Name: Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana hipokotillerinde tropik yanıt sırasında kalloz aracılı plazmodesmal geçişi düzenleyen genleri tarama yöntemini. Bu teknik, bitki hücreleri arası sinyalleşme mekanizmalarını anlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-2015R1A2A1A10053576) tarafından desteklenmiştir ve Nesil BIOGREEN 21 Programı&#39;nın bir hibe ile (SSAC, PJ01137901 hibe), Kırsal Kalkınma İdaresi, Kore Cumhuriyeti. RK, WS, ABB ve DK Beyin Kore 21 Artı programında (BK21 +) tarafından desteklendi.

Değiştirilmiş phototropic ve Gravitropic Cevaplarının ile Mutants 1. Eleme <ol><li> Deney öncesinde% 0.8 Agar Bir Gün ile 1x Murashige ve Skoog (MS) Orta, pH 5.7, hazırlayın. <ol><li> 2 L&#39;lik konik bir şişe, çift damıtılmış 800 ml su eklenir ve bir manyetik çubuk ile karıştırıldı. </li><li> erlene MS tuzu 4.4 g ekleyin. </li><li> 2- (N-Morfolino) etan sülfonik asit (MES), 0.5 g ekleyin ve tuzlarının tüm tamamen çözülene kadar karıştırın. </li><li> 1 M KOH ile 5.7 ortamın pH ayarlayın. </li><li> Bir kitle silindire orta aktarın ve GKD 2 O. ile 1 L son hacim getirmek </li><li> 2 L&#39;lik bir erlene maddeyi tekrar geri dökün ve bitki ağarı 8 g ekleyin. </li><li> alüminyum folyo ile sıkıca erlene ağzını sarın. </li><li> 121 ° C, 15 psi, 15 dakika boyunca MS ortamı ve GKD 2 O Otoklav ve otoklav sonrası, 60 ° C inkübatör ve oda sıcaklığında GKD 2 O orta tutmak. </li><li> 60 ° C&#39;ye soğutulduktan sonra, bir laminar akış tezgahı 125 x 125 x 20 mm3 kare plakalara orta (her plakada 50 mi) dökün. </li><li> Agar plakaları kısmen açık tutarak, yaklaşık 1 saat boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. Plakalar hemen kullanılmazsa, bir buzdolabında 4 ° C&#39;de plastik wrap ve mağaza kullanarak bunları mühür. </li></ol></li><li> % 1.1 sodyum hipoklorit ile tohum yüzey sterilize ve bölüm 1.1 hazırlanmıştır 1x MS agar plaklarına tohumları nokta. Not:. Burada, Arabidopsis thaliana {Col-0 tohum, dsGSL8 (Col-0)} 15 tropik yanıtı, kaloz boyama ve HPTS yükleme Arabidopsis thaliana {Col-0 ve dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} tohumlar (kullanılmaktadır ) yayınlanmamış, Şekil 2&#39;de tropik karşılık kullanılmaktadır. <ol><li> Bir şişe GKD 2 O 300 ml otoklavlayın. </li><li> Her arka plan yaklaşık yüz tohum ekleme, yanimutant / aşırı ifadesi hattı ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne vahşi tip (Col-0) tohumlar,. </li><li> 4 ° C buzdolabından 1x MS agar çıkarın ve kısmen açık pozisyonda laminer akış bankta onları kurutun. </li><li> Bir 0.2X çamaşır suyu (% 1.1 sodyum hipoklorit) 1 ml ekleyerek, tohumların yüzey sterilize edilir ve 5 dakika boyunca 250 rpm&#39;de çalkalayıcı üzerinde mikrosantrifüj tüpleri tutun. </li><li> tohumlar yerçekimi tarafından dibe ve sonra mikropipet ile çamaşır suyu kaldırmak edelim. </li><li> Tohum taze GKD (otoklav) 2 O 1 ml ilave edilir ve mikrosantrifüj tüpü birkaç kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. tohumlar yeniden yerleşmek ve ardından su çıkarmak edelim. </li><li> Adımı tekrarlayın 1.2.6 5-6 kez. </li><li> Son yıkamadan sonra bırakıldı tohumların su hacmi iki katı ekleyin. </li><li> Nokta tohumları 200 ul ihtiva eden 1 ml&#39;lik bir mikropipet ucunu kullanarak bir yarı kurutulmuş 1x MS agar plakası üzerine sterilize edilmiş tohumlar (bölgesindekicluding su). <ol><li> İki tohum ve iki tohum sıraları arasındaki 1.8 cm minimum arasında yaklaşık 0.1 cm mesafe bırakınız. Kare plaka (125 x 125 x 20 mm 3) başına beş yatay satırlardaki tohumları nokta. Su plakası üzerine kapağı yerleştirmeden önce hafifçe kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> Cerrahi bant ile plakaları mühür dikey plakaların her yığını ve alüminyum folyo ile sarın. </li><li> (Işık erişimi olmayan) bir karanlık kutuya sarılmış plakaları aktarın. Ardından, 3 gün boyunca 4 ° C oda / buzdolabında karanlık kutu tutmak. </li><li> Bu adımdan başlayarak, değişmeden plakaların yönde tutmak. soğuk tedavi için 3 gün sonra, bir sonraki 3 gün boyunca 22 ° C&#39;de, bir bitki kültür odası içinde karanlık kutu tutmak. 