Name: DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Öğrenin, fare kas liflerinde DNA elektroporasyonu ve izolasyon yöntemleriyle protein lokalizasyonunu incelemeyi. Bu teknik transgenik fare üretmeden kas biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NS047726, NS072027 ve AR052646 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

Bu çalışmada yöntemleri kuralları onayladı Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Northwestern Üniversitesi Feinberg School (IACUC) etik uygun olarak yapıldı. Tüm çabalar acıyı en aza indirmek için yapılmıştır. Fare Flexor Digitorum Brevis in vivo Elektroporasyon (FDB) kas Bundle 1. Deney Prosedürü <ol><li> Memeli hücrelerinde eksprese ettiği bilinen bir promoteri kullanılarak in vivo ifadesi için plazmidler tasarım (örneğin, sitomegalovirüs, CMV) ya da kas (örneğin, kas kreatin kinaz, MCK) 6,7. Büyük plazmidler daha düşük seviyelerde ifade edebilir. CMV promoteri yoğun 6,7 kullanılmıştır. </li><li> E. plazmidleri arıtın E. coli, üretici talimatlarına göre endotoksin serbest koşulları kullanılarak hazırlanabilir. 5 ug plazmid / ul - 2 steril, endotoksin serbest TE tamponu içinde plazmid çözülür. </li><li> Seyreltik bir concentratio plasmiti bölmeyinSteril endotoksin serbest TE (2 ug / ml) 10 ul DNA 20 ug n steril mikrosantrifüj tüpü içine enjeksiyon başına tampon. Enjeksiyon başına bir kısım hazırlayın. </li><li> 8 adet nihai yoğunluk, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın, steril fosfat tamponlu salin ile 1x hyaluronidaz stok - (- / PBS) ile seyreltilir. Kısım steril bir mikrosantrifüj tüpe enjeksiyon başına seyreltilmiş hiyalüronidaz 10 ul. </li><li> Sedasyon ve kuyruk veya ayak sıkışmasını yanıt vermeyen kadar% 2.5 izofluran kullanarak fare anestezisi. Normal vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısıtma yastığı veya ısıtma masasına sırt üstü yatırıldı pozisyonda hayvan yerleştirin. </li><li> Bir hazırlık teknik, iğne buradan kaynaklanan ve dışarı doğru yayılan kullanarak bir povidon iyodin fırçalama ve alkol bir alternatif uygulaması ile üç kez fare ayak desteği temizleyin. Bu teknik, patojen giriş en aza indirerek, bir aseptik durumda iğne sitesine sahiptir. </li><li> Th Kapkaççı enjektederi ve steril bir 1 ml şırınga ile kas arasındaki 1x hiyaluronidaz çözeltisi (2 mg / ml = 8 birim) 10 ul e fare. Hyaluronidaz myofibers içine plasmidin daha verimli bir giriş izin vermek için hücre dışı matris bileşenleri sindirir. Topuk üssünde girin ve ayak parmakları doğru iğne ilerlemek. Iğne çekilir yavaş yavaş sıvı bırakın. Deri altına enjeksiyon sitesi genişletmek ve pembe açmak başlayacaktır. </li><li> Tekrarlayın 1.6 ve kontralateral ayak üzerinde 1.7 adımları yineleyin. </li><li> Anestezi ayırın ve tekrar kafese fareyi koyun. Fare tam anestezi kurtarmak için izin verin. </li><li> 2 saat bekleyin. </li><li> , Anestezi ve ayak sterilizasyon prosedürleri tekrarlayın 1.5 ve 1.6 adımları tekrarlayın. </li><li> Hyaluronidase ile aynı şekilde ayak tabanı içine seyreltildi plazmid DNA enjekte edilir. Maksimum hacmi 20 ul veya daha az olduğundan emin olun. Çift plazmid ekspresyon için 20 ve en fazla hacimde her plazmid 20 ug enjekte# 181; l veya daha az. </li><li> Kontralateral ayak tabanı