DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

Bu prosedürün genel amacı, myo liflerini farelerin flekso digitorum brevisinden izole etmektir, böylece sarkolemma daha sonra lazer yaralaması yoluyla hasar görebilir. Bu tekniğin temel avantajı, transgenik fareler oluşturmak zorunda kalmadan olgun myo liflerinde protein fonksiyonu ve lokalizasyonunun incelenebilmesidir. Bu yöntem, farmasötik ajanları ve diğer hücre yaralama yöntemlerini test etmek için uyarlanabilir.

Kollajenaz çözeltisini çözerek başlayın. Daha sonra, 12 oyuklu bir plakadan iki kuyu hazırlayın. Her bir elyafın birinde izole edilmesi için, bir mililitre ön ısıtma ekleyin, DMEM artı BSA, diğerini bir mililitre Ön Isıtma bir x zil sesi ile iyice yükleyin.

Ayrıca 10 mililitre taze bir x zil ile 35 milimetrelik bir puro tabağı hazırlayın. Ayakları transfekte edilmiş hayvandan çıkardıktan sonra, beş ayak ucunun her birinden 30 gauge iğne ile puro kabına yukarı bakacak şekilde bir ayak sıkı taban pimi. Ve ayak bileğinde, her ayağı aşağıdaki gibi hazırlayın.

İlk önce cildi kesin. Ayak bileğinden başlayın ve saç çizgisi boyunca ayak parmaklarına kadar kesin. Derinin altındaki kasları çentiklememeye dikkat edin.

Ardından, cildi ayak bileğinin tabanından kavrayın ve topuğu kesin. Ardından forseps kullanarak deri kanadını kaldırın ve makası kasa değil cilde doğrultun ve cildi çıkarmak için bağ dokusunu dikkatlice kesin. Şimdi FDB kasını çıkarmak için, kemikten kurtarmak için topuktaki büyük tendonu kesmekle başlayın.

Ardından FDB demetini büyük beyaz tendondan ayırın. Bu işlemde bağlı bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Tamamlandığında, parmaklara giden parlak beyaz tendonları ortaya çıkarmak için demetleri alttaki tendonlardan kaldırın.

Demet kolayca kalkmalıdır. Daha sonra ayak parmaklarının yakınındaki beyaz tendonu keserek demeti ayaktan kurtarın. Kas demetini DMEM artı BSA'nın kuyusuna aktarın ve devam etmeden önce işlemi diğer ayağınızda tekrarlayın.

Artık metin protokolünde ele alınan elektroporasyonun başarısını kontrol etmek mümkündür. Bu tanılama kontrolünü ters çevrilmiş bir floresan mikroskopta gerçekleştirin. Başarılı olursa, transfeksiyon verimliliği %90'a kadar çıkabilirTüm FDB demetleri izole edildikten sonra, her birine 100 mikrolitre kollajenaz çözeltisi ekleyin.

Plakayı, yaklaşık bir saat% 10 karbondioksit atmosferi ile nemlendirilmiş 37 santigrat derece bir inkübatörde inkübe edin. Bu, hastalık modelleri arasında değişecektir ve ayrıca enzimlerin verimliliğine de bağlıdır. Kuluçka tamamlandıktan sonra, FDB demetlerini dikkatlice zil çözeltisine aktarın.

Wells daha sonra genişletilmiş bir deliğe sahip bir mililitrelik bir pipet kullanarak demetleri tritrate edin, bunu yineleme sırasında yaklaşık 15 kez nazikçe yapın, sağlam liflerin çözeltiye düştüğünü gözlemleyin. Bu gerçekleşmezse, kollajenazdaki inkübasyonun uzatılması gerekir. Sindirime uygun dikkat.

Bu prosedürde titrasyonun süresi ve gücü çok önemlidir. Aşırı sindirim, lif parçalanması ve sarco leal hasarı meydana gelebilir ve bu da optimal olmayan bir kas hazırlığına yol açabilir. Şimdi izole edilmiş lifleri çözelti içinde toplayın ve yarım mililitreye kadar çözeltiyi kültür plakasına aktarın.

Kasların 15 dakika daha sindirilmesine izin vermeye devam edin. Daha sonra tasyonu tekrarlayın ve gerekirse izole edilen lifleri tekrar toplayın. 15 dakika daha bekleyin ve işlemi üçüncü kez tekrarlayın.

Liflerin tabağa en az 15 dakika yapışmasına izin verildikten sonra, kalan kollajenazı taze halkalarla seyreltin veya çözeltiyi tamamen değiştirin. Lifler artık plazmid görüntüleme için hazırdır. Floresan etiketli protein için DNA kodlaması, FDB kas demetine transfekte edildi.

CMV promotörü bu amaç için çok uygundur. Floresan, elektroporasyondan yedi gün sonra izole edilmiş birkaç myo lifinde görülebilir. Daha sonra FDB kası sindirildi ve bu süreçte myo lifleri izole edildi.

Miyo liflerinde hasar, beyaz okla gösterildiği gibi meydana gelebilir. Siyah oklar, sarkolemma zarındaki çırpınmayı göstermektedir. Bu tür lifler deneyden çıkarıldı.

Yaralanmamış myo lifleri DIC fm kullanılarak görüntülendi. Yaralanmadan önce miyofiber membranda minimal FM 4 64 floresan numarası 4 64 mevcuttu. FM yüklü myo liflerinin konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi daha fazla ayrıntıyı ortaya çıkardı.

Ortalanmış miyofiber çekirdekten yoksundur. Bu tür çekirdekler FM boya analizini etkileyebilir ve membran hasarına neden olmaktan kaçınılmalıdır. ROI artı işaretini FM D pozitif sarkomun üzerine yerleştirin, ustalaştıktan sonra membran ablasyon protokolüne başlayın.

Bu teknik yaklaşık olarak iki saat içerisinde tamamlanabilir. Ve bu prosedürü denerken, sindirim süresinin kollajenaz aktivitesi, genetik arka plan ve hastalık modeli türünden etkilendiğini hatırlamak önemlidir.