Name: Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster'da mekanosensasyonu etkileyen mutasyonları MARCM yöntemiyle klonlarda davranış analizi kullanarak tespit etmeyi. Bu teknik ölümcül mutasyonları taramaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Istiyorum Yazarlar Bloomington stok merkezi, Liqun Luo, Charles Zuker ve Lily ve Yuh Nung Oca sinek stoklarının cömert paylaşımı ve finansman aşağıdaki teşekkür: Lisans Ford Fakültesi Yaz Bursu (JD ve SW) somas-URM (SW), Renee ve Anthony M. Marlon, MD (DL) &#39;63 Yaz Araştırma Bursu (CL ve DL için) BD Kurumlar Yaz Araştırma Bursu James C. &#39;75 ve Jane Colihan Yaz Araştırma Bursu (TO) aracılığıyla Mezunlar / Kutsal Haç Koleji Veli Yaz Araştırma Fonu ve Stransky Vakfı Yaz Araştırma Bursu (TO). Laboratuvarda tüm çalışmaları desteklemek için Kutsal Haç Koleji&#39;nde Biyoloji Bölümü ve Dekanlığa Special thanks.

1. Haçlar MARCM Sinekler oluşturmak için <ol><li> 22 santigrat derece veya standart Drosophila ortam Mısır unu pekmez ortam (% 0.13 Tegosept, 23.5 g / L maya, 60 g / L Mısır unu, 60 mL / L melas;, 4 mL / L asit karışımı 6.5 g / L agar) üzerine sinekler bakımı Bir 12-st ışık / karanlık döngüsünde. Not: Standart sıcaklık daha düşük bir sağlıklı MARCM-stoklarını tutmak için kullanılır. Bu 14 gün yumurta ve yetişkinlik arasındaki gelişimsel süresini uzatır. </li><li> Bir yukarı-aktive dizisi (UAS-GFP), GAL80 bastırıcı protein, Gal4 transkripsiyon faktörü, bir kontrol altında (GFP gerekli genetik elementler içeren bir MARCM hazır stoktan - (8 gün eski, yaklaşık 1) bakire kadın kullanın ısı-şok odaklı rekombinaz ve FRT rekombinasyon sitesi). Not: Bizim MARCM hazır stokları aşağıdaki genotipleri içerir: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb. Not: Belirli FRT sitesi mutasyon yere bağlı olacaktırgenomuna. Örneğin, FRT40A gibi NOMPC (MARCM protokolleri ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için 10 bakınız) olarak kromozomun 2 sol kolunda, üzerinde mutasyon test etmek için kullanılır. </li><li> Bir ilgi mutasyon ve buna tekabül eden FRT sitesini ihtiva erkeklere Çapraz MARCM hazır bakire kadın (; NOMPC3, FRT40A / CYO, örneğin w- + / +). Etkili MARCM indüksiyonu için kontrol etmek için, aynı FRT bölgesini ihtiva eden bir erkek sinekler kullanılarak bir ikinci çapraz ayarlanır, ancak mutasyonu olmayan. Melezlerde 1 erkek: 5 kadın yaklaşık bir oranını kullanın. </li></ol> Döşeme 2. Zamanlı Yumurta <ol><li> Sinekleri, en az bir gece çiftleşme bırakıldıktan sonra, taze ortam ile yeni şişelere yetişkin hareket eder. Sinekler tekrar yeni şişe içine haçlar aktarmadan önce yaklaşık 4 saat karanlık ortamda yumurtalarını bırakmak için izin verin. Yumurtlama döneminin başlangıç ​​ve bitiş saatlerini not alın. Not: 4-hr interva sonundan önce medyaya yumurta sayısının yüksek olması göründüğünde kısa aralıklarla kabul edilebilirl. <ol><li> Isı, daha sonra şok olması için santigrat 22 derece 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde yeterli yumurta sayısına (yaklaşık 20&#39;den fazla) ve mağaza ile şişeleri tutun. Not: Yetişkin onlar daha fazla test için muhafaza edilmesi tavsiye edilir davranışsal test ve verimlilik çıkarına uçar medya üzerinde yumurta düşük sayıda küçük şişeler (az 20 yaklaşık daha) yeterli sayıda elde etmek olası değildir. Not: Bizim sinekler 8 PM 8 saatleri arasında ışıkları ile yetiştirilir. 8 PM ve 8:00-gece yarısı - Biz puan daha yüksek yumurta yoğunlukları yol akşam saat, bu nedenle genellikle 4 ila zamanlı haç yapmak bulduk. Inkübatör düzenli aydınlık-karanlık döngüsü rahatsız etmemek için sinekler ertesi gün kuluçka iade edilir daha sonra karanlık bir kabine oda sıcaklığında kendi yumurtalarını ve. </li></ol></li></ol> 3. Mitotik Birleşimi tetikleyebilecek Isı Şok gerçekleştirin <ol><li> Yaklaşık 85 - yumurtlama sonrasında 100 saat, yer v1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir su banyosu içine IALS. Su seviyesi şişeleri medyanın yüksekliğinin üstünde ulaşır, ancak tam boğulmaktan larvaları önlemek için flakon daldırın olmadığından emin olun. </li><li> Su banyosu şişeleri çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saatlik toparlanma dönemine izin verir. </li><li> Geri 37 santigrat derece su banyosu içine 1 saat yerleştirin şişeleri. </li><li> Eclosion kadar 22 derece santigratta 12 saat ışık / karanlık döngüsünde inkübatör su banyosunda deposundan şişeleri çıkarın. </li></ol> Davranışsal Test 4. Hazırlık <ol><li> Eclosion ardından, buz üzerinde sinekler uyutmak. MARCM için tüm genetik öğeleri içeren ve GFP-işaretli klonlar muhtemelen üst stoklarında kullanılan gözlemlenebilir fenotip belirteçler dayalı görülecektir işaret genotipleri ile sinekleri seçin. Iridektomi makasla sinekler başını kesmek. Not: Örneğin, genetik belirteçler olmadan sinekler için CYO (kıvırcık kanatlar) ve Sb (anız kıl) olduklarını gösteren seçilenmozaik bölgeleri oluşturmak için gerekli tüm genetik unsurlar içerecektir fy sinekler GFP ile işaretlenmiş. Not: Decapitation uyarıldığında uzak arasındaki yetişkin önlemek için gereklidir. </li><li> Kapalı, nemli ortamda başsız sinekler yerleştirin ve yaklaşık 10 izin - kurtarma 20 saat. Sadece kullanım hakkı kendilerini daha fazla test için tedirgin o zaman uçar. Deney Dekapitasyon 30 saat içinde uçar. </li></ol> 5. Hareket Testleri <ol><li> Bir floresan diseksiyon mikroskop altında decapitated sinekler gözlemleyerek, kıl dış duyu organları da GFP ile işaretlenmiş homozigot klonları tanımlamak. Kıl adını ve sol veya sağ tarafına kaydedin. Herhangi bir potansiyel önyargı ortadan kaldırmak için, kıl stimülasyonu gerçekleştirmek laboratuar elemanı kıl, vahşi tip veya mutant genotipine kör olmalıdır. </li><li> Sert saç veya ince forseps ile sinek vücudun doğru kıl GFP saptırma bir tımar refleksini işaretli ortaya ve bacak yeniden gözlemlemekyanıtlarının yokluğu. Stimülasyon ve bacaklarını hareket etmiyor sinekler sıfır puan kıl cevaben kendi bacak kaldırma sinekler birinin bir puan verin. Not: Daha önceki çalışmalarda 6,7 belirli bir kıl uyararak ortaya bacak tepkisini karakterize var. Bu, her bir fırça kılı yanıt bacak ve söz konusu kıl uyarılmasına yanıt sinekler oranını içerir. Biz sadece Vandervorst sınıflamasına 6 dayalı cevap bekleniyor bacak hareketleri attı. </li><li> Birbirinden 2 dk aralıklı beş deneyler. </li></ol>