üzerinde plazmid enjeksiyonu tekrarlayın veya kontrol enjeksiyonlar için kontralateral ayak kullanın. </li><li> Başlangıçta enjekte edildi yürüyerek uzak ince forseps ile altını kas cildi kaldırın ve ayak iyileşmek-ayak hattına dik bir pozisyonda ayak yakınında cilt topları ile biri 27 G iğne yerleştirin. İkinci steril 27 G iğne alın ve topuk deri yoluyla yatay olarak yerleştirin. Yer iğneler dışında her ~ diğer 1 cm paralel. </li><li> Iğneler birbirine temas etmeyecek emin paralel iğnelere timsah kelepçeleri, kelepçe elektrotlar kullanarak. Kil modelleme kullanımı yerine kelepçeler güvence altına alabilirsiniz. </li><li> Bir elektrik stimülatörü elektrotları bağlayın. </li><li> 100 V / cm, 1 Hz, 20 baklagiller, süresi 20 milisaniye / her uygulayarak kas Electroporate. Ayak stimülasyonu ile seğirme olabilir. </li><li> Gerekirse kontralateral ayak stimülasyon işlemi tekrarlayın. </li><li>Iğneler çıkarın. Povidon iyot ile ovulur Kapkaççı silin. </li><li> Anestezi kapatın. Kurtarma kafes ve monitör aktivite fare dönün. Beklendiği gibi işlem yapılmıştır ise, hayvan 30 dakika içinde normal ambulasyon kazanması ve enjeksiyon öncesi davranışından ambulasyon veya aktivite düzeyi arasında fark göstermelidir. Bu nedenle, hiçbir işlem sonrası analjezikler ihtiyaç vardır. Kurtarma üzerine, vivaryum hayvan dönün. Not: Protein ifadesi, elektroporasyon sonra kadar erken olarak 48 saat analiz edilebilir. 14 gün elektroporasyon 10 sonra - Bununla birlikte, elektroporasyon sonra daha tam iyileşme sağlamak için, biz 7 tecrit ve myofibers çalışma tercih ederim. İfade 4 hafta sonra, elektroporasyon sürece analiz edilebilir. </li></ol> Fleksör Digitorum Brevis (FDB) Elyaf İzolasyonu 2. Deney Prosedürü <ol><li> Çözülme kollajenaz. Her bir paket için FDB 12 oyuklu doku kültürü plakası, iki kuyu hazırlar. Birinde de 1 m eklemekÖnceden ısıtılmış Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı artı sığır serum albümini (DMEM + BSA) ve l de önceden ısıtılmış Ringers Çözeltisinin 1 ml. Ayrıca, çanak Sylgard 35 mm 1x Ringer solüsyonu taze 10 ml ekleyin. </li><li> Ölümü sağlamak için servikal dislokasyon veya başka bir yöntemle takip CO 2 veya anestezik gaz soluma yoluyla hayvan kurban. </li><li> Temiz bir jilet kullanarak ayak bileği eklemi üzerinde arka ayakları çıkarın ve çanak Sylgard 35 mm 1x Zil çözeltide daldırın. </li><li> Tek ayak sıkı Pin, 5 parmak uçları her yoluyla ve ayak bileğinde 30 G iğne ile Sylgard çanak üzerine, tek yukarı bakacak. </li><li> Ayak bileğinde başlayan, dikkatli nick, düz ayak doğru saç çizgisi boyunca ayak tarafı yukarı derinin altında kas cilt snip. Ayağın diğer tarafta tekrarlayın. </li><li> Ince forseps ile ayak bileği üssünde cilt tutan, topuk boyunca cildi kesti. </li><li> Cildi KaldırmaCilde olarak değil nick kas doğru makas gelin forseps ile flep. Cildi etkili kaldırarak, altta yatan bağ dokusu snip. </li><li> FDB kas demeti kemikten tendon ücretsiz topuk büyük tendonu kesilmiş kaldırın. Forseps ile tendonu tutarak dikkatle makasla FDB bağlı herhangi bir bağ dokusu kaldırarak büyük beyaz tendon gelen FDB paket teşrih. Düzgün yapılırsa paket kolayca bireysel basamak önde gelen parlak beyaz tendonları ortaya yatan tendonların kapalı kaldıracak. Ayak paket