Elektrosprey İyonizasyon kütle spektrometresi ile Dicysteinyl tetrapeptidlerle ile Merkür (II) kompleksinin Bir Çalışma

Bu prosedürün genel amacı, farklı reaksiyon stokiyometrileri altında cıva ve disistenil peptit kompleksleri hazırlamak ve elektrosprey iyonizasyonu ve oribitrap kütle spektrometresi ile oluşturulan farklı kompleksleri karakterize etmektir. Bu yöntem, cıva iyonlarını ayırmak için şelatlama maddelerinin rasyonel tasarımını geliştirecek olan cıva ve tiyol bileşiklerinin kompleksleşme eğilimleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ihmal edilebilir parçalanma ile metal iyon komplekslerinin analizini kolaylaştırmasıdır.

Diğerleri, farklı cıva izotopik dağılım modelini içerir. Tandem kütle spektrometresi ile yükü atama ve örtüşen tepe noktalarını analiz etme kolaylığı. Bu yöntem cıva peptit kompleksleri hakkında bilgi sağlasa da, diğer komplekslerle, özellikle farklı izotopik formlarda bulunan metal iyonlarıyla da uygulanabilir.

Beş milimolar amonyum format tamponunu bir vakum sistemi altında 10 dakika boyunca gazdan arındırın ve argon ile temizleyin. İki kez tekrarlayın ve çözeltiyi argon altında saklayın. Kullanım gününde, kullanmadan önce tampon çözeltisini 0,2 mikronluk bir filtreden süzün.

Cıva klorür çözeltileri hazırlamak için 0.2375 gram cıva klorür tartın. 0.035 molar cıva klorür çözeltisi üretmek için 25 mililitre beş milimolar amonyum format tamponu içinde çözün. 0.75 milimolar bir çözelti oluşturmak için 9.785 mililitre beş milimolar amonyum format tamponuna 0.214 mililitre cıva klorür çözeltisi ekleyin.

Elde edilen çözeltiyi argon gazı ile örtün. Daha sonra, 0.75 milimolar CGGC çözeltisi vermek için 1.275 mililitre beş milimolar amonyum format pH 7.5 tamponuna 225 mikrolitre beş milimolar CGGC stok çözeltisi ekleyin. Daha sonra, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 255 mikrolitre beş milimolar amonyum format pH 7.5 tamponu yerleştirerek bir ila 0.5 oranında cıva / CGGC çözeltisi hazırlayın.

Ardından, tüpe 30 mikrolitre 0.75 milimolar cıva klorür çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi 10 saniye boyunca girdaplayın. Ardından, tüpe 15 mikrolitre 0.75 milimolar CGGC çözeltisi ekleyin.

Çözeltiyi 10 saniye daha vorteksleyin ve ardından çözeltiyi kütle spektrometresine enjeksiyondan önce 10 dakika bekletin. ESI kütle spektrometresini veya MS'yi hazırlamak için, 500 mikrolitrelik bir cam şırıngaya 100 mikrolitre kalibrasyon standardı çizin. Şırıngayı MS pompasının şırınga kızağına yerleştirin.

Boruyu takın ve kütle spektrometresine enjekte edin. Dosya simgesini seçip dosya adını yazarak çalıştırma için dosya adını ayarlayın. Veri toplama modülündeki veri topla düğmesini seçin ve 150 tarama toplayın.

Yazılımın veri işleme modülünü açarak kalibrasyon standartlarını doğrulamak için kromatogramı analiz edin. Ardından, dosya menüsüne gidin ve aç'ı ve ardından iletişim kutusundaki dosyayı seçin. Kromatogramdaki tepe noktalarının, standartların kütle / yük oranları ile ilişkili olduğunu doğrulayın.

500 mikrolitre cam şırıngayı, 500 mikrolitre HPLC dereceli metanol çekerek ve ardından bir behere dağıtarak temizleyin. Cam şırıngaya 500 mikrolitre HPLC sınıfı metanol çekin ve sistemi yıkayın. Parametreleri ayarlamak için yazılımın yöntem kurulum modülünü seçin.

Tarama modu menüsünü seçin ve analizörlerin FTMS'sini tanımlayın, ardından Tamam'a tıklayın. Ardından, parametreleri metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ayarlamak için gerçek zamanlı görünüm spektrumu sayfasındaki çeşitli simgelere tıklayın. Tamponu çalıştırmak için, 500 mikrolitrelik cam şırıngaya 500 mikrolitre beş milimolar amonyum format tamponu yerleştirin.

MS pompasının şırınga kızağına yerleştirin ve boruyu çıkarın. Tamponu borudan bir ila iki dakika geçirin. Dosya simgesini seçip dosya adını yazarak çalıştırma için dosya adını ayarlayın.

Modüldeki veri topla düğmesini seçin ve 150 tarama toplayın. 150 tarama toplandıktan sonra toplamayı durdurmak için çalıştırmayı durdur düğmesine tıklayın. Ardından, veri tarayıcı modülünü açın, dosya menüsüne gidin ve aç'ı ve ardından iletişim kutusundaki dosyayı seçin.

483, 683, 1163 ve 1363 kütle aşırı şarjında peptit veya cıva iyonu peptit komplekslerine benzeyen hiçbir tepe noktasının bulunmadığını doğrulayın. Numunenin 250 mikrolitresini şırıngaya yerleştirerek bir ila 0,5 cıva / CGGC oranı çözeltisini çalıştırın. Şırıngayı MS pompasının şırınga kızağına yerleştirin.

