Name: COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin, COSMIC yöntemiyle hücrelerde DNA hedefleyen küçük moleküllerin genom çapında bağlanma profillerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, ilaç-DNA etkileşimlerini doğrudan ölçerek etki mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ansari laboratuvarı üyelerine ve Prof. Parameswaran Ramanathan'a yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri CA133508 ve HL099773, HI Romnes fakülte bursu ve AZA GSE'ye W. M. Keck Tıbbi Araştırma Ödülü, Biyokimya ve Moleküler Biyobilimler Bölümü'nden bir Peterson Bur GM07215 su tarafından desteklenmiştir. A.E., Morgridge Graduate Fellowship ve Stem Cell and Rejeneratif Tıp Center Fellowship tarafından desteklendi ve D.B., NSF'den NSEC hibesi ile desteklendi.

Canlı hücreler 1. Çapraz bağlanma, <ol><li> ~ 2.5x10 7 H1 hücreleri veya diğer kültür hücreleri ile başlayın. Not: H1 Bu hücre sayısı beş ila 10 cm&#39;lik kaplar (yaklaşık% 40 konflüans) karşılık gelir. </li><li> Pluripotent kök hücrelerin destekleyen bir yüzey üzerinde kaplı kaplar üzerinde E8 ortam hücreleri büyümek (Malzeme listesi bakınız) ve 5% CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe. Hasat hücreleri enzimatik (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Not: H1 hücreleri% 90 confluency aşmasına izin vermeyin; Birleşme sağlandığı H1 hücrelerin spontan farklılaşmasını indükler. Hücreleri saymak için, hücrelerin fazladan bir 10 cm&#39;lik çanak büyümek enzimatik olarak bölümlerde 1,8-1,10 açıklanan hücreleri kaldırın ve bir hemasitometre ile saymak. <ol><li> Chen ve diğerleri içinde tarif edilen E8 kültür ortamı hazırlayın. 54 </li></ol></li><li> Polyamid eklemeden önce bir vakum tuzak bağlı bir Pasteur pipeti ile geçirilerek kültür ortamını çıkarın. Olarak taze medya ekleerological pipet ve pipet verici (10 cm&#39;lik tabağı başına 8 mi) hazırlandı. NOT: Hücreler parçalanmadan kaçınmak için çanak tarafındaki ortam ekleyin. Bu noktadan itibaren prematüre fotoğraf çapraz bağlanmasını önlemek için ışıktan hücreleri korumak. </li><li> Doğrudan her çanak kültür ortamına bir pipet (DMSO içinde 400 uM poliamidin 8 ul, 400 nM nihai konsantrasyon) ile poliamid ekleyin. Ortama eşit poliamid dağıtmak için çanak girdap. Not: Konsantrasyon, çeşitli olabilir, ancak herhangi bir hücresel toksisite, seçilen işlem için gözlenen emin olabilir. </li><li> % 5 CO2 &#39;nin nemlendirilmiş bir atmosferinde hücreler 24 saat 37 ° C inkübe ve ışıktan korunmasını sağlamak. Not: Kuluçka süresi zaman içinde bağlanma poliamid ölçmek için değiştirilebilir. </li><li> 4 ml PBS (1.05 mM potasyum fosfat monobazik, 155,17 mM sodyum klorid, 2.97 mM sodyum fosfat dibazik) serolojik bir pipet ve pipet dis kullanılarak her 10 cm tabak yıkayınpenser. PBS aspire ve 3 ml E8 kültür ortamı ekleyin. </li><li> Işıkları sönük ile 5 kültür kaplarına kapağını kaldırın ve kaput dışında düz bir yüzeye yerleştirin hücreleri. L &lt;300 nm ile ışık filtrelemek için 5 kültür yemekleri üzerine bir cam filtre yerleştirin. Filtrenin üstünde UV kaynağını yerleştirin. Çapraz bağ örnekleri 365 nm UV ışımasına (2,4 mW / cm2) ile 30 dk. NOT: Zaman Crosslinking ampirik olarak tespit edilmelidir. </li><li> Geri kaput kültür kaplarına aktarın. Bir vakum tuzak bağlı bir Pasteur pipeti ile medya aspire. 