3 gün sonra, karanlık bir odada yeşil ışık altında tohumlarının çimlenme durumunu kontrol edin. NOT: Genellikle 3 gün eski Col-0 solmuş fidan uzunluğu 1.6 cm&#39;ye kadar büyüyebilir. </li></ol></li><li> değişmiş phototropic a analizBelirli bir genin hatları mutantlar veya aşırı ekspresyonu ND gravitropic yanıt. Karanlık bir odada yeşil ışık altında sadece benzer büyüklükteki ve dikey yetiştirilen düz fide seçin. steril kürdan ucu kullanarak taze 1x MS agar plaka seçilen fidan aktarın. <ol><li> Yavaşça herhangi diğer parçaları dokunmadan kendi hipokotil en alt kısmında gelen fidan seçin. fide hepsi aynı kotiledon / kanca yönünü olduğundan emin olun ve aktarıldıktan sonra, fide kanca yönelimi aynı kalır. Her sırada bulunan her bir arka plan ve daha fazla analiz için her bir zaman noktası için iki levha, en az 20 fide az kullanın. Not: Dört farklı geçmişlere her plaka (4 satır) mukayese edilebilir. deksametazon (dex) -inducible RNAi / aşırı ifadesi hatları kullanırken, bir 1x MS yukarıdaki fidan aktarmak (1x MS içeren levha,% 0.8 ağar ortamı 20 uM dex ile desteklenmiş) fo + Dex MS plakası ile birlikte plaka: Opsiyonelr 3 saat ve karanlık kutu dikey plakaları tutun. </li><li> phototropic yanıtı kontrol etmek için, açılan sadece bir tarafı ile birlikte bir kara kutu dikey olarak yukarıdaki plakaları aktarın. Tek taraflı beyaz ışık ile bir bitki büyüme odasına plakaları içeren kara kutu aktarın. tek taraflı ışık sağlamak için, ışık kaynağından (değil ön taraf) doğru plakanın kenarı yerleştirin. Şekil 1&#39;de kurulum bakınız. </li><li> Benzer bir şekilde, gravitropic tepki kontrol dikey transfer fide ile plakaları tutmak ve alüminyum folyo ile kaplayın. Sonra, 90 ° dikey plaka yönünü değiştirmek ve her taraftan kaplı siyah kutu içinde saklayın. Şekil 1&#39;de kurulum bakınız. </li><li> Verilen zaman noktalarında sonra (genellikle 1.5 saat, 3 saat, 6 saat ve 12 saat) bir tarayıcı ile plakaları tarama ve JPEG formatında resim kaydedin. </li><li> (Şek ImageJ yazılımı (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) kullanarak fide eğilme açısını ölçmekure 2). <ol><li> Çift tıklayarak (Şekil 2A) tarafından ImageJ programını başlatın. Not: açı ölçümü kullanılan önemli araçlar Şekil 2B&#39;de de gösterilmiştir. </li><li> Alt seçeneği &quot;açık&quot; ImageJ araç çubuğunda ve tropik bükme açısını (Şekil 2C) ölçmek için JPEG dosya biçiminde kaydedilmiş açık resimlerin ardından &quot;Dosya&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> Sol ya da sağ fare butonuna tıklayarak, sırasıyla Şekil 2B&#39;de gösterildiği resmin üzerine yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için büyüteç aracını tıklatın. </li><li> Resmi (Şekil 2B) .Next sürüklemek ve konumlandırmak için kaydırma aracını tıklatın (Şekil 2E) eğilme açısını ölçmek için açı aracını tıklayın. <ol><li> Orijinal hipokotil büyüyen yön noktası &#39;a&#39;, eğilme başlangıç ​​noktası &#39;b&#39; (Şekil 2F), fareyi sürükleyin ve sol popo tıklayın üzerinde çift sol tıklama yapınilk satırı (Şekil 2G) çizmek için. </li><li> Bükülme ucu noktasının &#39;c&#39; gelin b fareyi sürükleyin ve ikinci satırı (Şekil 2H) çizmek için sol düğmesini tıklayın ve sabit bir formu <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. Not: Gerçek bükme açısı <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> 180 ° eşittir B, - <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. (Şekil 2F). </li><li> Ölçü ve kayıt <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> klavyede &#39;M&#39; tuşuna basarak bir. Şekil 2I gösterildiği gibi sonuç dosyası ayrı ayrı açılacaktır. Tedbir ve tek fideleri biri tüm kaydedin. Örneğin, ilk olarak mutant hatlar için daha sonra Col-0 arasından Hipokotillerin tüm bükülme açısı ölçümü ve. </li></ol></li></ol></li><li> av yapmak için tablo dosyasına ImageJ gelen veri kümesi transferHer bir arka açıları bükülme talaması. </li><li> Kantitatif analiz için, standart hata çubukları ve olasılık değerleri (Bakınız Şekil 2) de dahil olmak üzere istatistiksel test sonuçları, bir çubuk grafik şeması yapmak. <ol><li> Gerçek eğilme hesaplayın <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B ve, yani, tablo kullanarak bir formül tasarım <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B = 180 ° - <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> Bir not: <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A ImageJ analizinden elde edilen değerdir. </li><li> Ortalama eğilme açısını ölçmek <img alt="açı" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> Her arka plan kullanarak tablo araçları (Şekil 2J) B. </li><li> Tablo &quot;formüller&quot; aracını (Şekil 2J) kullanarak her ölçüm için çoğaltır arasındaki standart sapmayı analiz eder. </li><li> SIG testOrtalama eğilme açısı ve yukarıda da belirtildiği gibi hesaplanan standart sapma değerleri t-testi uygulanarak sonuçların anlamlılığını. </li><li> Grafiksel tablo &quot;insert&quot; aracını (Şekil 2K) kullanarak iki farklı geçmişlere arasında bükülme açısı nicel farklılığı temsil için yukarıdaki değerleri kullanarak bir çubuk diyagramı çizin. Not: güçlü bir aday genlerin Mutant / aşırı ifadesi hatları hızlı eğilme veya yavaş eğilme gibi hiçbir eğilme olarak vahşi tip göre belirgin farklılıklar, gösterecektir. </li></ol></li></ol></li></ol> Bir Değiştirilmiş PD kaloz Düzeyi nedeniyle PD SEL Değişiklik Arızalı Tropic Tepkilerin 2. Ekran Bitki Hatları <ol><li> HPTS Agaroz Blokları ile Fidan Top 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) Boya Yükleniyor bir Hipokotil Yükleme Testi gerçekleştirmek ve Mutant Arasında Dye Hareketi karşılaştırın / Aşırı ifade Hatları ve Col-0. <ol><li> HPTS Agaró hazırlayınhipokotil Yükleme deneyi için se blokları. <ol><li> 50 ml konik bir şişe içinde GKD 2 O 10 ml alın ve bir% 1 agaroz jeli hazırlamak için 0.1 g agarozun ekleyin. arada çalkalanarak 1-2 dakika boyunca bir mikrodalga fırın içinde agaroz kaynatılır ve 5 dakika boyunca soğumaya bırakın. </li><li> % 1 agaroz çözeltisi 10 ml HPTS 50 mg ekleyin ve çözelti yeşil oluncaya kadar karıştırın. </li><li> 10 mm Petri kabı, yukarıda dökün ve 15 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> Küçük agaroz blokları (0.5 x 2 cm 2) yapmak için keskin bir diseksiyon bıçak ile agaroz katılaşmış HPTS kesin. </li></ol></li><li> HPTS boya yükleme deneyi için bitki örneklerini hazırlayın. <ol><li> HPTS boya yükleme deneyi için bir platform ayarlayın; Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, yeni bir MS ortamı plaka üzerinde mikroskop kapak slayt (24 x 50 mm2) yerleştirin. </li><li> Bir keskin cerrahi makas kullanarak kanca tabanından tüketim 3 gün eski solmuş fidanları. </li><li> Hemeneksizyon konumundan hipokotil sadece 0.5 cm kapak slayt üzerinde kalmalıdır şekilde mikroskobik kapak cam yüzeyine yukarıdaki fideleri (her kökenli 5 fidan az) aktarmak ve hipokotil geri kalanı temas etmelidir Şekil 3B&#39;de gösterildiği gibi, araç. </li><li> eksize alanı HPTS agaroz blok temas edecek şekilde, 5 dakika boyunca (bir kesilmiş kancalı) hipokotil üstünde HPTS agaroz blok yerleştirin. </li><li> Yükleme 5 dakika sonra, GKD 2 O içeren 10 mm Petri kabı hipokotiller transferi ve sürekli çalkalanarak 15 dakika boyunca GKD 2 O hipokotiller yıkama hipokotil yüzeyinden agaroz sil. </li></ol></li><li> Konfokal Mikroskopi için Örnekleri hazırlayın. <ol><li> konfokal lazer tarama mikroskobu altında gözlem her kökenli 5 fide az seçin. </li><li> Lazer kanalında belirli exc 488 nm dalga boyuna ayarlanmışve yağışa band geçiren emisyonu için 500 550 nm. </li><li> GKD 2 O. ile yıkandıktan sonra yeni bir mikroskopik slayt 2 takım Transfer fidanları (bir Col-0 + bir mutant) slayt çift distile su 100-150 ul ekleyin ve bir kapak slayt ile kaplayın. konfokal mikroskop aşamasına slayt Shift. </li><li> Aydınlık alan (beyaz ışık) aydınlatma kullanarak (20X veya 40X objektif lens ile) hipokotil bölgesini odaklanın. Sonra, floresan için slaytlar tarayın. </li><li> 10 setleri en az fotoğraf çekmek ve yükleme noktasından boya hareketinin ölçüde kontrol ederek iki arka karşılaştırın. Not: değişmiş symplasmic hareketi ile Mutant / aşırı ifadesi hatları yabani tip Col-0 ile karşılaştırıldığında boya yükleme farklı desenleri gösterecektir. </li></ol></li></ol></li><li> Mutant içinde kaloz Seviye Analiz / Farklı HPTS Boya Hareketi Compar Değiştirilmiş phototropic ve Gravitropic Tepkisi