Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için
17 Nisan 2016
Bu makalede, tropik yanıtı sırasında plasmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanı kontrol eden genlerin taranması için yöntemler açıklanmaktadır. Bu hipokotil içinde tropik yanıtın derecesi ölçümü içerir Arabidopsis thaliana ve 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) yükleme ve nihayet kaloz seviye değerlendirme ile plasmodesmal geçirgenliği kontrol edilmesi.
Bu prosedürün genel amacı, tropik yanıt sırasında kalloz aracılı plazmodesmal geçitte yer alan genleri taramaktır. Bu yöntem, bitki gelişim biyolojisi alanında, tropik tepki sırasında plazmodesmata ile hücreden hücreye sinyallemeyi hangi bilinmeyen genlerin kontrol ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit olması, işe yaraması ve tekrar etmesidir.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü Arabidopsis etiollenmiş hipokotillerin tüm süreç boyunca herhangi bir zarar görmeden ele alınması zordur. Bu yöntem için ilk olarak, plazmodesmal geçitlemede bir glikoz sentaz olan GSL8'in kuralını oluştururken aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü seste bahsedilen prosedürler, özel kurulum ve işlem gerektirdikleri için yürütülmesi zor olan kritik adımları açıklamamıştır.
Deneyden bir gün önce Murashige ve Skoog veya MS ortamını hazırlayın. Otoklavlayın ve 125 milimetre kare plakaları plaka başına 50 mililitre medya ile doldurun. Ertesi gün, yarı kurutulmuş plakalarda %1.1 sodyum hipoklorit ile sterilize edilmiş tohumları noktalayın.
1 milimetrelik bir mikropipet ucundan, 200 mikrolitre su ile tohumları noktalayın. Tohumları 1,8 santimetre aralıklarla beş sıra halinde düzenleyin ve tohumlar sıralar halinde en az 0,1 santimetre aralıklı olacak şekilde düzenleyin. Plakaları cerrahi bantla kaplamadan ve kapatmadan önce biraz suyun buharlaşmasına izin verin.
Ardından plakaları folyoya sarın ve bir kutunun içine yerleştirin. Kutuyu üç gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Üç günlük soğuk işlemden sonra, tohum kutusunu üç gün boyunca 22 santigrat dereceye aktarın.
Üç gün sonra, karanlık bir odada, yeşil ışık altında tohumların çimlenme durumunu kontrol edin. Genellikle, üç günlük Col-0 etiollü fideler 1,6 santimetre uzunluğa kadar büyür. Yeşil ışık altında, değişen fototropik ve gravitropik tepkiyi analiz edin.
Sterilize edilmiş bir kazma kullanarak, düz, dikey büyümeye sahip benzer büyüklükte fideleri seçin. Fideleri, başka hiçbir parçaya dokunmadan hipokotillerinin en alt kısmından nazikçe kaldırın. Ardından, seçilen fideleri dikkatlice taze bir MS agar plakasına aktarın.
Yeni plakada, fidelerin kancalarını aynı şekilde yönlendirin. Her sırayı yapmak için her genetik arka plandan en az 20 fide seçin ve her plakanın bir kopyasını yapın. Her plaka iki sırada iki genotip içerir.
Fototropik tepkiyi kontrol etmek için, plakaları fideler dikey olarak yönlendirilecek şekilde kara bir kutuya yerleştirin. Kutunun bir tarafını plakaların kenarına kadar açık bırakın. Ardından, kutuyu tek taraflı beyaz ışıklı bir bitki yetiştirme odasında inkübe edin.
Gravitropik tepkiyi kontrol etmek için, plakaları folyo ile sarın ve fideler yatay olacak şekilde kara bir kutuya koyun. Genellikle 90 dakikadan başlayıp 12 saate kadar uzayan birkaç zaman noktasında, plakaları düşük ışık koşullarında görüntüleyin. 600 DPI JPEG görüntüleri toplamak için bir tarayıcı seti kullanın.