4 ml PBS ile her biri 10 cm tabak yıkayın. PBS aspire. Hücreleri ayırmak için 10 cm&#39;lik tabak başına hücre ayrışma için 3 ml enzim (Malzeme Listesine bakın) ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. NOT: Do not enzimi önceden ısıtmak. </li><li> Çanak başına 3 ml E8 ortamı ile enzim söndürün. Transferi bir adet 15 ml konik tüp içine hücreleri ayrışmış. NOT: Bu noktadan itibaren buz üzerine yerleştirin hücreleri. </li><li> Centrifuge hücreler 5 dakika, 4 ° C &#39;de 500 xg ayrışmış. Süpernatant aspire enzim ve medyayı çıkarın. NOT: noktasını Pause. Hücreler, daha sonraki bir zamanda, takip eden işlemler için -80 ° C&#39;de saklandı, anında donduruldu sıvı azot içinde olabilir. </li></ol> Kromatin 2. izolasyonu <ol><li> 1,2 mi KOZMIK tampon ekleme (20 mM Tris-HCI [pH 8.1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 1 Triton-X100,% 0.1 SDS) ve yukarı ve aşağı pipet birkaç kez, her bir numunede, hücre pelletini için 1,2 mi KOZMIK tamponu. <ol><li> PMSF ve benzamidin ve pepstatin 1.5 uM 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar, taze 133 ul 100 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF) her biri, 100 mM benzamidin ve protez engelleyici pepstatin 150 uM ekleyin. İki amber 1.7 ml mikrosantrifüj tüpler içine hücre lizatının Bölünmüş çözüm. </li></ol></li><li> Sonikatör 35 dakika (10 sn, 10 sn kapalı,% 60 güç) ile sonikasyon 100 a arasına genomu parçalara içinnd 500 bp. <ol><li> Rezervuar su seviyesine Mikrosantrifüj tüpü paralel kromatin çözelti seviyesini muhafaza edin. Görsel muayene ile bu seviyeyi onaylayın. Not:., DNA% 1.5 agaroz jel ile kesilmiş olduğu teyit 55 </li><li> Ampirik sonication süresini optimize edin. Örnekleri chill rezervuar içinde buz az miktarda kullanın ve buz örnekleri ve fincan boynuz arasına engel olmadığından emin olun. </li></ol></li><li> Santrifüj Numune 12.000 xg 10 dk. Bir pipet yardımıyla yeni bir kehribar mikrosantrifüj tüp aktararak çözünür kromatin içeren sulu çözeltinin kaydedin. Pelet atın. </li><li> Yeni mikrosantrifüj tüp numune 110 ul (% 10) aktarın ve ona Girdi DNA etiket. -80 ° C saklayın. Adım 3.3 kullanılmak üzere buz üzerinde kromatin örnek kalanını kaydedin. </li></ol> Ligand-DNA çapraz bağların 3. Yakalama <ol><li> 60 ul streptavi dağıtmak için bir pipet kullanınBir mikrosantrifüj tüp manyetik boncuk din kaplı. 1 ml KOZMİK tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir nutator 5 dk karıştırın. Manyetik ayırma üzerindeki manyetik boncuk boncuk yakalamak için 2 dk raf yerleştirin. Bir pipet yardımıyla KOZMİK tamponu çıkarın. NOT: boncuk kurumasına izin vermeyin. Bir sonraki aşamada hemen geçin. </li><li> Kromatin örneği ekleyin (~ 1 ml) boncuk (60 ul) ve boncuklar tekrar süspansiyon. 4 ° C&#39;de dönen bir sallanan mikserde streptavidin kaplı manyetik boncuklar, en az 4 saat ile kromatin inkübe edin. Arzu edildiği takdirde örnekleri O / N inkübe edin. </li></ol> Afinite ile saflaştırılmış DNA izolasyonu 4. <ol><li> Spesifik olmayan etkileşimleri kaldırmak için aşağıdaki yıkama tamponları ile oda sıcaklığında 7 dakika ara ile boncuk yıkayın. Her yıkamadan sonra boncuk yakalamak için manyetik ayırma raf kullanın. Yıkama tamponunda her değişiklikten sonra boncuk süspanse. </li><li> Kullanımdan önce damıtılmış iyonu giderilmiş su ve filtre (0,2 um) yıkama tamponları hazırlayın. S için 4 ° C&#39;de saklayın, yıkama tamponları 1 ve 2everal aydır. Her gün Yıkama Tamponu 3 taze hazırlayın. Ekleme ve bir pipet ile numuneden yıkama tamponları kaldırın. 