gösterme ve gösterme Üzeri ifade Hatlarıed Col-0. <ol><li> anilin mavisi kaloz boyama boya hazırlayın. <ol><li> Otoklava GKD 2 O 1 M glisin, pH 9.5 ve% 0.1 (w / v) anilin hüzünlendiriyorsun </li><li> 3 hacim oranları:% 0.1 anilin mavi ve 2 1 M glisin karıştırılarak boyama tampon yapın. Örneğin, lekeleme tampon maddesi, 50 ml, 20 mavi% 0.1 anilin ml ve 1 M glisin 30 ml alır. Not: boyama kullanmak ve karanlıkta saklayın öncesinde 48 saat en az tampon yapın. </li></ol></li><li> Leke bükülmüş ya da kaloz özgü anilin mavisi ile fidan olmayan bükülmüş. <ol><li> Boyama işlemi sırasında novo kaloz sentezini inhibe etmek için, lekeleme tampon maddesi, 50 ml 1.5 mM 2-deoksi-D-glukoz (DDG) nihai hacim ekleyin. </li><li> (Ya da tropik yanıtı olmadan) kaloz boyama 3 günlük eski solmuş fidan alın. </li><li> İnce cerrahi makas kullanarak kanca bölgeden fidan kesin. </li><li> ihtiva küçük bir Petri kabındaki fidan aktarınBir kürdan ucu kullanarak boyama tamponu 2 ml ing. </li><li> 30 rpm&#39;de sürekli çalkalanarak, 2 saat boyunca karanlıkta lekeleme tampon maddesi ile fideleri inkübe edin. </li><li> Boyamadan sonra, fazla boyama tampon kaldırmak için 2 dakika süreyle GKD 2 O fideleri yıkayın. </li><li> konfokal lazer tarama mikroskobu altında gözlem için her bitki kökenli 5 fide az seçin. </li></ol></li><li> konfokal mikroskopi örnekleri hazırlamak: <ol><li> Mikroskop temizlemek için sette fidan aktarın (bir Col-0 + bir mutant) GKD 2 O. ile yıkandıktan sonra slaytlar </li><li> GKD 2 O 100-150 ul ekleyin ve bir kapak slayt ile kaplayın. konfokal mikroskop aşamasına slayt Shift. </li><li> bir lazer kanalında belirli uyarma için 405 nm&#39;de ve anilin, mavi floresan görüntüleme için 500 nm ile 550 nm emisyon dalga boyu olarak ayarlayın. </li><li> 10X ve geç ilk, odak haline hipokotil bölgesini getirparlak alan (beyaz ışık) aydınlatma kullanılarak 20X veya 40X objektif lensler r. </li><li> Ardından, filtrelenmiş ışık açmak floresan slaytları taramak ve görüntüleri kaydetmek. </li><li> ImageJ yazılım (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) ile kaloz sinyal yoğunluğu ölçmek (Bakınız Şekil 4). <ol><li> JPEG dosya formatına Olympus Görüntü İkili formatta (* .oib) den konfokal mikroskopi resim formatını değiştirin. Not: Yalnızca JPEG formatında ImageJ yazılım tarafından desteklenmektedir. </li><li> Çift tıklayarak (Şekil 4A) tarafından ImageJ programını başlatın. Not: Oklar kaloz yoğunluğu ölçümü (Şekil 4B) kullanılmak üzere dikdörtgen aracı göstermektedir. </li><li> Kaloz yoğunluğunu (Şekil 4C) ölçmek için JPEG dosya formatında kaydedilen ImageJ araç çubuğundaki &quot;açık&quot; alt seçeneği ve açık mikroskopi resimlerin ardından &quot;Dosya&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> Ima dikdörtgen simgesini tıklayınGEJ araç çubuğu (Şekil 4D). </li><li> , Sinyal yoğunluğu analiz resmin üzerine imleci ve alanı seçmek için muayene edilecek (Şekil 4E) </li><li> Tedbir ve klavye (Şekil 4E) üzerinde &#39;M&#39; tuşuna basarak sinyal yoğunluğu için sayısal değerleri kaydedin. Not: Sonuç dosyası ayrı ayrı (Şekil 4F) açılacaktır. </li><li> Tedbir ve yoğunluğu her bitki kökenli fidan tüm tek tek değerleri kaydeder. Not: ImageJ, sonuç dosyası &quot;Ortalama&quot; seçilmiş &quot;Alan&quot; sinyal şiddetini gösterir. </li></ol></li><li> ImageJ sonucu dosyasından ortalama değerleri kopyalamak ve kantitatif analiz için tablo dosyasında yapıştırın. </li><li> Kantitatif analiz için, standart hata çubukları ve olasılık değerleri (Şekil 4) dahil olmak üzere istatistiksel testler, bir çubuk grafik şeması yapmak. <ol><li> ortalama sinyal yoğunluğu ölçmektablo &quot;formüller&quot; aracını (Şekil 4G) kullanarak her arka plan (ImageJ itibaren ortalama). </li><li> Tablo &quot;formüller&quot; aracını (Şekil 4G) kullanarak her ölçüm için çoğaltır arasındaki standart sapmayı analiz eder. </li><li> thespreadsheet &quot;formüller&quot; aracını kullanarak standart hata (SE) hesaplayın. (Ler) nüfusu standart sapmasıdır ve (n) örnek büyüklüğü (gözlem sayısı) olduğu, SE = s / √ n edin. </li><li> ortalama sinyal yoğunluğu ve yukarıda da belirtildiği gibi hesaplanan standart hata değerlerine bir t-testi uygulanarak sonuçların önemini test edin. </li><li> Grafiksel tablo &quot;insert&quot; aracını (Şekil 4H) kullanarak iki farklı geçmişlere arasındaki kaloz düzeyinde nicel farklılığı temsil için yukarıdaki değerleri kullanarak bir çubuk grafik şema çizin. Not: Güçlü adayların Mutant / aşırı ifadesi hatları olacaktır sne kadar farklı örneğin hiçbir kaloz az kaloz veya hiper PD kaloz birikimi yabani tipiyle karşılaştırıldığında kaloz seviyeleri. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWent%2C+FW+%22Experimental+biology+monographs%22">Experimental biology monographs</a>. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).</li>
<li>Bennett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+AUX1+gene%3A+a+permease-like+regulator+of+root+gravitropism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.</a> Science. 273 (5277), 948-950 (1996).</li>
<li>Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+auxin+response+by+the+protein+kinase+PINOID%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID.</a> Cell. 100 (4), 469-478 (2000).</li>
<li>Jurgens, G., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high+road+and+the+low+road%3A+trafficking+choices+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The high road and the low road: trafficking choices in plants.</a> Cell. 130 (6), 977-979 (2007).</li>
<li>Michniewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+regulation+of+PIN+phosphorylation+by+PP2A+and+PINOID+directs+auxin+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux.</a> Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).</li>
<li>Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gravi-+and+phototropism+in+plant+mdr+mutants+mislocalizing+the+auxin+efflux+protein+PIN1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1.</a> Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).</li>
<li>Weijers, D., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snap+Shot%3A+auxin+signaling+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Snap Shot: auxin signaling and transport.</a> Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).</li>
<li>Wisniewska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+PIN+localization+directs+auxin+flow+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polar PIN localization directs auxin flow in plants.</a> Science. 312 (5775), 883(2006).</li>
<li>Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+purification%2C+and+molecular+cloning+of+N-1-naphthylphthalmic+acid-binding+plasma+membrane-associated+aminopeptidases+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).</li>
<li>Kleine-Vehn, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+targeting+and+endocytic+recycling+in+auxin-dependent+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).</li>
<li>Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+auxin+transport+by+the+AUX1+influx+carrier+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein.</a> Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).</li>
<li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+of+auxin+transport%3A+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li>
<li>Band, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+is+regulated+by+a+transient+lateral+auxin+gradient+controlled+by+a+tipping+point+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).</li>
<li>Vanneste, S., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin%3A+a+trigger+for+change+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin: a trigger for change in plant development.</a> Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-callose-mediated+plasmodesmal+gating+is+essential+for+tropic+auxin+gradient+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling.</a> Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).</li>
<li>Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Players+at+plasmodesmal+nano-channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Players at plasmodesmal nano-channels.</a> J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).</li>
<li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklama yok.

