Spri, Nano-Spri ELISA Tahliller Kullanma Serum İnsan Büyüme Hormonu Karşılaştırmalı Analizi

Bu çalışmanın genel amacı, serumdaki biyobelirteçlerin tespitinde doğrudan ve amplifiye yüzey plazmon rezonans görüntüleme veya SPRi analizlerinin tanısal potansiyelini değerlendirmek ve bunu ticari olarak mevcut olan enzim bağlı immünosorbent antikor testi kitiyle doğrudan karşılaştırmaktır. Bu yöntem, bir hastalığın erken aşamasının vurgulanması ve terapötik etkinliğin izlenmesi için araçlar sağlanması gibi biyomedikal alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. SPRi'nin temel avantajı, sensör yüzeyine komşu kırılma indisi değişimlerini kaydederek biyomoleküler etkileşimlerin etiketsiz, gerçek zamanlı izlenmesine ve görselleştirilmesine olanak tanımasıdır.

Endojen hGH'nin insan büyümesini ve gelişimini etkileyen çok sayıda tıbbi bozuklukla ilişkili olması nedeniyle, bu tekniğin etkileri serumdaki hGH seviyelerinin teşhisine kadar uzanmaktadır. Biyochip yüzey kimyası hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu ve herhangi bir hatanın sonuçları büyük ölçüde etkileyebileceği göz önüne alındığında, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Çözeltileri ve protein örneklerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, altın çipi 50 °C'de 90 dakika boyunca sonikasyonla temizlemek için 120 mililitre stabilize edilmiş piranha çözeltisi kullanın.

Çipi durulamak için su kullanın ve su içerisinde beş dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Ardından çipi etanol ile durulayın ve kurutmak için azot akımı kullanın. Herhangi bir kontaminasyonu gidermek için altın çipi 30 dakika boyunca bir UV ozon odasına yerleştirin.

Ardından, çipe destek sağlamak için plastik bir kapağa ve çözeltiyi homojen bir şekilde karıştırmak için bir manyetik karıştırıcıya sahip bir deney tüpü içindeki 20 mililitre etanola 150 miligram 11-merkapto-undekanoik asit ekleyin. Çipi deney tüpüne yerleştirin ve kapağını kapatın. Daha sonra tüpü 50 watt ve 50 derece Celsius'ta beş dakika boyunca mikrodalgaya tabi tutun.

Çipi etanolle durulayın ve beş dakika boyunca etanolda bekletin. Durulama işlemini su ile tekrarlayın ve beş dakika boyunca bekletin. Bir karıştırma çubuğu içeren deney tüpündeki 20 mililitre suya 150 miligram 1-Etil-3-karbodimidil ekleyin.

Çipi test tüpüne aktarın ve az önce gösterildiği gibi mikrodalga fırında ısıtın. Çipi durulamak için su kullanın ve beş dakika boyunca suyun içinde bekletin. Ardından, bir manyetik karıştırıcı içeren test tüpündeki 20 mililitre suya 150 miligram N-Hidroksisüksinimid ekleyin.

Çipi deney tüpüne ekleyin, bir kapakla kapatın ve mikrodalga fırına yerleştirin. Çipi daha önce olduğu gibi durulayıp suda beklettikten sonra, 20 mililitre su içerisinde 250 micromolar polietilen glikolü bir manyetik karıştırıcı çubuğun bulunduğu deney tüpüne ekleyin. Çipi ekleyip mikrodalga fırına yerleştirin, ardından daha önce olduğu gibi suyla durulayın ve suda bekletin.

Mililitre başına 15 mikrogram anti-rhGH antikor çözeltisi ve negatif kontrol olarak anti-IgG hazırlayın ve her birinden 10 mikrolitre ekleyerek 384 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Mikroarray cihazında damlatma desenini tasarlayın ve 500 mikrometrelik teflon uçlu bir pin ile antikorları çipe damlatın. Damlatılan çipi oda sıcaklığında ve %75 nemde iki saat boyunca inkübe edin.

SPRi deneyini kurduktan ve yonga yüzeyini metin protokolüne uygun olarak bloke ettikten sonra, %10 serum ve 1 mg/mL BSA içeren PBS içerisinde, aşağıdaki konsantrasyon setine sahip bir rhGH çözeltisi hazırlayın. Bu adımda seçilen bloklama molekülünün türünü vurgulamak önemlidir; çünkü amaç, spesifik olmayan etkileşimleri en aza indirmektir.

0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne, bir mikromolar streptavidin kaplı yakın kızılötesi kuantum noktalarının üç mikrolitresine altı mikromolar biotin işaretli anti-rhGH saptama antikorlarının bir mikrolitresini ekleyerek ikiye bir oranında bir çözelti hazırlayın. Enjeksiyon döngüsüne hGH eklenmiş insan serum çözeltisinden 150 mikrolitre enjekte edin. Sinyalde güçlü bir artışı, yüzeyden yıkanan spesifik olmayan bağlı serum nedeniyle meydana gelecek yavaş bir düşüş takip edecektir.

