Hazırlık ve Test zehirlilik için hızlı değerlendirme İçme Suyu Örnekleri için RTgill-W1 Hücreleri ile akışkan bioçipler Empedans tabanlı

Bu prosedürün genel amacı, içme suyu numunelerinin toksisitesini değerlendirmek için bir biyosensörün nasıl kullanılacağını göstermektir. Bu, tek katmanlı gökkuşağı alabalığı solungaç hücreleri içeren biyoçipler oluşturarak ve daha sonra bunları empedans tabanlı bir biyosensörün parçası olarak kullanarak gerçekleştirilir. Bu prosedür, içme suyu kaynaklarındaki kimyasal toksisiteyi insan sağlığı ile ilgili seviyelerde hızlı bir şekilde tespit etmenin bir yolunu sağlar.

Bu tekniğin başlıca avantajları, biyoçiplerin saha koşullarında kullanılabilmesi, hücrelere herhangi bir bakım veya bakım yapılmadan dokuz aya kadar soğuk olarak saklanabilmesi ve test için hazır durumda olmaları ve soğutmadan çıkarıldıktan sonra herhangi bir noktada kullanılabilmeleridir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir lisans öğrencisi olan Jordan McNairn olacaktır. Hücre tohumlamasından bir gün önce, biyoçipleri ambalajlarından çıkarın ve sterilize edilmiş plastik alet kutularına yerleştirin.

Boru tertibatlarından birini şırıngaya takın ve 20 mililitrelik bir şırıngaya% 20'lik bir ağartma çözeltisi hazırlayın. Biyoçipin her kanalına iki mililitre çözelti enjekte edin. Bittiğinde, biyoçiplerin çamaşır suyu çözeltisi ile bir saat oturmasına izin verin.

Bir saat sonra, ağartıcı çözeltisini her iki kanaldan aspire etmek için bir vakum hattına bağlı bir erkek kayma luer tertibatı ile donatılmış steril bir mililitrelik şırınga kullanın. Ağartıcıyı biyoçipten aspire ettikten sonra, biyoçipleri durularken drenaj olarak kullanmak için biyoçipe her iki ucunda erkek kayma luerleri olan steril bir boru tertibatı takın. Daha sonra, steril suyu 20 mililitrelik bir şırıngaya çekin ve çipin her bir kanalını beş mililitre su ile yıkayın.

Suyu daha önce olduğu gibi vakumla aspire edin. Ve biyoçipleri plastik alet kutularına geri yerleştirin. Biyoçipleri ertesi güne kadar biyo-güvenlik başlığında bırakın.

Biyoçiplerin tohumlanmasından bir saat önce, biyoçipin her bir kanalına mililitre fibronektin çözeltisi başına iki mililitre 10 mikrogram enjekte edin. Biyoçipleri biyo-güvenlik başlığında 60 dakika boyunca inkübe edin ve ardından fibronektin çözeltisini vakumla aspire edin. Son olarak, biyoçiplerin portlarına iki steril biyoçip boru düzeneği yerleştirin ve hücreler tohumlamaya hazır olana kadar biyoçipleri bir kenara koyun.

Gökkuşağı alabalığı solungaç epitel hücreleri içeren birleşik bir T-175 şişesini inkübatörden çıkarın ve biyo-güvenlik başlığına yerleştirin. Bir birleşik T-175 şişesi, yaklaşık 16 biyoçip tohumlayabilecektir. Medyayı hücrelerden aspire edin.

Bunları PBS ile durulayın ve PBS'yi aspire edin. Ve sonra hücre katmanına altı mililitre Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika inkübe edin.

Ardından, tripsini devre dışı bırakmak için her şişeye 15 mililitre tam L-15 hücre kültürü ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonundan küçük bir alikot alın ve hücrelerin konsantrasyonunu ölçmek için bir hemositometre kullanın. 10x objektif ile donatılmış parlak bir alan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin.

Ardından, mevcut hücre konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre süspansiyonunu mililitre başına çeyrek milyon hücre konsantrasyonuna ayarlayın. Daha sonra, biyoçipin her bir kanalının dış portuna 2,5 mililitre hücre süspansiyonu enjekte etmek için steril bir 20 mililitre şırınga kullanın. Ekstra hücre süspansiyonunun borudan bir atık kabına akmasına izin verin.

Ardından, hortumun serbest ucunu bir luer bağlantısı ile her kanal için dış bağlantı noktasına sokarak her bir biyoçip kanalı için kapalı bir döngü oluşturun. Ardından, bir kağıt havluyu %70 etanol ile nemlendirin ve kapalı döngülerdeki fazla ortamı silmek için kullanın. Ardından, biyoçipleri plastik bir kutuya geri koyun.

Dördüncü ve yedinci günlerde, biyoçipleri inkübatörden çıkarın. Ve biyoçiplerdeki ortamı, sıcaklık dengelenmiş tam L-15 hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Yedinci gün beslemeden sonra, hortumları cipslerden çıkarın ve atın ve otoklav tahliye tapalarını biyoçiplere takın.

Biyoçipleri, test için kullanılana kadar altı santigrat derece inkübatörde bir kutuya yerleştirin. ECIS test okuyucusunu ve sarf malzemelerini taşıma çantasından çıkarın ve ardından okuyucuyu açın. Ayrıca, hazırlanan biyoçiplerden birini altı santigrat derece inkübatörden çıkarın ve bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.