<ol><li>Grünert, U., Gnatzy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+and+Ca%2B%2B+in+the+receptor+lymph+of+arthropod+cuticular+mechanoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).</li>
<li>Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+auditory+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila.</a> Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).</li>
<li>Gillespie, P. G., Walker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of mechanosensory transduction.</a> Nature. 413, 194-202 (2001).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+fatigue+of+a+mechanosensory+neuron+in+wild-type+Drosophila+and+in+memory+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants.</a> J Neurosci. 10, 491-499 (1990).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Vandervorst, P., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+sensory+connections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic control of sensory connections in Drosophila.</a> Nature. 286, 65-67 (1980).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9, 56-62 (1989).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery-based+science+education%3A+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59(2005).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mechanosensory+transduction+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mechanosensory transduction channel.</a> Science. 287, 2229-2234 (2000).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493, 221-225 (2013).</li>
<li>Arnadottir, J., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Mechanosensitive+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Mechanosensitive Channels.</a> Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).</li>
<li>Christensen, A. P., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+mechanosensation%3A+direct+or+indirect+activation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation?</a> Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+TRP+Channel+NompC+in+Drosophila+Larval+and+Adult+Locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRPN%28%3DNOMPC%29+channel+localizes+to+the+distal+end+of+mechanosensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia.</a> PLoS One. 5, e11012(2010).</li>
<li>Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOMPC%2C+a+Member+of+the+TRP+Channel+Family%2C+Localizes+to+the+Tubular+Body+and+Distal+Cilium+of+Drosophila+Campaniform+and+Chordotonal+Receptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells.</a> Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 22, 353-362 (2012).</li>
<li>Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mechanosensation+using+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Studies of mechanosensation using the fly.</a> Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var.

Mutantlar toplama yetişkinler olarak tarama engel olur ölümcül p-element mutasyonları içerdiğinden bu protokol, bu protokol ilk olarak Lee ve Luo tarafından açıklanan karmaşık genetik tekniği kullanır. Drosophila mechanosensation etkileyen mutasyonların taranması için yetişkin bir davranış deneyi kullanır (1999) ve yetişkin ölümcül aşmak için Wu ve Luo tarafından bir protokol, (2006) gibi ayrıntılı. MARCM homozigot hücrelerinin klonal bölgelerini oluşturmak için homolog kromozomlar arasındaki mitotik rekombinas...