Sinyal stabilize olduğunda, yüzeyi yıkamak için akış tamponuna eklenmiş 450 millimolar sodyum klorür çözeltisi kullanın. Anti-rhGH saptama antikorları ve kuantum noktaları çözeltisini akış tamponu ile 10 nanomolar konsantrasyona seyreltin ve akış hücresine enjekte edin. Verileri bir veri analiz programına aktarın.

Ardından SPRi sinyalini zamana karşı grafiğe dökün ve yüksek tuzlu yıkama işleminden sonra anti-rhGH ile negatif kontrol antikor lekeleri arasındaki farkı belirleyin. ELISA işlemini gerçekleştirmek için; metin protokolüne uygun olarak reaktifleri, antikor kaplı kuyucukları ve standartları hazırladıktan sonra, rhGH hormonu örneklerini %10 insan serumunda aşağıdaki konsantrasyonlarda hazırlayın. Her bir standarttan, kontrolden ve örnekten 50 µL'yi, her kuyucuğa üç paralel (triplicate) olacak şekilde ekleyin.

Ardından kuyucukları mühürleyin ve hafif çalkalama ile dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün plakayı çalkalayıcıdan çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Anti-rhGH HRP, konjugat tamponu, yıkama tamponu, kromojen tetrametilbenzidin veya TMB ve durdurma reaktifini oda sıcaklığına getirin.

Çalışma reaktiflerini hazırlamak için, anti-rhGH HRP'yi 40 kat dilüe etmek üzere konjugat tamponu kullanın. Yıkama tamponunu 200 kat dilüe etmek için distile su kullanın. Her kuyucuğa 50 µL anti-rhGH HRP konjugatı ekleyin.

Kuyucukları kapatın ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiyi kuyucuklardan süzün, plakayı ters çevirin ve emici bir kağıt üzerine vurarak kurulayın. Süzme ve tekrar kurulama işleminden önce, her kuyucuğa 200 µL yıkama tamponu ekleyin.

Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Pipete güvenmek etkili olmadığından, yardımcı ajanları uzaklaştırmak için 96 kuyucuklu plakaya hafifçe vurmak önemlidir. Ardından, yıkama adımını takip eden 15 dakika içinde, her bir kuyucuğa 100 microliter kromojen ekleyin.

Oda sıcaklığında, karanlıkta ve hafifçe çalkalayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Renksiz çözeltiler maviye dönecektir. Her bir kuyuya 100 microliters durdurma reaktifi ekleyin.

Çözeltiler maviden sarıya dönecektir. Her bir kuyucuğun absorbansını hemen okumak için 450 nanometrede bir plak okuyucu kullanın. Son olarak, sağlanan standartlar için standart eğrisini çizin, ardından %10 serum örneklerindeki rhGH'nin optik yoğunluğunu, her bir örneğin konsantrasyonuna karşı grafiğe dökün.

Bu videoda, rhGH tespiti için SPRi ve nano-SPRi'nin performansı ELISA ile karşılaştırılmıştır. Bu şekil, %10 insan serumuna eklenmiş rhGH'nin titrasyon eğrisini temsil etmekte olup, 450 nanometrede elde edilen OD'ye karşı grafiğe dökülmüştür. İyi bir lineer yanıt gözlemlenmiş ve tespit sınırı mililitrede bir nanogram olarak belirlenmiştir.

Burada, rhGH'nin tespiti SPRi ile değerlendirilmiştir. Konsantrasyon gradyan eğrisi üzerindeki her bir nokta, her konsantrasyon için üç SPRi kinetik eğrisinden hesaplanan yansıtıcılık farkının ortalama değerini temsil eder. Tespit sınırı veya LoD, 3,61 nanograms per milliliter olarak belirlenmiştir.

SPRi biyosensörünün hassasiyetini artırmak için sensöre sırasıyla nano-güçlendiriciler uygulanmıştır. Bu deneyde, nano-güçlendiriciler biyosensör yanıtını %7,9'a kadar artırmış; ancak kontrolde minimum sinyal değişimi gözlemlenmiştir. Nano-SPRi biyosensörünün uygulanabilirliği, 30.000 ile 0,25 picogram/mL aralığındaki rhGH miktarları ölçülerek değerlendirilmiştir.

LoD 9.2 picograms per milliliter olarak hesaplanmış ve varyasyon katsayısı %20 olarak belirlenmiştir. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde doğrudan tespit için bir saatte ve nano-SPRi için iki saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, her adım için koşulların optimize edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir; bu işlem yapıldıktan sonra sonuçlar daha kısa sürede kolayca tekrarlanabilir. Bu prosedürün ardından, yakalanan molekül hakkında ek bilgiler sağlamak amacıyla, bir SPRi deneyinden sonra çip üzerinde doğrudan multi-tuff, maspeck analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, tıbbi tanı alanındaki araştırmacıların kanser, nörolojik ve kardiyovasküler bozukluklarla ilişkili çok sayıda biyobelirtecin eş zamanlı tespitini araştirmalarının önünü açmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, insan serumundaki hGH seviyelerinin tespiti için bir SPRi, bir nano-SPRi ve ELISA analizinin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven ve koruyucu gözlük takılması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.