2 ve 4 için, yıkama sırasıyla, 1 ve 3 (5 mM) ilave edin. Örnekler ek olarak (bir kez 12 saat, 4 saat sonra) öncesinde aşağıda belirtilen yıkamalar COSMIC tampon ile iki kez yıkanabilir. <ol><li> Yıkama Tamponu 1 (10 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 1 mM EDTA,% 3 SDS) ile bir kez yıkanır. Yıkama Tamponu 2 (10 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 250 mM LiCI, 1 mM EDTA,% 0.5 NP40,% 1 sodyum deoksikolat) ile bir kez yıkanır. Yıkama Tamponu ile 3 kez yıkanır (4 M üre, 10 mM Tris-CI [pH 7.5], 1 mM EDTA,% 0.1 NP-40). Tris EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 1 mM EDTA) ile iki kere yıkayın. </li></ol></li><li> Bir pipet ile 200 ul TE tamponu boncuk tekrar. Yakalanan DNA Bu örnek afiniteyle saflaştırılmış (AP) DNA olarak adlandırılır. </li><li> 10x çapraz bağ Ters Tamponu (100 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 1 M KOH, 4 mM Giriş ve AP DNA EkEDTA) nihai konsantrasyon 1x. 56,57 inkübe 30 dakika 90 ° C&#39;de. Not: 254 nm UV ışınlaması da psoralen çapraz bağ, 58 ancak siklobutil pirimidin dimerleri bu dalga boyunda ışınlama oluşturulabilir ters ve DNA sonraki işlem müdahale etmek için kullanılabilir. </li><li> AP DNA, manyetik ayırma üzerine numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü bir pipet ile 2 oda sıcaklığında dk ve izolasyon sıvısı (DNA) raf yerleştirin. Yeni kehribar mikrosantrifüj tüp AP DNA (boncuk serbest olan) aktarın. Not: İstenilen AP DNA sıvısı içinde artık boncuklara bağlanır. </li><li> Bir pipet ile 100 ul numune başına yaklaşık 1 | il 6 N HCI eklenerek pH 7 konsantre HCI ile Giriş ve AP DNA nötralize. . Numuneler, bir pipet UYARI pH kağıdı üzerine ~ 0.5 ul eklenerek nötralize edilir onaylayın: Konsantre HCI güçlü bir aşındırıcı asittir. Kurumunuza göre Kolu217, uygun kişisel koruyucu ekipmanlar için s kurallar. </li><li> 0,2 ug RNaz A (100 mg / ml) ilave / Giriş ve AP DNA hem de nihai konsantrasyon ul. 37 ° C &#39;de 1 saat inkübe edin. 0,2 ug Proteinaz K (20 mg / ml) ilave / Giriş ve AP DNA hem de nihai konsantrasyon ul ilave edin. 55 ° C &#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> DNA sütun temizleme kiti ile DNA (Malzeme Listesi&#39;ne bakınız) arındırın. 55 Zehir DNA 58 ul DNA dereceli H 2 O. -20 Veya -80 ° C&#39;de saklayın Giriş ve AP örnekleri </li><li> Lokus spesifik primerler ve / veya yeni nesil dizileme ile birlikte kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından AP DNA analiz edin. 95 ° C, 10 dakika 1 döngü, 95 ° C 20 saniye 40 döngü, 54 ° C veya 56 ° C 20 sn, 72 ° C ile 40 saniye: qPCR için, aşağıdaki parametreler ile lokus için 2 ul AP DNA kullanılır. NOT: tavlama sıcaklığı kullanılan primer çiftleri erime sıcaklığına göre modifiye edilmelidir. Bir tavlama temperatu seçinBu yeniden hiçbir spesifik olmayan amplifikasyon ile kantitasyon döngüsünü en aza indirir. NOT: Yeni nesil dizileme ile analiz için okur eşlenen en az 10 milyon hedefliyoruz. Eşlenen sayısı AP DNA miktarını artırarak ve sekanslama için bir çalışma halinde daha az numune birleştirerek arttırılabilir okunur. Daha duyarlılığı artırmak okur. ChIP-seq analizi için standart paketler (örneğin, HOMER, 59 MACS, 60 ve SPP 61) KOZMİK seq verilerle çalışmak. Genom dizileme ve ChIP-seq dahil yeni nesil dizileme güvenmek diğer yöntemlerle, olduğu gibi, tekrarlayan bölgeler uyum ve montaj belirsizlikler yaratmak ve böylece bir teknik zorluk olmaya devam etmektedir. </li></ol>

