik asit ekleyin. Çipi test tüpüne yerleştirin ve kapağını kapatın. Daha sonra tüpü beş dakika boyunca 50 watt ve 50 santigrat derecede mikrodalgada pişirin.

Etanol ile çipi durulayın ve beş dakika etanol içinde bekletin. Durulamayı tekrarlamak için su kullanın ve beş dakika bekletin. Bir karıştırma çubuğu içeren bir test tüpünde 20 mililitre suya 150 miligram 1-Etil-3-karbodiimid ekleyin.

Çipi test tüpüne aktarın ve gösterildiği gibi mikrodalgaya koyun. Çipi durulamak için su kullanın ve beş dakika suda bekletin. Daha sonra, bir karıştırma çubuğu ile bir test tüpünde 20 mililitre suya 150 miligram N-Hidroksisüksinimit ekleyin.

Çipi test tüpüne ekleyin, bir kapakla kapatın ve mikrodalgaya koyun. Çipi daha önce olduğu gibi duruladıktan ve suya batırdıktan sonra, 20 mililitre suya 250 mikromolar polietilen glikol ekleyin. Çipi ve mikrodalgayı ekleyin, ardından durulayın ve daha önce olduğu gibi suyla ıslatın.

Mililitre anti-rhGH antikor çözeltisi başına 15 mikrogram ve negatif kontrol olarak anti-IgG hazırlayın ve her birinden 10 mikrolitreyi 384 oyuklu bir plakada ayrı bir kuyucuğa ekleyin. Mikroarrayer'da lekelenme modelini tasarlayın ve 500 mikrometre, teflon uçlu bir pim ile çipi antikorlarla tespit edin. Benekli çipi oda sıcaklığında ve% 75 nemde iki saat boyunca inkübe edin.

SPRi deneyini kurduktan ve çipi metin protokolüne göre bloke ettikten sonra, PBS'de% 10 serum ve mililitre BSA başına bir miligram içeren aşağıdaki konsantrasyon setine sahip bir rhGH çözeltisi hazırlayın. Bu adımda seçilen bloke edici molekül tipini vurgulamak önemlidir. Amaç, spesifik olmayan etkileşimleri en aza indirmektir.

0.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde üç mikrolitre bir mikromolar streptavidin kaplı yakın kızılötesi kuantum noktasına bir mikrolitre altı mikromolar biyotin etiketli anti-rhGH tespit antikoru ekleyerek ikiye bir çözelti hazırlayın. Enjeksiyon döngüsüne 150 mikrolitre hGH çivili insan serumu çözeltisi enjekte edin. Sinyaldeki güçlü bir artışı, yüzeyden durulanan spesifik olarak bağlı olmayan serumdan yavaş bir düşüş izleyecektir.

Sinyal stabilize olduğunda, yüzeyi yıkamak için çalışan tampona eklenen 450 milimolar sodyum klorür çözeltisi kullanın. Çalışan tampon ile, anti-rhGH tespit antikorları ve kuantum noktalarının çözeltisini 10 nanomolar konsantrasyona seyreltin ve akış hücresine enjekte edin. Verileri bir veri çözümleme programına aktarın.

Daha sonra SPRi sinyalini zamana karşı çizin ve yüksek tuzlu yıkamadan sonra anti-rhGH ve negatif kontrol antikor noktaları arasındaki farkı belirleyin. ELISA'yı gerçekleştirmek için, reaktifleri, antikor kaplı kuyucukları ve standartları metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, rhGH hormonu örneklerini aşağıdaki konsantrasyonlarda% 10 insan serumunda hazırlayın. Her standarttan 50 mikrolitre ekleyin, kontrol edin ve her bir oyuğa üç nükte halinde numune alın.

Daha sonra kuyuları kapatın ve gece boyunca hafifçe çalkalayarak dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, plakayı çalkalayıcıdan çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Anti-rhGH HRP'yi, eşlenik tamponu, yıkama tamponunu, kromojen tetrametilbenzidin veya TMB'yi ısıtın ve reaktifi oda sıcaklığına durdurun.

Çalışma reaktiflerini hazırlamak için, anti-rhGH HRP'nin 40 katı seyreltme yapmak için eşlenik tampon kullanın. Yıkama tamponunu 200x seyreltmek için damıtılmış su kullanın. Her kuyucuğa 50 mikrolitre anti-rhGH HRP konjugatı ekleyin.

Kuyuları kapatın ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi kuyucuklardan boşaltın ve plakayı ters çevirin ve emici doku üzerinde kurulayın. Boşaltmadan önce her bir kuyucuğa 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tekrar kurulayın.

Yıkamayı üç kez tekrarlayın. Pipete güvenmek etkili olmadığından, aksesuar ajanları çıkarmak için 96 oyuklu plakaya dokunmak önemlidir. Daha sonra, yıkama adımını takip eden 15 dakika içinde her bir oyuğa 100 mikrolitre kromojen ekleyin.

Hafifçe çalkalayarak karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Renksiz çözeltiler maviye dönecektir. Her kuyucuğa 100 mikrolitre durdurma reaktifi ekleyin.

Çözeltiler maviden sarıya dönecektir. Her bir kuyucuğun emilimini hemen okumak için 450 nanometrede bir plaka okuyucu kullanın. Son olarak, sağlanan standartlar için standart eğriyi çizin, ardından rhGH'nin optik yoğunluğunu her bir numunenin konsantrasyonuna karşı %10 serum numunelerinde çizin.

Bu videoda, SPRi ve nano-SPRi'nin performansı, rhGH'nin tespiti için ELISA ile karşılaştırıldı. Bu şekil, %10 insan serumunda rhGH çivili titrasyon eğrisini temsil eder ve 450 nanometrede elde edilen OD'ye karşı çizilir. İyi bir doğrusal yanıt gözlendi ve tespit sınırının mililitre başına bir nanogram olduğu belirlendi.

Burada, rhGH'nin tespiti SPRi ile değerlendirildi. Konsantrasyon gradyan eğrisi üzerindeki her nokta, her konsantrasyon için üç SPRi kinetik eğrisinden hesaplanan yansıtma farkının ortalama değerini temsil eder. Tespit limiti veya LoD, mililitre başına 3.61 nanogram olarak belirlendi.

SPRi biyosensörünün hassasiyetini artırmak için, sensöre sırayla nano güçlendiriciler yerleştirildi. Bu deneyde, nano arttırıcılar biyosensör tepkisini% 7.9'a kadar yükselttiBununla birlikte, kontrolde minimum sinyal değişikliği ile. Nano-SPRi biyosensörünün uygulanabilirliği, rhGH aralığının mililitre başına 30.000 ila 0.25 pikogram ölçülmesiyle değerlendirildi.

LoD, mililitre başına 9.2 pikogram olarak hesaplandı ve varyasyon katsayısı %20 idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse doğrudan tespit için bir saat ve nano-SPRi için iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, her adım için koşulları optimize etmeyi unutmamak önemlidir ve bunu yaptıktan sonra sonuçlar daha kısa sürede kolayca yeniden üretilebilir. Bu prosedürü takiben, yakalanan molekül hakkında size ek bilgiler sağlamak için bir SPRi deneyinden sonra çoklu tüf, maspeck analizi gibi diğer yöntemler doğrudan çip üzerinde gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, tıbbi teşhis alanındaki araştırmacıların kanser, nörolojik ve kardiyovasküler bozukluklarla bağlantılı birden fazla biyobelirteçin aynı anda tespit edilmesini keşfetmelerinin önünü açmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, insan serumundaki hGH seviyelerinin tespiti için bir SPRi, bir nano-SPRi ve ELISA testinin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.