İnsanlar, çevrelerinden gelen dokunma, basınç, titreşim veya ses dalgaları gibi mekanik uyaranları, mekanotransdüksiyon adı verilen bir süreçte sinir sistemi tarafından işlenebilecek duyusal bilgilere dönüştürme yeteneğine güvenirler. İnsanlar ve omurgasızlar arasındaki mekanotransdüksiyonun genel mekanik özelliklerinin çoğu aynıdır1, bu da Drosophila'yı mekanotransdüksiyonun moleküler mekanizmalarını incelemek için yararlı bir model haline getirir. Drosophila melanogaster, mekanik uyaranları aksiyon potansiyellerine dönüştürebilen iki set özel duyu organı (Tip I ve II) içerir. Tip I mekanoreseptörler, üç destek hücresi2 ile çevrili, tek bir dendrit veya duyusal sürece sahip bir nörona sahiptir. Tip I mekanoreseptörler arasında kıl mekanoreseptörleri, işitmeye duyarlı kordotonal organlar (Johnston organı) ve kanat vuruşları3 hakkında bilgi ileten kampaniform sensilla bulunur. Sineğin sırt tarafını kaplayan kıllar, Tip I organların en bol ve en kolay erişilebilir olanıdır. Omurgalılarda işitme ve denge ile ilişkili tüy hücrelerinin hücre dışı ortamına benzer şekilde, sinek mekanosensitif nöronları çevreleyen destek hücreleri, potasyum1 için alışılmadık bir konsantrasyon gradyanı oluşturan yüksek potasyumlu bir endolenf salgılar. Hem memeli hem de sinek sistemlerinin mekanosensitif nöronları, hücreyi depolarize etmek için bu yüksek hücre dışı potasyumu kullanır. Makroket kıllarının vücut duvarına doğru mekanik olarak uyarılmasına yanıt olarak, duyusal nöronlar, hücre zarının4 bu potasyum depolarizasyonu tarafından yönlendirilen bir aksiyon potansiyeli patlaması ile yanıt verir. Kılları innerve eden Drosophila duyusal nöronları, hem yapı hem de işlev açısından omurgalı kıl hücreleri de dahil olmak üzere diğer organizmaların mekanosensitif hücrelerine benzer1,5. Drosophila dış duyu organlarının deneysel manipülasyona erişilebilirliği ve araştırmacıların kullanabileceği genetik tekniklerin bolluğu, Drosophila'yı mekanosensasyonun moleküler temellerini araştırmak için mükemmel bir model sistem haline getirmektedir. 
Sinekte, bir kılı innerve eden tek bir duyusal nöronun uyarılması, gözlemlenebilir bir davranışsal tepkiye yol açar. Farklı kılların uyarılması, uyarılan kıllara bağlı olarak spesifik, tekrarlanabilir davranışsal tepkiler uyandırır. Dokunsal stimülasyon üzerine, kafası kesilmiş vahşi tip sinekler, uyarılmış kılın yakınındaki alanı5-7 desenli bir dizi bacak hareketi ile temizledikleri karmaşık bir tımar refleksi sergilerler. Öğrenme7 veya koordinasyon ve lokomotor aktivite5 ile etkileşime giren bilinen tek gen mutasyonları için homozigot olduğunda, sinekler mekanik stimülasyona anormal şekilde yanıt verir. Bu nedenle, bu tımar refleksi, tek gen mutasyonlarının belirli, tekrarlanabilir bir davranış üzerindeki etkilerini incelemek için yararlı bir araçtır.
Tek bir makroket kılının uyarılmasına verilen güçlü davranışsal tepki, mekanotransdüksiyonda yer alan yeni genlerin tanımlanmasına yardımcı olma potansiyeline sahiptir. Bu protokol, mutasyonun mekanosensasyona müdahale ettiğini gösteren davranışsal bir tepkinin yokluğu için bir mutant sinek koleksiyonunu test etmek için kullanılır. Tarama için seçilen mutant koleksiyonunda, mutasyonlar yetişkinlikten önce ölümcüllüğe neden olur ve bu nedenle geleneksel yetişkin davranış ekranları kullanılarak test edilmesi imkansız olacaktır. Başlangıçta, bu öldürücü p-elementleri koleksiyonu, klonlardaki