AZA, Vista Motif, LLC ve WINStep Forward'ın tek sahibidir.

Konvansiyonel ChIP ile ilgili başlıca zorluklardan biri uygun antikorların tanımlanmasıdır. ChIP büyük ölçüde antikorun kalitesine bağlıdır ve çoğu ticari antikor ChIP için kabul edilemez. Aslında, DNA Elementleri Ansiklopedisi (ENCODE) konsorsiyumu, ticari antikorların yalnızca %20'sinin ChIP testleri için uygun olduğunu buldu. 50 COSMIC ile antikorların yerini streptavidin alır. Poliamidler biyotin ile işlevselleştirildiğinden, poliamid-DNA çapraz bağlarını yakalamak için bir antikor yerine streptavidin kull...

Bilgi, insan vücudunda her hücre DNA&#39;sında kodlanmış yapmak. Bu bilginin seçici olarak kullanımı, bir hücrenin kaderi yönetir. Transkripsiyon faktörleri (TF) genomunda genlerin özel bir alt ifade özel DNA dizilerine bağlanan proteinler, ve TFS arıza gelişimsel bozukluklar, kanser, ve diyabet gibi hastalıkların geniş bir dizinin başlangıcından bağlantılıdır . 1,2 Biz seçici genom bağlanan ve gen düzenleyici ağlar modüle moleküller geliştirmek isteyen olmuştur. Poliamidler N-metilpirol oluşan ve N, rakip doğal transkripsiyon faktörleri. 3-6 Bu moleküller DNA minör oyuk içinde oluşan özel dizilerine bağlanan özgüllükleri ve afiniteleri olan hedef DNA molekülleri olabilir metilimidazol rasyonel tasarlanmıştır. 4,5,7 -11 Polyamidler hem bastırmak için kullanılan ve spesifik g ifadesini aktive edilmişenes. 4,12-19 Ayrıca ilginç 20-24 anti-viral ve anti-kanser 12,13,25-30 özelliklere sahiptir. Poliamidlerin bir çekici özelliği 31,32 metillenmiş ve histon proteinleri 9,10,33 sarılı DNA dizilerini ulaşmak için yetenekleridir. DNA bağlama moleküllerinin kapsamlı bir birleşme spesifisitelerine ölçmek için, laboratuar, 34-39, in vitro özgüllükleri (genomescapes) dayalı bağlanma yerlerinin tahmini oluşum genomu üzerinde görüntülenebilir. Kognat Alanı tanımlayıcısı (CSI) yöntemini yarattığı için in vitro bağlanma şiddetleri dernek sabitleri ile doğru orantılıdır (K a). 34,35,37 Bu genomescapes genom boyunca poliamid doluluk içgörü sağlar, ancak canlı hücrelerde bağlanmasını ölçme poliamid bir meydan okuma olmuştur. DNA, sıkı bir şekilde bağlanma sitelerinin erişilebilirliğini etkileyebilir çekirdek içinde paketlenir. Birpoliamidlere bu chromatinized DNA dizilerinin ccessibility bir gizem kalıyor. Son zamanlarda, birçok yöntem ortaya çıkmıştır küçük moleküller ve nükleik asitler arasındaki etkileşimleri incelemek için. 40-48 kimyasal afinite yakalama ve kitlesel paralel DNA dizileme (kimya-seq) böyle bir tekniktir. Chem seq ligand-hedef etkileşimi yakalamak için ilgi konusu bir genomik hedef ve ilgi konusu bir küçük molekülün, bir biyotinile türevine küçük moleküller çapraz bağlanması için formaldehit kullanır. 48,49 Formaldehit çapraz bağlama hata üretebilirken dolaylı etkileşimleri yol açar. 50 Yeni bir yöntem, küçük moleküllerin çapraz bağlama olarak adlandırılan bu &quot;hayalet&quot; tepe ortadan kaldırmak için bir foto çapraz bağlayıcının ile kromatin (KOZMIK), 51 izole etmek için. 50 başlamak için geliştirilen biz tasarladık ve poliamitlerin üç işlevli türevleri sentezlendi. Bu moleküller, bir DNA-bağlama pol ihtivayamide bir Foto çapraz bağlayıcı (psoralen) ve bir afinite kolu (biotin, Şekil 1). Üç işlevli poliamidler ile, kovalent. 365 nm UV ışıması, DNA hasarı ya da olmayan psoralen-esaslı çapraz bağlanmasını yol açan bir dalga boyuna sahip poliamid-DNA etkileşimlerini yakalayabilir 51 Sonra, katı, yarı altında çekilen DNA genom fragman ve saflaştırmak -denaturing koşulları kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan DNA azaltmak için kullanılır. Böylece, kimya-SEQ ilişkin bir yöntem olarak KOZMIK görebilir, ancak DNA &#39;nın daha doğrudan bir okuma ile hedeflenmesi. Önemli bir şekilde, zayıf (K 10 3 -10 4 M-1) DNA için psoralen afinitesi yapar saptanabilir etki poliamid spesifikliği. 51,52 zenginleştirilmiş DNA fragmanları kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ya da 51 ile analiz edilebilir (kozmik qPCR) ya da yeni nesil dizileme 53 (COSMIC-seq) tarafından. Bu veriler ligandların tarafsız bir genom güdümlü tasarım etkinleştirmek arasıOnların arzu genomik loci ile hareket ve hedef dışı etkilerini en aza indirmek. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Şekil 1. Biyoaktif poliamidler ve KOZMİK düzeni. (A) Firkete poliamitler 1-2 hedef DNA sekansı 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Lineer poliamidler 3-4 hedef 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. N-metilimidazol Rings netlik için kalın edilmektedir. Açık ve dolu daireler sırasıyla N-metilpirol ve N-metilimidazol temsil etmektedir. Kare 3-klorotiofen temsil eder ve elmas β-alanin temsil etmektedir. Psoralen biotin, sırasıyla, P ve B ile temsil edilir. (B) KOZMİK düzeni. Hücreler Poliamidlerin üç işlevli türevleri ile muamele edilmektedir. 365 nm UV ışınlama ile çapraz sonra, hücreler l vardırysed ve genomik DNA &#39;kırılır. Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar, poliamid-DNA adüktleri yakalamak için ilave edilir. DNA serbest bırakılır ve kantitatif PCR (qPCR) veya yeni nesil dizileme (NGS) tarafından analiz edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td> <td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-023</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissosiyasyon Reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Diğer DNA sütunu üreticilerini başarıyla denedik.</td></tr><tr><td>TruSeq ChIP Numune Hazırlama Kiti</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Bu Kit, yeni nesil dizileme için COSMIC DNA hazırlamak için kullanılabilir</td></tr>. <tr><td>Matrigel Temel Membran Matrisi</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>H1 ESC'leri büyütmek için plakaları kaplamak için kullanılır</td></tr>, <tr><td>pH kağıdı</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kehribar mikrosantrifüj tüpleri</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpü</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pyrex filtresi</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td>Pyrex pişirme kapları uygundur</td></tr><tr><td>qPCR ana karışımı</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td> <td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm doku kültürü kapları</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nutator</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik ayırma rafı</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV kaynağı CalSun</td><td></td><td>B001BH0A1A</td><td>Diğer UV kaynakları kullanılabilir, ancak çapraz bağlama süresi ampirik olarak optimize edilmelidir</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000, 431C1 fincan boynuzlu</td><td>Diğer sonikatörler kullanılabilir, ancak sonikasyon koşulları ampirik olarak optimize edilmelidir</td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş CO2 inkübatör</td><td>herhangi bir kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr>Herhangi <td>bir kaynaktan</td><td></td><td></td> <td>vakum çıkışlı biyolojik güvenlik kabini</td></tr></tbody></table>