10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, 10 mililitre kontrol suyunu etiketli 0,5 onsluk şeffaf plastik kontrol kavanozuna dağıtın. Doğru bir ölçüm için baloncukları çıkardığınızdan emin olun. Ardından, ayrı bir şırınga kullanın ve 10 mililitre test örneğini 0,5 onsluk şeffaf plastik bir test kavanozuna dağıtın.

Ardından, iki toz haline getirilmiş ortam şişesini çıkarın. Toz haline getirilmiş ortam şişelerinden birini açın ve bir şişenin tüm içeriğini kontrol suyu ile kavanoza dökün ve tüm şişeyi de çözeltiye bırakın. Bu işlemi test kavanozu ile tekrarlayın.

Ardından, tozun tamamen çözüldüğünden emin olmak için kavanozların kapağını kapatın ve sallayın. Mavi 10 mililitrelik şırıngayı dokuz mililitre kontrol solüsyonu ile doldurun. Ve kırmızı 10 mililitrelik şırınga, ilgili şişelerinden dokuz mililitre test çözeltisi ile.

Şırıngalardaki mevcut hava kabarcıklarını çıkarın. Ardından, tapaları biyoçip bağlantı noktalarından çıkarın ve tahliyeyi takın. Biyoçipi ECIS okuyucudaki çıkarılabilir plastik tepsiye yerleştirin, kapağı kapatın ve ardından doldurulmuş şırıngaları dış biyoçip portlarına takın.

Son olarak, şırınga pistonlarını takın. Okuyucunun ana ekranından, ön testi başlatmak için İleri'yi seçin. Yazılım daha sonra ilk empedansları kontrol edecektir.

Empedanslar aralık içindeyse, ekran Kartuş geçti" seçeneğini kaydedecek ve kullanıcıya İleri'yi seçmesi talimatını verecektir. Ardından, yazılım klavyesi kullanarak örnek bilgileri girin ve işiniz bittiğinde Kabul Et'i seçin. Bu noktada, takılan biyoçipten iki dakikalık empedans verileri toplanacak ve bir ekran zamanlayıcısı geri sayım süresi olacaktır.

İki dakika sonra İleri'ye basın. Yanıp sönen yeşil bir kutu tarafından istendiğinde, numuneleri şimdi enjekte edin "kontrol ve test ortamını ekli şırıngalardan aynı anda biyoçip kanallarına enjekte edin. Bittiğinde şırıngaları biyoçiplerin üzerinde yerinde bırakın.

ECIS okuyucu yazılımı, test sırasında herhangi bir noktada tedavi kanalının kontrol kanalından istatistiksel olarak farklı olduğunu belirlerse, ekran görüntüsü numunenin kontamine olduğunu gösterecektir. Aksi takdirde, izleme süresinin sonunda herhangi bir kontaminasyon tespit edilmediğini gösterecektir. Test sonuçlarını her numune için "Kontamine veya Kontamine Değil" olarak kaydedin.

Test çalışmasının sonunda biyoçipi çıkarın ve atın. Testler sırasında şırıngaları, test şişelerini ve biyoçipi barındıran çıkarılabilir plastik tepsiyi durulayın ve havayla kurutun. Burada gösterilen 13 kimyasal, içme suyunun olası kirleticileri olabilecek geniş bir toksik endüstriyel bileşik yelpazesinin temsilcileri olarak test edilmek üzere seçilmiştir.

Test sırasında, 13 kişiden dokuzu, insan sağlığı ile ilgili konsantrasyonlarda bir saat içinde elektrik hücresi substrat empedansı algılaması ile tespit edildi. Bir elektrik hücresi substrat empedans algılama testinden sonra görülecek tipik çıktılar burada gösterilmektedir. Kontamine numuneler, kontrol edilen temiz su numuneleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük empedans seviyeleri ile sonuçlanır.

Bu videoyu izledikten sonra, tek katmanlı gökkuşağı alabalığı solungaç epitel hücreleri ile bir biyoçipin nasıl hazırlanacağını ve daha sonra bu biyoçipin içme suyu toksisitesinin değerlendirilmesi için empedans bazlı bir toksisite testinde nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, biyoçiplerin hazırlanmasında aseptik olarak çalışmayı ve ayrıca biyoçipleri kullanılana kadar buzdolabında tutmayı unutmamak önemlidir. Her biyoçip yalnızca bir kez kullanılabilir ve daha sonra atılmalıdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, biyoçip hazırlığı yaklaşık 10 dakika içinde yapılabilir. Bu bir tahmindir, çünkü cipsler gruplar halinde hazırlanır. Numune hazırlama da dahil olmak üzere numune empedans testi, uygun şekilde yapılırsa yaklaşık bir saat 10 dakika sürer.

Bu prosedürü takiben, şüpheli kimyasal veya kimyasalları tanımlamak için kontamine bir sonuç veren bir numune üzerinde analitik kimya gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, su toksisitesi algılama ile ilgilenen araştırmacıların gökkuşağı alabalığı, solungaç epitel hücreleri ve empedans algılama kullanan teknolojiyi kullanmalarının önünü açmaktadır. Teknikleri faydalı bulacağınızı umuyoruz ve bu yeni yeteneklerin kolaylaştırmaya yardımcı olabileceği gelecekteki yenilikleri dört gözle bekliyoruz.

Teşekkür ederim ve iyi günler.