hücre büyüme kusurlarını test etmek için FRT rekombinasyon bölgeleri ile birleştirildi. Klonlar özellikle gözde yapıldı çünkü yetişkin sinekler laboratuvar ortamında fonksiyonel görüş olmadan hayatta kalabilir8. Bununla birlikte, tüm mekanoksuyumun giderilmesi, yetişkinlerin ciddi şekilde koordinasyonsuz olmasına veya eklosiyondan önce ölmesine neden olabilir5. Bu protokol, mutasyonların ölümcüllüğünü atlatmak ve yetişkin aşama testine izin vermek için mozaik bir yaklaşım kullanır. Organizmanın geri kalanı heterozigot kalırken, sınırlı sayıda yetişkin sinek duyu organında homozigot mutant hücreler oluşturmak için Bastırılabilir Hücre İşaretleyicisi (MARCM)9 ile Mozaik Analiz adı verilen bir genetik teknik kullanılır. Bu MARCM sinekleri yetişkinliğe kadar kolayca hayatta kalır, ancak kıllar, ilgilenilen ölümcül genler için homozigottur.
MARCM, homozigot mutant hücre bölgelerinin oluşturulmasına ve yeşil floresan proteinin (GFP) ekspresyonu ile işaretlenmesine izin verirken, organizmanın geri kalanı o belirli lokusta heterozigot kalır ve işaretlenmemiş9. MARCM, bireysel p-element mutasyonlarını beş yaygın genetik elementle birleştirir: yukarı akış aktive edici bir dizinin kontrolü altında GFP (UAS-GFP), genel bir promotörün kontrolü altında Gal80 baskılayıcı proteini (tub-Gal80), genel bir promotörün kontrolü altında Gal4 transkripsiyon faktörü (tub-Gal4), ısı şoku kontrollü bir promotör aracılığıyla eksprese edilen FRT rekombinaz enzimi ve bir FRT rekombinasyon bölgesi10. Mitotik rekombinasyonu ısı şoku ile aktive edilmiş bir rekombinaz yoluyla tahrik ederek, sınırlı sayıda hücre mutasyon için homozigot hale getirilir ve GFP ile işaretlenir. GFP ekspresyonu, heterozigot hücrelerde, kromozomun vahşi tip kopyası üzerinde Gal80'in varlığı ile baskılanır. 
MARCM için bir ısı-şok protokolü, organizmanın çoğu heterozigot kalırken ve bu nedenle GFP ile işaretlenmemişken, sinek kılı dış duyu organlarında rekombinasyonu indüklemek için optimize edilmiştir. Bu protokol kullanılarak üretilen mozaik sinekler, notum yüzeyindeki post alar veya dorsal merkezi kıllarda en sık homozigot mutasyonlar içeriyordu. 
MARCM'nin bu kombinasyonunun ve tımar davranışı ekranının faydasını bilinen bir mekanosensitif mutant olan NOMPC ile test ettik. Mekanoreseptör potansiyeli C (NOMPC) olmayan iyon kanalı, Drosophila5,11-13'teki mekanotransdüksiyon yolunun önemli bir bileşenidir. NOMPC, katyon kanalları5'in geçici reseptör potansiyeli (TRP) süper ailesine aittir ve Drosophila14,15'te mekanosensitif bir kanal olarak nitelendirilmek için tüm kriterleri karşılar: 1) NOMPC, Drosophila 13,16-18'in tip 1 duyusal nöronlarının siliyer uçlarında eksprese edilir, 2) NOMPC boş larvalarının dokunsal stimülasyona elektriksel bir yanıtı yoktur13, 3) Dokunmaya duyarsız hücrelerde NOMPC'nin ektopik ekspresyonu mekanik stimülasyona duyarlılığı indükleyebilir13, 4) Schneider 2 hücrelerinde NOMPC'nin heterolog ekspresyonu mekanosensitif bir kanal13 verir ve 5) NOMPC yetişkin mutantları mekanik stimülasyona yanıtlarında kusurlar gösterir5. Bu kanıtlar göz önüne alındığında, NOMPC mutant klonlarının, kılların mekanik stimülasyonuna yanıt olarak değiştirilmiş veya inhibe edilmiş bir tımar tepkisi göstereceğini tahmin ettik.