Boruyu takın ve cihazı astarlayın. 150 veri taraması aldıktan sonra tarayıcı modülünü açın, dosya menüsüne gidin ve aç'ı seçin. Ardından, iletişim kutusunda dosyayı seçin.

Kromatogramın, yalnızca CGGC peptidi için olan da dahil olmak üzere tepe noktaları içerdiğini doğrulayın. Bu prosedürün kritik bir yönü, her reaksiyon karışımı analizinden önce önceki çalıştırmadaki analitlerin tamamen çıkarılmasını sağlamaktır. Taşınan analitlerden kaynaklanan numune kontaminasyonunun en aza indirilmesi, enjeksiyon hattının iyice temizlenmesi ile sağlanır.

Şırıngayı 500 mikrolitre amonyum format tamponu ile aspire ederek ve ardından tamponu bir behere dağıtarak yıkayın. Ardından, MS üzerindeki atık düğmesini seçin ve hortumu 500 mikrolitre amonyum format tamponu ile üç kez yıkayın. 500 mikrolitre metanol aspire ederek ve bir behere dağıtarak şırıngayı daha fazla yıkayın.

Hortumu bir kez 500 mikrolitre metanol ile yıkayın. Ardından, MS üzerindeki yük dedektörü düğmesini seçin. Şırıngaya 500 mikrolitre amonyum format tamponu ekledikten sonra, şırıngayı MS pompasının şırınga kızağına yerleştirin. Boruyu takın ve cihazı astarlayın.

Daha önce olduğu gibi arabellek çalıştırması için bir dosya adı seçin ve çalıştırmayı durdur düğmesine tıklamadan önce 150 tarama alın. Kromatogramın önceki cıvadan CGGC çalışmasına kadar olan tepe noktalarından yoksun olduğunu doğrulamak için veri tarayıcı modülünü açın. Kalan CGGC numuneleri için analiz prosedürünü tekrarlayın.

CEEC çözeltisine bir ila 0.5 oranında cıva hazırlamak için, 255 mililitre beş milimolar amonyum format pH 7.5 tamponunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpe 30 mikrolitre 0.75 milimolar cıva klorür çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi 10 saniye boyunca girdapladıktan sonra, tüpe 15 mikrolitre 0.75 milimolar CEEC çözeltisi ekleyin.

Çözeltiyi 10 saniye daha girdaplayın. Ve kütle spektrometresi enjeksiyonundan önce çözeltiyi 10 dakika bekletin. CEEC numunelerini ve cıva iyonu ve CEEC reaksiyon karışımlarını kullanarak analiz prosedürünü tekrarlayın.

Temsili bir kütle spektrumu gösterilmiştir. 10 dakika sonra, çeşitli cıva peptit kompleksleri, 339.08'lik bir peptit zirvesi ve 677.15'lik bir peptit dimeri ile birlikte bir ila 0.5 cıva ila CGGC reaksiyon karışımı için görülebilir. Önceki spektrumda gözlemlendiği gibi, bire bir cıva - CGGC reaksiyon karışımı bazı benzer pikler içerir.

Örneğin, tepe 539.03, bire bir cıva ve peptit kompleksini gösterir. Yakınlaştırılmış görünüm, doğal olarak oluşan yedi ana cıva izotopuna karşılık gelen imza cıva izotopik modelini sergiler. Ayrıca, daha önce cıva disistenil tripeptit için bildirildiği gibi, bir ila iki cıva ila CGGC kompleksi de gözlenir.

Bu kompleks, cıva ve CGGC'nin üç reaksiyon karışımında da görülür. 877'de monoizotopik bir tepe noktasına sahip farklı bir cıva izotopik modeli ile kolayca analiz edildi. Bununla birlikte, bir ila 0.5 cıva ila CGGC reaksiyon karışımında olduğu gibi cıva fazlaysa, iki ila iki cıva ila CGGC kompleksi daha tespit edilir.

Bu cıva izotopik imzası, kimyasal program kullanılarak hesaplanan iki cıva kompleksine karşılık gelir. Teorik protonlanmış monoizotopik kütle, gözlemlenen izotopik kümedeki dokuzuncu tepe noktası olan 1077'lik bir kütle aşırı yük değerine karşılık gelir. CEEC komplekslerine çeşitli cıva gösteren temsili bir spektrum gösterilmiştir.

İlgi çekici olan, 883'te monoizotopik bir tepe gösteren artı bir yükte cıva ile ilişkili CEEC eklentilerine örtüşen tepelerdir. Ve artı iki yükte, hesaplanan monoizotopik tepe değeri 1765 ile. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, analitlerin taşınmasını önlemek için tamponlarınızın gazını almayı ve hattı iyice durulamayı unutmamanız önemlidir. Bu prosedürü takiben, çözelti fazındaki içerik komplekslerinin daha doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için proton, karbon-13 ve cıva-199 nükleer manyetik rezonans spektroskopisi veya potansiyometri gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, elektrosprey iyonizasyonlu orbitrap kütle spektrometresi kullanarak çeşitli cıva komplekslerini ve bunların farklı cıva izotopik dağılım modellerini ve yük oluşumlarını analiz edebilmeli ve ayrıca tandem MS analizi ile örtüşen tepe noktalarını ayırt edebilmelisiniz.

Cıva çözeltileri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.