cosmic ile hücrelerde İlaç-dna etkileşimlerinin genom haritalama (küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını kromatin yalıtmak için)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genom en etkili kemoterapötik bazı hedef, ancak bu ilaçların en doz sınırlayıcı toksisite ve çok sayıda olumsuz yan etkilere neden DNA sekansı özgüllük yoksundur. Diziye özgü küçük moleküller ile genom hedefleme artan terapötik indeksi ve daha az hedef dışı etkileri olan molekülleri sağlayabilir. N-metilpirol / N-metilimidazol poliamidler rasyonel mükemmel hassasiyetle spesifik DNA dizileri hedeflemek için tasarlanmış olabilir moleküllerdir. Ve en doğal transkripsiyon faktörleri farklı olarak, polyamidler afinite kaybı olmaksızın metil ve chromatinized DNA&#39;ya bağlanabilir. Poliamidlerin dizisi özgüllüğü yoğun aynı kökenli yerinin tanımlanması (CSI) ile in vitro olarak, geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlarla ele alınmıştır, ancak hücrelerin genomik hedeflere bağlanabilen poliamidin çalışması zor olmaya devam etmektedir. Bir yöntemi rapor Burada, küçük moleküllerin çapraz bağlama için isolate kromatin (KOZMIK), genom çapında polyamid bağlanma yeri tanımlar. KOZMIK kromatin immunoprecipitation (chip) benzer olmakla birlikte, iki önemli noktada ayrılır: olarak bir foto çapraz seçici zamansal kontrollü polyamid bağlanma olgularının yakalama ve (2) biotin afinite kolu poliamid saflaştırmak için kullanılır sağlamak için kullanılır (1) Yarı denatüre edici koşullar altında a-DNA konjügatları kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan DNA azaltmak için kullanılır. KOZMIK poliamitler ve diğer genom hedefleme kemoterapötik ajanların genom bağlayıcı olayları ortaya çıkarmak için kullanılan bir genel bir stratejidir.

Düzgün olmayan genom parçalanma ve diğer değişkenler hesaba katılması için, saflaştırılmış DNA daima Girdi DNA referans karşı normalize edilmelidir. Ilgi odağı özgü primerler kullanılabilir. Aynı zamanda, negatif bir kontrol olarak, bir molekül bağlamak beklenmemektedir bir bölgeyi analiz etmek için yararlıdır. Bu 365 nm ışık (Şekil 2) ile radyasyona tabi tutulduktan sonra poliamid doluluk bir&gt; 100-misli bir artış görülür. Zenginleştirilmiş DNA, aynı zamanda, yeni nesil d...

Genom hedefleme moleküllerinin doğrudan hedefleri belirlenmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. DNA bağlama molekülleri genomu meşgul anlamak için, kromatin izole etmek için küçük moleküllerin çapraz bağlama dayanan bir yöntem (COSMIC) geliştirdi.