NOMPC mutasyonunu içeren bir MARCM stoğu, tımar testinin prensip kanıtı deneyinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Mozaik sinekler, homozigot NOMPC mutant hücreleri içeren makroket kıllarda uyarıldı. Makroket kıllarının uyarılmasını takiben tımar yanıtının inhibisyonunu bekliyorduk. Test edilen 14 mutant kıl sineğinden sadece 2'sinin tekrarlanan stimülasyona tek bir yanıt verdiğini bulduk; Çoğu, homozigot mutant kılın uyarılmasına cevap vermedi. Bu MARCM tabanlı davranışsal tahlilin, bilinen bir mekanosensitif mozaik mutantında anormal bir tımar refleksi ürettiğini doğruladıktan sonra, bu teknik, ek mekanosensitif mutasyonlar için bir taramada kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Bira Mayası (25 lb)</td><td>MP Biyomedikal&nbsp;</td><td>ICN90331225&nbsp;</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Mısır (25 lb)</td><td>MP Biyomedikal&nbsp;</td><td>ICN90141125&nbsp;</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Agar (1 lb)</td><td>MoorAgar Inc.</td><td>41004</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Tegosept (5 kg)</td><td>Genesee</td><td>20-259</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Pekmez (1 Galon)</td><td>Sugarmill Marka - Thomsen Food Service</td><td>0 2625</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>Fisher</td><td>A258-500</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Fosforik asit</td><td>Fisher</td><td>A260-500</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Drosophila Şişeleri, Dar (PS)</td><td>Genesee</td><td>32-109</td><td>Sinek Kültürleri</td></tr><tr><td>6oz Kare Tabanlı Şişe (PP)</td><td>Genesee</td><td>32-130</td><td>Sinek Kültürleri</td></tr><tr><td>Flugs - Plastik Sinek Şişeleri</td><td>Genesee</td><td>49-100</td><td>Sinek Kültürleri</td></tr><tr><td>Rayon Topları, Büyük</td><td>Genesee</td><td>51-100</td><td>Sinek Kültürleri</td></tr><tr><td>Droso-Dolgu, Dar</td><td>Genesee</td><td>59-168</td><td>Sinek Yemi</td></tr><tr><td>Hazırlama Droso-Dolgu, Şişeler</td><td>Genesee</td><td>59-170</td><td>Sinek Yemi Hazırlık</td></tr><tr><td>8A-C / c-kelepçe montajlı dişli tahrikli laboratuvar karıştırıcısı&nbsp; 1/15 HP, 700 rpm değişken hızlı, 115 V, 50/60 Hz</td><td>Cleveland Mikser</td><td>8A-C</td><td>Fly Food Hazırlama</td></tr><tr><td>Su ceketli Su</td><td></td><td></td> Isıtıcısı <td>Fly Food Hazırlama</td></tr><tr><td>Günlük Büyüme Odası</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td>Isı için sıcaklık ve aydınlık / karanlık döngüsü kontrollü</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>VWR</td><td></td><td> şok</td></tr><tr><td>MicroScissors&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>&nbsp; 15000-08</td><td>Kafaları çıkarmak için</td></tr><tr><td>Fluroscence Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery V8&nbsp;</td><td>GFP küp (KSC295-814D) bant geçiren filtre ile</td></tr><tr><td>Fluroscence Işık Kaynağı</td><td>Zeiss</td><td>X-Cite 120</td><td>Fiber optik ışık borusu bunu yapılandırmayı kolaylaştırır&nbsp;</td></tr><tr><td>Scope</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam ICc1</td><td></td></tr><tr><td>için kamera Görüntü edinme yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğuk antezi için</td><td>buz kovası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğuk anestezi dekapitasyonu için</td><td>ev yapımı soğuk anestezi tepsisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nemli ortamda yavru sineklerin kurtarılması için</td> <td>plastik kutular</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