Fidelerin bükülme açısını ölçmek için görüntülerini ImageJ yazılımına yükleyin. Yakınlaştırmak için büyütme aracını kullanın ve analiz etmek için bir fideye kaydırın. Ardından, fidanın büküldüğü açıyı ölçmek için açı aracını kullanın.
Bunu yapmak için, orijinal hipokotil büyüme yönü noktası A'ya çift sol tıklayın ve fareyi bükülme başlangıç noktası B'ye sürükleyin. Şimdi, fareyi B noktasından bükme ucuna, C noktasına sürükleyin ve ikinci çizgiyi çizmek için sol tıklamayı kullanın, bir açı oluşturun, A. Gerçek bükme açısı, 180 derece eksi açıya eşit olan B açısıdır A.Şimdi, klavyede M'ye basarak A açısını ölçün ve kaydedin. Sonuç dosyası ayrı olarak açılacaktır.
Fidelerin geri kalanını ölçmek için önceki adımı tekrarlayın ve veri seti elektronik tablo dosyasını kullanarak iki farklı arka planın ortalama açısını ölçün. Bu test için gerekli olan HPTS agaroz bloklarının hazırlanması metin protokolünde ele alınmıştır. Bitki örneklerini hazırlamakla başlayın.
Bu örnekte, değiştirilmiş bir plazmodesmata boyutu dışlama sınırına sahip mutantlar analiz edilmiştir. İlk olarak, tahlil için bir platform oluşturun. Yeni bir MS orta plakaya bir mikroskop kapak lamı yerleştirin.
Daha sonra, üç günlük etiollenmiş fidelere sahip MS plakalarından, fideleri kancanın tabanından dikkatlice çıkarmak için keskin bir cerrahi makas kullanın ve bunları kapak camına aktarın. Genetik arka plan başına en az beş fide aktarın. Fideleri, eksizyon konumundan sadece 0,5 santimetre hipokotil kapak sürgüsü üzerinde kalacak ve hipokotilin geri kalanı ortama temas edecek şekilde yönlendirin.
Ardından, eksize edilen alan HPTS bloğu ile temas halinde olacak şekilde eksize edilen fidelerin üzerine bir HPTS agaroz bloğu yerleştirin. Temasın yapıldığından emin olun. Bloğun beş dakika boyunca hipokotillerin üzerinde oturmasına izin verin.
Daha sonra hipokotilleri çift distile su içeren 10 milimetrelik bir petri kabına aktarın ve 15 dakika çalkalayarak yıkayın. Daha sonra, yıkanmış fideleri bir slayta aktarın. Doğrudan karşılaştırmalar yapmak için her mutantı bir kontrolün yanına yerleştirin.
Hipokotilleri 100 ila 150 mikrolitre çift damıtılmış su ile örtün ve bir kapak sürgüsü uygulayın. Şimdi, metin protokolünde açıklandığı gibi konfokal mikroskopi kullanarak slaydı analiz edin. Bu tahlil için, iki günden daha eski olmayan ve karanlıkta tutulan taze hazırlanmış boya kullanın.
De novo kalloz sentezini inhibe etmek için, boyaya 1.5 milimolar 2-Deoksi-D-glikoz ekleyin. Bu tahliye, tropik tepkili veya tepkisiz kalloz boyaması için üç günlük etiollü fideleri seçerek başlayın. İnce cerrahi makas kullanarak fideleri kanca bölgelerinden kesin.
Daha sonra, bir kürdan ucunu kullanarak, fideleri iki mililitre boyama tamponu içeren küçük bir petri kabına aktarın. Fideleri 30 RPM'de sürekli çalkalayarak karanlıkta iki saat boyunca boyama tamponunda inkübe edin. Boyamadan sonra, fazla lekelenme tamponunu çıkarmak için fideleri iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
Yıkandıktan sonra, konfokal analiz için her arka plandan en az beş fide seçin. ImageJ yazılımı ile kalloz sinyal yoğunluğunu ölçün. Görüntüleme yazılımında JPEG formatında önceden kaydedilmiş olan konfokal mikroskopi dosyasını açın.