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Bu prosedürün genel amacı, poliamidlerin ve diğer DNA hedefli küçük moleküllerin hücrelerdeki genom genelindeki bağlanma profillerini belirlemektir. Bu yöntem, DNA hedefli moleküllerin tasarımına rehberlik etmek için genomu kullanarak ilaç DNA kimyası alanının ilerlemesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genom üzerinde etkili olan ligandların etki mekanizmasına dair bilgi sağlamak amacıyla, doğrudan ligand-DNA etkileşimlerinin ölçülmesidir.En başarılı terapötik ajanların bazıları, DNA'ya bağlanan ve genomik işlemlere müdahale eden küçük moleküllerdir. Bu yöntem poliamidleri incelemek için geliştirilmiş olsa da, DNA hedefli diğer molekül sınıfları için de uygulanabilir. Bu deney için hücreler, 10 cm'lik kaplarda, pluripotent kök hücreleri destekleyen yüzey kaplaması ile birlikte, %5 karbondioksit içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de E8 Medyumunda büyütülür.Poliamid eklemeden önce, kullanılmış kültür ortamını uzaklaştırın ve her 10 cm'lik kap için 8 ml taze ortam ekleyin. Bu noktadan itibaren, erken fotokroslinklenmeyi önlemek için hücreleri ışıktan koruyun. Bir pipet kullanarak poliamidi her kabın kültür ortamına doğrudan ekleyin.Poliamid maddesinin besiyeri içinde eşit şekilde dağılması için tabağı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, ışıktan korunaklı bir şekilde 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her bir 10 cm'lik tabayı serolojik pipet ve pipet dispenseri kullanarak 4 ml PBS ile yıkayın.PBS'yi aspire edin ve 3 ml E8 kültür medyumu ekleyin. Işıklar kısılmışken hücreleri çekerlecenin dışında düz bir yüzeye yerleştirin ve beş kültür kabının kapaklarını çıkarın. 300 nanometreden küçük dalga boyundaki ışığı süzmek için beş kültür kabının üzerine cam bir filtre yerleştirin.UV kaynağını filtrenin üzerine yerleştirin. Örnekleri 365 nanometre UVA radyasyonu ile 30 dakika boyunca çapraz bağlayın. UVA radyasyonunun ardından kültür kaplarını tekrar steril kabine aktarın.Vakum tuzağına bağlı bir pasteur pipeti ile medyumu aspire edin ve her 10 cm'lik tabağı 4 ml PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 10 cm'lik tabak başına 3 ml hücre disosiasyon enzimi ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Her kap için 3 ml E8 Medyumu kullanarak enzimi etkisiz hale getirin. Ayrıştırılmış hücreleri bir adet 15 ml'lik konik tüpe aktarın. Bu aşamadan itibaren hücreleri buz üzerinde bekletin.Ayrıştırılan hücreleri 500 x g'de ve 4 degrees Celsius'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Enzimi ve medyumu uzaklaştırmak için süpernatanı aspire edin. Kromatin izolasyonu prosedürüne başlamak için taze proteaz inhibitörleri ile kozmik tamponu hazırlayın.Bazal kozmik tampona taze olarak 100 millimolar PMSF, 100 millimolar benzamidin ve 150 micromolar pepstatin proteaz inhibitörlerinden 12,1 microliter ekleyin. Hücre peletine 1,2 ml kozmik tampon ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekin. Ardından hücre çözeltisini iki adet kehribar renkli 1,7 ml mikro-santrifüj tüpüne paylaştırın.Genomu 100 ile 500 baz çifti arasındaki boyutlara fragmente etmek için bir sonikatör ile sonikasyon uygulayın. Mikro santrifüj tüpündeki kromatin çözeltisinin seviyesini, rezervuardaki su seviyesiyle paralel tutun. Bu seviyeyi görsel inceleme ile doğrulayın.Sonikasyon süresi ampirik olarak optimize edilmiştir; %60 güçte, 10 saniye açık ve 10 saniye kapalı olacak şekilde 35 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Numuneleri soğutmak için hazneye minimum miktarda buz koyun ve buzun numuneler ile kupa probu (horn) arasında engel teşkil etmediğinden emin olun. Sonikasyon tamamlandığında, numuneyi 12 000 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Çözünür kromatin içeren sulu çözeltiyi yeni bir kehribar renkli mikro santrifüj tüpüne aktararak saklayın. Pelleti atın. Numunenin 110 µL'sini veya %10'unu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.'Giriş DNA'sı' olarak etiketleyin ve 80 degrees