arasında mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda marcm tabanlı<em&gt; drosophila melanogaster</em

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Çünkü memeli iç kulak saç hücrelerinin yapısal ve işlevsel homoloji, Drosophila dış duyu organlarını innerve nöronların mechanosensation çalışma için mükemmel bir model sistemi sağlar. Bu protokol, mechanosensation müdahale mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir meyve sineği basit bir dokunmatik davranışını tarif etmektedir. Sineklerin toraks ya birinci ya da üçüncü ayağı bir tımar refleksini ortaya çıkarır bir macrochaete dokunsal uyarım kıl. Mechanotransduction (örneğin NOMPC gibi) müdahale mutasyonlar ya da refleks yayın diğer yönleri ile, bakım tepkisini inhibe edebilir. Yetişkin davranışların geleneksel ekran gelişimi sırasında gerekli rolleri vardır mutantlar cevapsız olurdu. Bunun yerine, bu protokol İfade tarafından oluşturulur ve işaretlenmesi için homozigoz mutant hücrelerin sadece sınırlı bölgeler için izin vermek için bir bastırılabilir hücre işaretleyici (MARCM) mozaik analizi ile dokunmatik ekran birleştirenYeşil floresan proteini (GFP) salgılamanın. Anormal davranış yanıtları için MARCM klonlar test ederek, daha geleneksel yöntemlerle cevapsız olurdu mechanosensation katılan yeni genlerin aramak için öldürücü p-element mutasyonlarının bir koleksiyon taranması mümkündür.

Bu protokolün başarısı büyük ölçüde test edilebilir sineklerin toplam verim bağlıdır, ısı şoku etkinliği mitotik rekombinasyon ve 2 dakika aralıklarla uyarılan sinekler sağlam bir davranışsal yanıt elde yeteneği teşvik etmek. Embriyoların yaklaşık% 12.5, gerekli MARCM elemanları ve GFP tanımı için potansiyele sahip Eclose yetişkin yaklaşık% 16,67 ihtiva göz önüne alındığında, bu zamana bırakır sırasında yumurta yüksek sayıda elde etmek için kritiktir. Başarılı bir Zamanlı bir örneği, <st...

Mekanosasyonu etkileyen yeni mutasyonları tanımlamak için, MARCM yöntemi ile üretilen mutant klonlarda sinek kıllarının dokunsal uyarımına davranışsal tepkiyi ölçen bir test tasarladık. Tekniklerin kombinasyonu, aksi takdirde ölümcül olabilecek mekanosensitif mutasyonların tanımlanmasına izin verir.