kurtararak ayak yakınında tendon FDB kesin. </li><li> Iyi içeren DMEM + BSA bütün kas demeti koyun. </li><li> Kontralateral ayak üzerinde tekrarlayın. </li><li> Bir kez tüm FDB kasları her kuyuya içeren DMEM + BSA ve kas kollajenaz 100 ul ekleyin izole edilmiştir. </li><li> Sindirim öncesinde bir ters flüoresan mikroskop elektroporasyon başarısını kontrol edin. Yapılan properl Eğery,% 90 transfeksiyon randımanının yukarı doğru elde edilebilir. </li><li> Yaklaşık olarak 1 saat süre ile,% 10 CO2 nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. Kuluçka süresi hastalık modeli ve arka plan ve kolajenaz partisine bağlı olarak değişebilir. </li><li> 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde de ihtiva eden tek Ringers çözeltisi FDB paket aktarın. </li><li> 1 ml pipet kullanarak Ringer çözeltisi ile iyi FDB paket Karışım. Paket kolaylıkla pipet geçebilir şekilde temiz bir jilet ile pipet ucu kesilir. Yavaşça paket kaçırmak ve bahşiş paralel aşağı izin kas (~ 15 kez) çiğnemek. Bozulmamış lifler Ringer Çözüm içine kapalı düşecek. Lifler kolayca paket dökmez zaman kollajenaz çözüm geri kas yerleştirin. </li><li> Plaka başına çanak ~ 500 ul izole lifleri Plate. </li><li> Kas 15 dakika boyunca oyuk sindirimi izin verin. </li><li> Yineleyin 2.15 adımları2.17 kadar paket boyutu düşene kadar ve liflerin çoğunluğu demetinin (2-3 kat genellikle toplam) ayrışmış edilir. Bir kez kas kolayca 1 ml pipet ucu geçer ayrışmış. </li><li> Lifler 15 dakika en az çanak eklemek olsun. Taze Ringers çözüm zaman kısıtlamaları bağlı kalan kollajenaz sulandırmak için plakaya eklenebilir veya değiştirilebilir. Not: fiberler şimdi görüntüleme için hazırız. </li></ol> Konfokal Mikroskobu kullanılarak lazer kaynaklı Membran Hasar Görselleştirme 3. Deneysel Prosedürü <ol><li> Yük lifler 2,5 uM, 300 ul Ringer çözeltisi içinde FM 4-64 boya FM 1-43 ile görüntüleme hemen önce. Genellikle, izolasyondan sonra görüntü lifleri 15 dakika 2 saat. Ancak, lifler 24 saat sonrası izolasyon kadar görüntülü olabilir. </li><li> UV lazer ve 60X / 63X objektif ile donatılmış bir konfokal mikroskop cam alt çanak yerleştirin. </li><li> Bir fiber bulun. Lif sıkıca tutturulmuş olduğundan emin olunmikroskop tabanını dokunarak çanak. Ayrışma sürecinde zarar görmüş lifler hariç. Hasarlı lifler kıvırmak zar kabarcıklar, FM boya alımı yüksek düzeyde içeren veya yoğun bükülebilir. </li><li> Fiber membran hasarına neden için, çekirdeklerin net bir alana sahip görüntüleme penceresinin ortasında sarcolemma yerleştirin. Sarcolemma son derece keskin şekilde FM boya kanalını kullanarak sarcolemma odaklanın. </li><li> FM 4-64 kanalı kullanan sarcolemma ROI çapraz saç yerleştirin. </li><li> 3 sn (~ 350 nm alanı x 350 nm) için% 80 güçte bir 1 piksel noktası ışın tedavisi. FM boya yaralanma yerinde hücreye girer. Güç ve zaman artırmak veya hakaret alanını azaltmak için ayarlanabilir. </li><li> , Hasar anındaki hasar öncesi her 2 sn sonrası hasar, en fazla 5 dakika süreyle daha sonra her 10 saniyede bir lif görüntüler yakalayın. Zamanlama ihtiyaca göre ayarlanabilir. Bireysel görüntüleri Görüntü J. zaman atlamalı filmleri dönüştürülebilir </li><li> Adımları tekrarlayınTabak başına en fazla 3 lifleri üzerinde 3.7 ile 3.3. </li></ol>