Celsius derecede saklayın. Kromatin örneğinin geri kalanını, bu protokolün sonraki adımlarında kullanmak üzere buz üzerinde saklayın. Ligand-DNA çapraz bağlarını yakalamak için, Kromatin örneğinin geri kalanını streptavidin kaplı manyetik boncuklara ekleyin ve karışımı yeniden süspande edin.Kromatini boncuklarla birlikte 4 derece Celsius'ta, döner sallamalı bir karıştırıcı üzerinde en az dört saat boyunca inkübe edin. Gerekli yıkama tamponu, distile deiyonize su ile hazırlanmalı ve kullanmadan önce 0,2 mikrometre filtre ile süzülmelidir. Tampon 1 ve 2, 4 derece Celsius'ta birkaç ay boyunca saklanabilir ancak Tampon 3 her gün taze olarak hazırlanmalıdır.Kromatinin streptavidin kaplı manyetik boncuklarla inkübasyonu tamamlandığında, örneği yıkama tamponu 1 ile yedi dakika boyunca yıkayın. Boncukları yakalamak için örneği manyetik bir ayırma rafına yerleştirin ve yıkama tamponu 1'i uzaklaştırın. Yıkama tamponu 2 ekleyin ve 7 dakika daha yıkayın.Ardından, yıkama başına yedi dakika olacak şekilde yıkama tamponu 3 ile iki kez yıkayın. Son olarak, TE Tamponu ile iki kez yıkayın. Son TE Tamponu yıkamasından sonra, boncukları 200 µL TE Tamponu içinde yeniden süspande edin.Yakalanan bu DNA örneği, afinite ile saflaştırılmış veya AP DNA olarak adlandırılır. Ardından, giriş DNA'sını ve AP DNA'sını, final konsantrasyonu 1x olacak şekilde 10x çapraz bağ geri dönüş tamponu ile destekleyin. 90 °C'de 30 dakika boyunca inkube edin.AP DNA içeren mikro santrifüj tüpünü oda sıcaklığında iki dakika boyunca manyetik ayırma rafına yerleştirin, ardından AP DNA içeren sıvıyı yeni bir kehribar renkli mikro santrifüj tüpüne aktarın. Input ve AP DNA'yı nötralize ettikten sonra, her iki DNA örneğine son konsantrasyonu 0.2 µg/µL olacak şekilde RNase A ekleyin. 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Bir saat sonra, Proteinase K'yı hem Girdi DNA'sına hem de AP DNA'sına 0,2 µg/µL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. 55 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, Girdi ve AP DNA'ları bir DNA kolonu temizleme kiti ile saflaştırılır ve DNA dereceli su ile elüe edilir.DNA'yı analiz için hazır olana kadar 20 veya 80 santigrat derece sıcaklıkta saklayın. Afinite ile Saflaştırılmış DNA, her zaman bir Giriş DNA referansına göre normalize edilmelidir. Lokusa özgü primerler kullanılarak gerçekleştirilen kantitatif PCR'dan elde edilen temsili sonuçlar, 365 nanometre ışıkla ışınlama sonrası poliamid doluluğunda 100 kattan fazla artış olduğunu göstermektedir.Zenginleştirilmiş DNA, yeni nesil sekanslama ile de analiz edilebilir. Sekanslama işlemi tamamlandıktan sonra, ham DNA okumaları genomla hizalanır ve yoğunluk izleri hazırlanır. Bu örnek, AAG tekrelerini hedeflemek üzere tasarlanan Lineer Poliamid 4'e ait yoğunluk izini göstermektedir.Hücrelerdeki poliamid dağılımlarının analizi, geniş bir afinite aralığına yayılan kümelenmiş bağlanma bölgelerinin hücrelerdeki doluluğu en iyi şekilde öngördüğünü ortaya koymuştur. İn vitro kognat bölge tanımlama verileri kullanılarak, tüm genomun bağlanma skorlarını hesaplayan bir algoritma geliştirilmiştir. Bu keman grafikleri, Polyamide 2 ve Polyamide 4 bağlanması için tüm genom boyunca öngörülen skorları göstermektedir.Poliamid 4 için temsilci genom manzaraları da gösterilmiştir. Bu skorlama yöntemi, düşük ve orta afiniteye sahip birden fazla dizinin bulunduğu lokusların, yüksek afiniteye sahip az sayıda dizinin bulunduğu lokuslarla benzer poliamid doluluk oranı gösterdiğini ortaya koymuştur. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde iki gün içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, DNA saflaştırılana kadar örnekleri ışıktan korumanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, bağlanmanın gen ekspresyonu üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için RT-PCR ve RNase C gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, poliamidlerin genom genelindeki bağlanma profillerini haritalamak için cosmic'in nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