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin sineklerde Meno duyusunu etkileyen mutasyonları test etmektir. Bu yöntem, Meno duyarlı kanalın tanımlanması gibi, Meno duyusu alanındaki temel soruların belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mozaik hayvanlar kullanarak, aksi takdirde organizma için letal olacak mutasyonları tarayabilmemizdir.Bir mozaik ekran kullanarak, daha geleneksel davranışsal ekranlar tarafından gözden kaçmış olabilecek mutasyonları tanımlayabiliyoruz. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Davranışsal test adımlarının öğrenilmesi güçtür.İlgili kılları tanımlamak için sabit bir el ve pratik gerekir. Deneye başlamak için, sinekleri mısır unu pekmez besiyerinde tutun ve bir inkübatörde saklayın. Gerekli genetik elementleri içeren markum hazır stoktan bakire dişiler temin edin.Markum hazır bakire dişileri, ilgilenilen mutasyonu ve buna karşılık gelen FRT bölgesini taşıyan erkeklerle çaprazlayın. Ardından, aynı FRT bölgesini taşıyan ancak mutasyona sahip olmayan erkek sinekleri kullanarak ikinci kontrol çaprazlamayı kurun. Beş dişi bir erkek oranında, sineklerin en az bir gece çiftleşmesine izin verdikten sonra, yetişkinleri taze besiyerli yeni şişelere aktarın.Sineklerin yumurtalarını oda sıcaklığında, karanlık bir kabin içerisinde bırakmalarını sağlayın. Sinekler yumurta bıraktıktan sonra, çaprazlamaları yeni viallere aktarın. Yumurtlama döneminin başlangıç ve bitiş zamanlarını belgeleyin.Isı şoku için 20'den fazla yumurta veren flakonları ayırın ve bunları inkübatöre geri yerleştirin. Yumurtlama işleminden 85 ila 100 saat sonra, flakonları bir su banyosuna yerleştirin; su seviyesinin besiyeri yüksekliğinin üzerinde olduğundan ancak flakonları tamamen submerse etmediğinden emin olun. Bir saat sonra flakonları su banyosundan çıkarın ve sineklere bir toparlanma süresi tanıyın.Geri kazanımın ardından, tüpleri bir saat boyunca tekrar su banyosuna yerleştirin. Tüpleri su banyosundan çıkarın ve anestezi uyguladıktan sonra tekrar inkübatöre geri koyun. Sinekleri buz üzerinde tutun.Sinekler hareketsiz kaldığında, istenen tüm özelliklere sahip bireyleri seçin. Ardından, iridektomi makasını baş ile toraks arasına yerleştirmeye dikkat ederek, seçilen sineklerin başlarını dikkatlice kesin. Toraksa zarar vermeden bağlantıyı kesin.Başsız sinekleri kapalı ve nemli bir ortama yerleştirin ve iyileşmeleri için 10 ila 20 saat bekleyin. İnceleme için sinekleri geri alın. Yalnızca kendi başlarına hareket edebilen sinekleri kullanın.Uyarıldığında, GFP ile işaretlenmiş homozigot klonları tanımlamak için kafası kesilmiş sinekleri bir floresan diseksiyon mikroskobunda inceleyin. Kıl şeklindeki dış duyu organlarında, kılın adını ve sineğin sol veya sağ tarafında olup olmadığını kaydedin; sert bir kıl veya ince bir pensle GFP işaretli kılı sineğin gövdesine doğru saptırarak bir temizleme refleksi oluşturun ve bacak tepkisini gözlemleyin.Kıl uyarımına yanıt olarak bacağını kaldıran sineklere bir, bacağını hareket ettirmeyen sineklere ise sıfır sinus skoru verilir. Mümkün olduğunda, post AOR kıllarındaki mozaik dokuya sahip sinekler, post AOR kıllarındaki davranışsal analiz kullanılarak uyarılmaya iyi yanıt verip vermedikleri test edilir; bu sırada yabani tip sinekler, bilinen mekanosensitif mutant olan no mechano receptor potential C veya NMSI ile bakımlama yanıtının bozulduğu sineklerle karşılaştırılmıştır; kontrol sinekleri, kıl uyarımlarının %34'üne yanıt vermiştir.Buna karşılık, NMSI için homozigot olan kıllı hayvanlar %2 yanıt göstermiştir. Bu prosedürün uygulanması ve yeni bir davranışsal yanıt geninin tanımlanmasının ardından, elektrofizyoloji ve protein lokalizasyonu gibi ek deneyler kullanılabilir. Örneğin, bu genin rolünü daha ayrıntılı karakterize etmek için, genin meno duyusal iletiminde mi yoksa meno duyusal nöronların gelişiminde mi yer aldığı sorusuna cevap arayabiliriz.