Bu makalede, bir stratejisi, bu nedenle, PD SEL ayrıntılı olarak anlatılmıştır değiştirilmiş PD kaloz ve e phototropic ve gravitropic yanıtlarında arızalı mutant / aşırı ifade çizgileri ekranlanması için kullanıldı. PD kaloz sentezi ve parçalanması esas kaloz sentaz ve β-1,3-glukanaz ile gerçekleştirilir, ancak bu enzimlerin düzenlenmesi çok yukan faktörlerle kontrol edilir. Böyle yukarı faktörler veya doğrudan PD düzenlenmesinde rol adaylar aramak için, biz tarama için bu yöntemi kurdunuz. Bu kurmak PD kaloz biyosentez...

Bitkiler, sapsız yaşam organizmalar gibi çeşitli çevresel uyaranlara yönelik hücre-hücre sinyalizasyon son derece sofistike bir ağ geliştirdi. Tropik tepkiler bitkiler çevresel uyaranlara yanıt hangi olayların biridir. Bitkiler iki tropik yanıtları Fototropizma ve Gravitropizma göstermektedir. Fotosentetik bitkiler maksimum enerji hasat bilimciler tarafından ışık kaynağına doğru bükün. Benzer şekilde, Gravitropizma yerçekimi merkezine doğru bitkilerin büyümesini sağlar. Bu tür tropik yanıtlara önde gelen temel mekanizma fitohormondur oksin 1 asimetrik gradyan oluşmasına yol açar. Yerel oksin degrade oluşumunun hareket iyi karakterize edilir; Bu mekanizmanın katılan genler hormon eylem 2-8 için bir yol haritası sunar. Oksin pimin şekillendirilmiş (PIN) ve akış taşıyıcı ve p-glikoproteinler spesifik konumu, donör hücrelerin 9,10 hücre duvarına sitoplazmadan oksinin hareketini gerçekleştirir. Furthermore, örneğin AuX1 / lax aile proteinleri gibi oksin akışı taşıyıcı, aktif H + / IAA symport aktivitesi ile, oksin son komşu Alıcı hücrelere 2,11,12 teslim edilir. oksin Bu yönlü hareket Polar oksin taşınmasının (PAT) olarak bilinir. PAT, çeşitli gelişim aşamalarında farklı çevresel uyaranlara 13,14 yanıt olarak, bir diferansiyel oksin dağılımına yol açar. Ayrıca, bu oksinin akını ve akış taşıyıcı herhangi bir lokalizasyonu ve ifade bozulması gelişim hatalara yol açan, oksin gradyanı bir aksamaya neden PAT ciddi bir değişikliğe yol açar. Son zamanlarda, Han ve ark. plasmodesmal düzenlemesi oksin gradyanı 15 korumak için de gerekli olduğu bildirilmektedir. Bugüne kadar, 30 dan fazla plasmodesmal proteinleri 16 tespit edilmiştir. Bu proteinler arasında, AtGSL8 plasmodesmata (PD) en kaloz sentezi için önemli bir enzim olarak bildirilmiştir ve bu nedenle maint önemli bir rol oynar edilmiştirPD boyut dışlama sınırı (SEL) Aining. Bastırılmış AtGSL8 sentezleme vahşi tip fide 15 aksine hiçbir tropik cevap sağlayan bozuk bir oksin gradyan modeli ile sonuçlanmıştır. Bu yazıda, yöntemler temin edilmiştir PD düzenlenmesinde rol yeni aday genleri keşfetmek için. Bu kaloz biyosentezini PD katkıda bulunan önemli bir enzim olduğu AtGSL8, bu yöntemleri test etmek için bir model protein olarak kullanılmıştır. Nedeniyle knock-out gsl8 mutantlar 17 fide-öldürücülüğü için, deksametazon (dex) -inducible RNAi hatları, daha önce yayınlanan raporda 15 uyarınca kullanılmıştır. Burada sağlanan bir strateji PD SEL kontrol hipokotil tropik yanıt olarak implike genleri taranması için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>HPTS (8-Hidroksipiren -1,3,6-trisülfonik asit trisodyum tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>Simplazmik izleyici olarak floresan boya</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Dongin-Genomic</td><td>GEL001-500G</td><td>HPTS agaroz bloğu için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td><td>LG-Goldstar Agaroz</td><td></td><td>jeli kaynatmak için makine</td></tr><tr><td>100 ml cam konik şişe</td><td>Dong Kwang</td><td>A0205</td><td>HPTS agarozu kaynatmak için kullanılır jel</td></tr><tr><td>Petri kabı (35 mm x 10 mm)</td><td>SPL yaşam bilimleri</td><td>SPL10035</td><td>HPTS agaroz blokları yapmak ve bitki örneklerini yıkamak için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak slaytları ve cam slaytlar (24 mm x 50 mm)</td><td>Marienfeld Laboratuvar Cam Malzemeleri</td><td>101222</td><td>HPTS agaroz blokları ve mikroskobik numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>MS orta plakalar 125 mm x 125 mm x 20 mm</td><td>SPL yaşam bilimleri</td><td>SPL11125</td><td>MS agar ortamı yapmak için plakalar</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Almanya Paslanmaz</td><td>HSB 942-11</td><td>Bitki örneklerinin</td></tr> <tr><td>kanca bölgesini çıkarmak için kullanılırMurashige ve Skoog (MS) bazal tuz karışımı</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS ortamı vitaminler içerir.</td></tr><tr><td>(N-morfolino) etansülfonik asit (MES) monohidrat</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>MS ortamı yapmak için.</td></tr><tr><td>Bitki agar</td><td>Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>MS ortamını katılaştırmak için.</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Wise Mix</td><td>SHO-1D</td><td>Anilin mavisi leke tamponunu ve HPTS boyasını sakin bir şekilde yıkamak için.</td></tr><tr><td>1 ml Mavi uçlar</td><td>Sorenson</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi bant</td><td>MIcropore</td><td>1530-0</td><td>MS plakasını kapatmak için</td></tr><tr><td>Anilin mavisi (Metil mavisi)</td><td>Sigma</td><td>M5528-25G</td><td>Anilin mavisi boyama tamponu hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td>Anilin mavisi boyama tamponu hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>DDG</td><td>Sigma</td><td>D8375-1G</td><td>Kalloz sentazların inhibisyonu için kullanılır.</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>Anilin mavisi lekelenmesini ve HPTS boya yükleme sonucunu kontrol etmek için.</td></tr><tr><td>Karıştırıcı&nbsp;</td><td>Ben laboratuar&nbsp;</td><td>K400</td><td>Ortam çözeltisini karıştırmak için.</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>SW pişirme folyosu</td><td></td><td>Plakaları karanlık bir durumda sarmak için.</td></tr><tr><td>Sodyum hipoklorit</td><td>Samjin Endüstrisi</td><td></td><td>Yüzey sterilize edilmiş tohumlara</td></tr></tbody></table>