<ol><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the differentiated state.</a> Science. 230, 758-766 (1985).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li>
<li>Richler, C., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+cultivation+and+differentiation+capacities+of+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines.</a> Dev Biol. 23, 1-22 (1970).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp: JoVE. , (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).</li>
<li>Kerr, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+stabilizes+stress-induced+Ca2%2B+signaling+in+the+transverse+tubule+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).</li>
<li>Anderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropeptide+encoded+by+a+putative+long+noncoding+RNA+regulates+muscle+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance.</a> Cell. 160, 595-606 (2015).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+as+an+assessment+of+functional+rescue+of+dysferlin-deficient+human+myotubes+via+nonsense+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression.</a> J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306(2014).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması vardır.

In vivo olarak, floresan etiketli proteinler çalışma elektroporasyon kullanımı ideal sadakatle kas tüm hücre yapısını taklit Uygun bir hüre hattı modellerinin olmaması ile kas çalışma için uygundur. Bu protokol lazer yaralama sonra protein lokalizasyonu ve translokasyon ayrıntılı görüntüleme sağlamak için elektroporasyon ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanımını açıklar. Bu yöntem hücre iskeleti yeniden, insan ticareti ve füzyon gibi diğer hücresel süreçleri incelemek için adapte edilebilir. <p...