a-behavioral-assay-for-mechanosensation-marcm-based-clones-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Drosophila melanogaster bir yüzyıl 1 aşkın süredir birçok önemli biyolojik işlemlerin moleküler ve hücresel temelini anlamak için kullanılan bir genetik ve davranışsal uysal modeli sistemidir. Drosophila iyi sinek davranışının genetik temeli içgörü kazanmak için istismar edilmiştir.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Bu video, sinek hareketini ölçmek için basit bir yöntemi açıklar ve gerçekleştirilen tırmanma testini gösterir. Sinek tırmanma testi, negatif bir jeotaksi tepkisine dayanan genel bir motor fonksiyon testidir.

Sinek Tırmanma Deneyi: Drosophila melanogaster'de Genel Hareketi Test Etmek İçin Bir Yöntem

Bu video makalede, Drosophila melanogaster uçmak yetişkin meyve koku bağımlı gıda arama davranışı üzerine açlık veya tokluk etkisini ölçmek için otomatik bir deneyi açıklar.

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi Drosophila

Biz Y-labirent testi kullanılarak Drosophila davranışı üzerindeki koku etkisini ortaya çıkarmak için bir seçim testi sunuyoruz.

Test<em&gt; Drosophila</emBir Y-labirenti testi ile&gt; koku alma

Burada, 100'e kadar sirke sineğinin (Drosophila melanogaster) koku alma tepkilerini test etmek için bir davranış kurulumu ve veri analizi yöntemini açıklıyoruz. Bu sistem, tek veya çoklu koku uyaranlarıyla kullanılabilir ve nöronal alt kümelerin optogenetik aktivasyonu veya susturulması için uyarlanabilir.

Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Dört kadranda olfactometer içinde

Burada Drosophila larvalarının soğuk nosisepsiyon incelemek için yeni bir test göstermektedir. Bu deney, bir fokal zararlı soğuk uyan uygulamak edebilen özel bir dahili Peltier prob kullanır ve ölçülebilir soğuk belirli bir davranış ile sonuçlanır. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon başka hücresel ve moleküler diseksiyon sağlayacaktır.

Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Mevcut protokol, Drosophila'nın lokomotor aktivitesini, hız, mesafe vb. parametreleri hesaplamak için yüksek tanımlı video kaydına dayalı olarak her karenin piksellerini segmentlere ayırmak için eklentilerle uyumlu açık kaynaklı yazılım Fiji'yi kullanarak el yapımı bir arenada sineklerin hareketini izleyerek ve analiz ederek değerlendirir.

Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

Bu makale, belirli nöronları aktive etmek ve susturmak için CsChrimson ve GtACR2 kullanarak Drosophila melanogaster'de optogenetik manipülasyon yöntemlerini sunmaktadır. Termotaktik ve tat davranışlarını keşfetmek için optogenetiği kullanmak ve bu süreçleri yöneten altta yatan nöral mekanizmalar hakkında bilgi sağlamak için dört deney tanımlanmıştır.

Drosophila melanogaster'de Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu için Davranışsal Testler

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Bu protokol, Drosophila melanogaster'de stres kaynaklı davranış değişikliklerini değerlendirmek için bir çerçeve sağlar. Tamamlayıcı testlerin birleştirilmesi, bireysel sinekler için aktivite, keşif ve karar verme süreçlerinin nicelendirilmesini sağlar. Yaklaşım esnektir ve stres biyolojisi, metabolizması ve nörodavranışsal fonksiyonları inceleyen geniş bir çalışma yelpazesine uyarlanabilir.

Drosophila melanogaster'de Stres Kaynaklı Depresyona Benzer Durumların Çok Modlu Davranışsal Fenotiplenmesi

Öğrenin Drosophila melanogaster'da mekanosensasyonu etkileyen mutasyonları MARCM yöntemiyle klonlarda davranış analizi kullanarak tespit etmeyi. Bu teknik ölümcül mutasyonları taramaya olanak tanır.

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı

Daha fazla video keşfet