Ardından, dikdörtgen seçim aracını kullanarak imleci resmin üzerine sürükleyin ve incelenecek alanı seçin. Ardından, M'ye basarak sinyal yoğunluğu için sayısal değerleri ölçün ve kaydedin. Sonuç dosyası ayrı olarak açılacaktır. Sonuç dosyasında, Ortalama" terimi, birkaç alanın ortalamasını değil, seçilen alanın sinyal yoğunluğunu belirtir.
Her fide için sinyali tek tek bu şekilde analiz edin. Fidelerin geri kalanını ölçmek için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve veri seti elektronik tablo dosyasını kullanarak iki farklı arka planın ortalama açısını ölçün. Açıklanan protokoller kullanılarak, AtGSL8'in deksametazon ile indüklenebilir RNAi hatları analiz edildi.
DsGSL8 fideleri fototropizm ve gravitropizma açısından açıkça kusurluydu. Her iki kuvvetin de etkisi altında eğilme göstermediler. Simplazmik hareketteki değişiklikler, HPTSA boya hareketinin dsGSL8 RNAi yıkımlarında her iki kontrolden de önemli ölçüde daha kapsamlı olduğunu gösterdi.
Callose, plazmodesmata boyut dışlama limitinin temel düzenleyicilerinden biridir ve AtGSL8, bilinen bir plasmodesmata kalloz sentazdır. Böylece, kalloz anilin mavisi boyama yapıldı. Kontrolde, sarı oklarla işaretlendiği gibi altı saat sonra kallose birikmiştir.
Bununla birlikte, altı saat sonra, mutantlar sürekli olarak düşük plazmodesmata kalloz seviyelerine sahipti. Bu kalloz sentezi yokluğu, fototropizmden üç saat sonra ölçülebilir şekilde daha azdı. Bu videoyu izledikten sonra, tamamen nasırın modüle edilmesi yoluyla tropik yanıta bağlı plazmodesmal geçitlemeyi kontrol eden varyant kontrolünde genlerin nasıl hızlı bir şekilde taranacağını iyi anlamış olmalısınız.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik Arabidopsis fidelerinin üç günlük çimlenmesinden yaklaşık altı saat sonra yapılabilir. Bu prosedürü denerken, fideleri aktarırken zarar vermekten kaçınmayı unutmamak önemlidir. Ayrıca, yükleme tahlili sırasında agar ve hipokotil arasında uygun bir temas olması önemlidir.
Bu gelişmeden sonra, bu teknik, tropik dönemde semaplazmik iletkenliği kontrol etmede rol oynayan genleri, yeni genleri keşfetmek için gelişim biyolojisinin yolunu açtı
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, bitkilerde tropik tepkiler sırasında plazmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanlarını düzenleyen genleri taramakta kullanılan bir yöntemi özetlemektedir. Odak noktası, Arabidopsis thaliana hipokotillerinde, plazmodesmal geçirgenliği ve kalloz seviyelerini değerlendirmektir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki Gelişimsel Biyolojisi
- Hücreden Hücreye Sinyal İletimi
- Genetik Tarama
Arka Plan
- Plazmodesmal geçişi anlamak, bitki sinyalizasyonu için kritik öneme sahiptir.
- Kalloz, plazmodesmal geçirgenliği düzenlemede önemli bir rol oynar.
- Bitkilerdeki tropik tepkiler karmaşık genetik etkileşimleri içerir.
- Arabidopsis thaliana, bu çalışmalar için model organizma olarak kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Tropik tepkiler sırasında plazmodesmal sinyalizasyonu kontrol eden bilinmeyen genleri belirlemek.
- Kalloz-aracılı plazmodesmal geçişi hakkındaki anlayışı artırmak.