Bireysel myofibers büyük, çok organize sinsityal hücrelerdir. Kas birkaç hücre kültürü modeli vardır; Ancak, bu modeller tam olgun myofibers içine ayırt yok onların ana sınırlama olarak var. Örneğin, C2C12 ve L6 hücre çizgileri farelerde ve sıçanlarda, sırası ile 1-4 elde edilir. Serum açlık koşullarında, tek çekirdekli &quot;miyoblast gibi&quot; hücreler çoğalması ateşkes hücre döngüsü çekilmesi geçmesi ve sarkomer ile çok çekirdekli hücreler oluşturan Miyojenik programa girmek, miyotüplerinin olarak anılacaktır. Uzun süreli kültür koşulları ile miyotüpleri kasılma özellikler gösterebilir ve kültürde &quot;seğirme&quot;. İnsan hücre hatları da hemen 5 tespit edilmiştir. Bu ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına ek olarak, tek çekirdekli miyoblastlar kas ve miyotüpler oluşturacak serum açlık benzer koşullar altında izole edilebilir. Bu hücre hatları ve birincil miyoblast kültürleri çok kullanımı vardırful bu plasmidler ile transfekte ya da virüs ile transduse ve temel hücre biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir, çünkü. Miyotüpler oluşturmak için uyarılan Ancak, bu hücreler, hatta, olgun kas örgütün belirgin özelliklerinden birçoğu yoksundur. Özellikle, miyotüpleri bireysel olgun myofibers çok daha küçüktür ve myofibers normal şeklini yoksundur. Kritik, miyotüpleri enine (T) tübüller eksikliği, myoplasm boyunca verimli Ca 2+ serbest bırakılması için gerekli membranöz ağ. Birincil miyoblast veya myojenik hücre hatlarına alternatif bir yöntem olgun myofibers kullanarak gerektirir. Transgenesis etiketli proteinlerin ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir, ancak bu yöntem pahalı ve zaman alıcı bir iştir. Fare kas in vivo elektroporasyon hızı ve güvenilirliği 6-10 için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. In vivo elektroporasyon ve myofibers ha etkin izolasyon yöntemleriFare fleksör digitorum brevis (FDB) kas 6 için optimize oldum. Yöntemler hali hazırda tamamlanmış ve plazmidlerden in vivo ifadenin uyarılması için minimal invaziv girmektedir. Bu yaklaşım artık sarcolemma 6,7 lazer bozulması sonrasında görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri ile kombine edilir. Floresan boyalar ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu kombinasyonu, olgun myofibers hücre, biyolojik işlemleri izlemek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995-073</td><td>Diseksiyon Ortamı Seyreltme: 50 ml +100 g BSA</td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip II</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17101-015</td><td>Lif Sindirimi Seyreltme: 160 mg / 4 ml DMEM (stok 40 mg / ml alikot)</td></tr><tr><td>Falcon 12 kuyulu yemekler</td><td>Fisher Scientific</td><td>877229</td><td>Lif Sindirim</td></tr><tr><td>Halkaları Çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Lif Sindirimi ve Görüntüleme Seyreltme: 146 mM NaCl 5 mM&nbsp; &nbsp; KCl 2 mM&nbsp; &nbsp; CaCl2 1 mM&nbsp; &nbsp; MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O</td></tr><tr><td>1 ml Pipetler</td><td>Axygen</td><td>T-1000-CR</td><td>Sindirim</td></tr><tr><td>Tıraş Bıçakları</td><td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>Sindirim</td></tr><tr><td>Hassas Kayma 30 G iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Diseksiyon</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-250</td><td>Diseksiyon</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td><td>Diseksiyon</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>FST by Dumont</td> <td># 5/45</td><td>Diseksiyon</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-4913</td><td>Diseksiyon</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500260</td><td>Diseksiyon</td></tr><tr><td></td><td>BSA Sigma</td><td>A7906</td><td>Diseksiyon media Seyreltme: 100 mg / 50 ml DMEM</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm bulaşıklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772B</td><td>Diseksiyon - sylgard</td></tr><tr><td>Kil</td><td></td><td></td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Stimülatörünü tutmak için kullanılır&nbsp;</td><td>Çim</td><td>s88x</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Kelepçeleri</td><td>Radyo Kulübesi</td><td>270-356</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Triadine</td><td>Aplicare</td><td>82-220</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Hassas Kayma 27 G iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Simülatörü</td><td>Çim</td><td>SIU-V</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Gazlı Bez</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Enjeksiyon Seyreltme: 40 & mikroya 160 ul PBS (1x) ekleyin; l 5x stok</td></tr><tr><td>1 cc U-100 İnsülin Şırıngası (28G1 / 2) &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>Enjeksiyon</td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Enjeksiyon</td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı Microwell çanağı</td><td>MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mikroskopi</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>T-13320</td><td>Mikroskopi Seyreltme: Son 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>T-35356</td><td>Mikroskopi Seyreltme: Son 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>Endotoksinsiz Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plazmit Saflaştırması</td></tr></tbody></table>

dna elektroporasyon, myofibers İzolasyon ve görüntüleme

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Olgun kas, canlı hücre görüntülemeye uygun benzersiz bir yapıya sahiptir. Burada, fleksör digitorum brevis (FDB) kasında floresan olarak işaretlenmiş proteinleri eksprese etmek için deneysel protokolü açıklıyoruz. Koşullar, kas hasarını en aza indirirken elektroporasyonlu plazmidi eksprese eden çok sayıda yüksek kaliteli miyofiber sağlamak için optimize edilmiştir. Yöntem, çeşitli proteinler üzerinde floresan etiketler kullanır. Bu ekspresyon yönteminin yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile birleştirilmesi, lazer kaynaklı hasardan sonra görüntüleme de dahil olmak üzere canlı hücre görüntülemeye izin verir. Floresan etiketli proteinlerin görüntülenmesi ile birleştirilen floresan boyalar, kasın temel yapısı ve uyaranlara tepkisi hakkında bilgi sağlar.