genome-wide-mapping-drug-dna-interactions-cells-with-cosmic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.

Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Biz yüksek verimlilik sıralama (DamID seq) DNA adenin metiltransferaz kimlik (DamID) bağlanması burada bir tahlil açıklar. Bu geliştirilmiş bir yöntem daha yüksek çözünürlüğü ve daha geniş bir dinamik aralığı ve karşılaştırın vb ChIP-SEQ RNA-SEQ gibi diğer yüksek verimli sekanslama verileri ile birlikte DamID seq verileri analiz...

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) tarafından tanımlanan kodlamayan varyantların işlevsel etkilerini üç boyutlu kromatin etkileşimleri kullanarak belirlemek için bir protokol sayılmiyoruz.

Kromatin Konfigürasyonunun Hesaplamalı Analizini Kullanarak Alzheimer Hastalığı Varyantlarının Hedef Genlerine Haritalanması

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Genom çapında kromozom konformasyon yakalama yöntemi Micro-C-XL kullanılarak üç boyutlu genom organizasyonunu nükleozom çözünürlüğü ile haritalamak için bir protokol burada sunulmaktadır.

Memeli 3D Genom Etkileşimlerinin Micro-C-XL ile Haritalanması

Doğal γH2A.X kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yoluyla yaygın kırılgan bölge kırılmalarını tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleriyle ilişkili hem zamanı hem de işçiliği önemli ölçüde azaltırken, sonuçların yüksek tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini korur.

Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Keşfedin, COSMIC yöntemiyle hücrelerde DNA hedefleyen küçük moleküllerin genom çapında bağlanma profillerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, ilaç-DNA etkileşimlerini doğrudan ölçerek etki mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için) (Video) | JoVE Journal

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

Daha fazla video keşfet