- Alandaki araştırmacılar için basit bir metodoloji sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Arabidopsis hipokotillerinde tropik tepkilerin ölçülmesi.
- HPTS yüklemesi kullanılarak plazmodesmal geçirgenliğin değerlendirilmesi.
- Bitki dokularında kalloz seviyelerinin değerlendirilmesi.
- Yöntemin uygulanmasına yardımcı görsel gösterimler.
Ana Sonuçlar
- Plazmodesmal geçişiyle ilgili önemli genlerin belirlenmesi.
- Kontrollü koşullarda tropik tepkilerin başarılı ölçümü.
- Yöntemin etkinliğinin ve tekrarlanabilirliğinin gösterilmesi.
- Arabidopsis hipokotillerinin kullanımında karşılaşılan zorlukların vurgulanması.
Sonuçlar
- Yöntem, bitki sinyalizasyonunun genetik kontrolü hakkında bilgiler sağlar.
- Görsel yardımcılar, tekniğin başarılı uygulanması için gereklidir.
- Daha fazla araştırma bu bulgulara dayanarak diğer genetik faktörleri araştırmak için geliştirilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding gene-mediated regulation of plasmodesmal connectivity provides mechanistic insight into auxin gradient formation, a foundational process in plant developmental signaling. This strategy enables systematic identification of genetic regulators of symplasmic gating, supporting target validation in plant signaling pathways. Such knowledge aids in de-risking hypotheses about intercellular communication mechanisms relevant to crop trait development and stress response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses linking plasmodesmal callose synthesis to tropic response phenotypes.
- Operational Value: Uses aberrant tropic response screening in seedlings to prioritize genes affecting symplasmic connectivity.
- Scientific Value: Supports functional validation of candidate genes via symplasmic tracer movement and callose deposition assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes quantitative plasmodesmal permeability readouts using HPTS agarose block assays.
- Operational Value: Standardizes callose synthesis inhibition via 2-Deoxy-D-glucose treatment for comparative analysis.
- Scientific Value: Enables confocal microscopy-based signal intensity measurement to assess plasmodesmal gating dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links gene modulation to altered symplasmic connectivity during tropic responses, informing mechanistic models.
- Operational Value: Facilitates cross-genetic background comparison using duplicate plate designs and standardized hypocotyl excision.
- Scientific Value: Supports phenotypic screening workflows for genes influencing cell-to-cell signaling in developmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by connecting genetic screening to functional validation of plasmodesmal regulators, informing downstream target confidence assessments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes controlling cell-to-cell signaling via plasmodesmata during tropic responses.
- Screening: Enables assay readiness through standardized HPTS loading and callose staining protocols for permeability and gating quantification.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (bending angle, signal intensity) enabling condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Provides mechanistic continuity from gene perturbation to symplasmic connectivity changes in tropic response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for genes modulating symplasmic signaling in plant developmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking gene function to plasmodesmal gating mechanisms.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized seedling handling, plate duplication, and blinded angle measurement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target prioritization by reducing mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with validated roles in symplasmic connectivity regulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Arabidopsis seedling sterilization, plating, and hypocotyl handling without mechanical damage.
- Dependent on instrumentation for confocal microscopy, ImageJ analysis, and controlled light/temperature growth chambers.
- Necessitates cross-team standardization for tropic response imaging, callose staining, and symplasmic tracer assay execution.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different genetic backgrounds or developmental stages.
- Includes practical limitations such as seedling transfer sensitivity and the need for precise agar-hypocotyl contact during loading assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Screening for Altered Phototropic or Gravitropic Responses
4:09
Analysis of Seedling Bending Angles
5:32
Hypocotyl Assay: HPTS Dye-loading
7:30
Callose Aniline Blue Staining
8:44
Analysis of Callose Signal
9:45
Results: Screening AtGSL8 RNAi Plants
11:06
Conclusion