Elektroporasyon verimli fleksör digitorum brevis (FDB) kas demeti (Şekil 1A) içine saflaştırılmış plazmid DNA tanıtır minimal invaziv bir tekniktir. Yedi gün transfeksiyon floresan etiketli protein izole myofibers (Şekil 1B) görüntülenmiştir yazı. İzole edilmiş lifler, daha sonra kaplama ve konfokal mikroskop görüntüleme için hazırlanır. Fiberler, lazer kaynaklı yaralanmalara maruz bırakılabilir. FM boya membran zararının alan tespit etmek için kullanıla...

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Bu prosedürün genel amacı, sarkolemmaya daha sonra lazerle yara verilerek zarar verebilmek için farelerin flexor digitorum brevis kasından miyo fiberleri izole etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, transgenik fareler üretmek zorunda kalmadan olgun miyo fiberlerinde protein fonksiyonunun ve lokalizasyonunun incelenebilmesidir. Bu yöntem, farmasötik ajanları ve diğer hücre yaralama yöntemlerini test etmek için uyarlanabilir.Kollajenaz çözeltisinin çözülmesiyle başlayın. Ardından, 12 kuyucuklu bir plakadan iki kuyucuk hazırlayın. Bir kuyucukta izole edilecek her fiber için bir mililitre ön ısıtılmış, BSA eklenmiş DMEM ekleyin; diğer kuyucuğu ise bir mililitre ön ısıtılmış 1x Ringer çözeltisi ile doldurun.Ayrıca, 10 mL taze 1x Ringer çözeltisi içeren 35 mm'lik bir petri kabı hazırlayın. Transfekte edilen hayvanın ayaklarını çıkardıktan sonra, her birinin beş parmak ucundan 30 gauge iğneler geçirerek bir ayağı, tabanı yukarı bakacak şekilde petri kabına sıkıca sabitleyin. Ayak bileği kısmında, her bir ayağı şu şekilde hazırlayın.Öncelikle deriyi kesin. Ayak bileğinden başlayın ve saç çizgisi boyunca ayak parmaklarına doğru kesin. Derinin altındaki kaslara zarar vermemeye dikkat edin.Ard

dna-electroporation-isolation-and-imaging-of-myofibers

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

Bu video, hasat edilen murin Ekstansör Digitorum Longus (EDL) kasından tek miyoliflerin izolasyonunu göstermektedir. İzole edilen miyofiberler, miyofiber ile ilişkili kas kök hücre aktivitesini incelemek için kültürlenebilir.

Myofiber İzolasyonu: Hasat Edilen Fare Ekstansör Digitorum Longus (EDL) Kasından Tek Myofiber Elde Etme Tekniği

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokolde, kas kök hücreleri için endojen nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyan bir in vitro kültleme ve fonksiyonel analiz yöntemi tanımlanmıştır.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Bu protokol, oksidatif soleus'tan sağlam tek kas liflerinin izole edilmesini ve bu liflerden türetilen yüksek saf miyoblast kültürlerinin oluşturulmasını açıklar. Optimize edilmiş prosedür, fare başına yaklaşık 300–500 sağlam miyofiber elde ederek sonraki moleküler ve hücresel analizleri mümkün kılar.

Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi

Öğrenin, fare kas liflerinde DNA elektroporasyonu ve izolasyon yöntemleriyle protein lokalizasyonunu incelemeyi. Bu teknik transgenik fare üretmeden kas biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir alternatif sunar.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Daha fazla video keşfet