bir strateji tropic tepkisi kaloz aracılı plasmodesmal gating rolü doğrulamak için

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

Bitki hormonu oksin ışık ve yerçekimine tropik yanıtlar dahil olmak üzere birçok büyüme ve gelişim süreçleri, önemli bir rol oynar. Bir oksin degrade kurulması Fototropizma ve Gravitropizma giden bir anahtar olaydır. Daha önce, kutup oksin nakil aracı (PAT) farklı bitki hücre domeni bir oksin gradyanı oluşturulması gösterilmiştir. Bununla birlikte, Han ve ark., En son, uygun oksin gradyan oluşumu için, komşu hücreler plasmodesmal kaloz aracılı symplasmic bağlantısı da kritik bir faktör olduğunu göstermiştir. Bu yazıda, strateji plasmodesmal kaloz sentezini modüle yoluyla symplasmic bağlantı değiştirerek Fototropizma ve Gravitropizma etkileyebilir belirli genlerin rolünü aydınlatmak için, tartışılmıştır. İlk adım, vahşi tip ile mutantların veya bir genin aşırı ifade çizgileri 3 günlük bir soluk fidelikler gelen anormal tropik yanıtları ekrana. Bu ön elemePAT fonksiyonlu veya symplasmic bağlantı kontrol eden gen bir dizi tanımlanmasına yol açabilir. İkinci tarama symplasmic bağlantı etkileyerek değişmiş tropik tepkileri göstermek adayların sıralamasını içerir. Bu tür adayları ele almak için, bir symplasmic izleyicinin hareketi ve plasmodesmal kaloz birikimi incelendi. Bu strateji tropik tepkiler ve diğer gelişim süreçleri sırasında doğrudan ya da dolaylı symplasmic bağlantı düzenleyen yeni aday genleri keşfetmek yararlı olacaktır.

Homozigot gsl8 T-DNA sokma mutantlan öldürücü 18 fide gibi bugün de, AtGSL8 ve deksametazon (Dex) -inducible RNAi hattı kullanılmıştır [(+ Dex / -dex) dsGSL8 bundan böyle]. DsGSL8 ve ± dex vahşi tip fide üç gün eski solmuş fideler phototropic ve gravitropic uyaranlara maruz bırakıldı. Biz dsGSL8 (+ dex) fide Fototropizma ve Gravitropizma 15 kusurlu olduğu bulundu. Şekil 5 açıkça dsGSL8 (+ dex) hi...

Bu makalede, tropik yanıtı sırasında plasmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanı kontrol eden genlerin taranması için yöntemler açıklanmaktadır. Bu hipokotil içinde tropik yanıtın derecesi ölçümü içerir Arabidopsis thaliana ve 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) yükleme ve nihayet kaloz seviye değerlendirme ile plasmodesmal geçirgenliği kontrol edilmesi.

Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Bu prosedürün genel amacı, tropik yanıt sırasında kalloz aracılı plazmodesmal kapılanmada rol oynayan genleri taramaktır. Bu yöntem, tropik yanıt sırasında hangi bilinmeyen genlerin plazmodesmatalar aracılığıyla hücreden hücreye sinyalleşmeyi kontrol ettiği gibi bitki gelişim biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; basit olması, etkili çalışması ve tekrarlanabilir olmasıdır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tüm süreç boyunca Arabidopsis etiyole hipokotillerinin herhangi bir hasar görmeden taşınmasının zorluğu nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Bu yöntemle ilgili fikir, ilk olarak plazmodesmal kapılamada bir glikoz sentaz olan GSL8'in rolünü belirlerken ortaya çıktı. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir; çünkü ses kaydında belirtilen prosedürler, özel kurulum ve taşıma gerektirdiği için uygulanması zor olan kritik adımları açıklamamaktadır.Deneyden bir gün önce Murashige ve Skoog veya MS besiyeri hazırlayın. Besiyerini otoklavlayın ve 125 mm'lik kare plakalara plaka başına 50 mL besiyeri doldurun. Ertesi gün, %1,1 sodyum hipoklorit ile sterilize edilmiş tohumları yarı kurumuş plakaların üzerine yerleştirin

a-strategy-to-validate-role-callose-mediated-plasmodesmal-gating

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bu iletişim kuralının amacı Arabidopsis thaliana fidan cotyledons içindeki kümelenmiş stoma bantlı daldırma tedavi şeker içeren orta solüsyonu tarafından teşvik ve kloroplast gibi hücre içi yapılar dikkat göstermektir ve confocal kullanarak kümelenmiş guard hücrelerdeki mikrotübüller mikroskobu lazer.

Kümelenmiş stoma bantlı şeker çözüm daldırma tedavisinde Arabidopsis thaliana fidan tarafından için bir indüksiyon sistemi

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, Plasmodiophora brassicae tarafından indüklenen safra kesesi histolojik gözlemi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamaktadır. Hipokotillerin vibratom kesitleri, hastalığın ilerlemesi sırasında transkripsiyon faktörlerinin ve fitohormonların tutulumunu incelemek için floresan görüntülemeden önce temizlenir. Bu protokol, reçine gömme sınırlamalarının üstesinden gelerek floresan proteinlerinin planta görselleştirmesini sağlar.

Gen İfadesindeki Değişiklikleri ve Plasmodiophora brassicae'ye Fizyolojik Yanıtları Görselleştirmek için Temizleme ve Floresan Mikroskopisinin Birleştirilmesi

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Öğrenin, Arabidopsis thaliana hipokotillerinde tropik yanıt sırasında kalloz aracılı plazmodesmal geçişi düzenleyen genleri tarama yöntemini. Bu teknik, bitki hücreleri arası sinyalleşme mekanizmalarını anlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için

Daha fazla video keşfet