Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Bu protokolün genel amacı, siliyer mutant fare kokleasını düzlemsel hücre polaritesi fenotipleri açısından incelemektir. Bu teknikler, koklear fenotipin kapsamlı bir şekilde detaylandırılmasına izin verir, bu da omurgalı PCP sinyallemesinin oluşturulmasında siliyer tutulumun daha kesin bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu protokolün ana avantajı, bir kez ustalaştıktan sonra, diseke koklear epitelin çeşitli farklı fenotipik analiz türleri için kullanılabilmesidir.

Deney hayvanlarından reaktifler ve dokular hazırlandıktan sonra, gelişim aşaması E16.5 ila p3'te, kafayı burundan başlayıp kotile uzanan sagital orta hat boyunca incelemek için bir neşter bıçağı veya küçük bir makas kullanın. Beyni kafatasının her iki yarısından bir çift forseps ile çıkarın. Ardından, iç kulağın gelişmekte olan kemikli labirentlerini içeren temporal kemikleri tanımlayın.

Numune ile diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, forsepsleri kemikli labirentlerin altından nazikçe geçirerek kemikli labirentleri kafatasından uzaklaştırmak için bir çift forseps kullanın. Diseksiyonu takiben, oval ve yuvarlak pencereleri temizlemek için diseksiyon forsepslerinin ucunu kullanın ve koklear spiralin tepesinde küçük bir delik açın. Daha sonra, kemikli labirentleri 1.5 mililitre% 4 paraformaldehit içinde beş dakika boyunca buz üzerinde sabitleyin, böylece tektoriyal zarın kolayca çıkarılmasını sağlayın.

Şimdi, kemikli labirentleri, diseksiyonu kolaylaştırmak için PBS içeren siyah silikon elastomer kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirin. Dış kıkırdağı çıkarmak için beş numaralı forseps kullanın ve koklear kanalı açığa çıkarın. Oval pencereden başlayın, forsepsin alt ucunu oval pencereye yerleştirin ve kıkırdağı yavaşça yukarı doğru hareket ettirerek yavaşça kaldırın.

Ardından, Reissner zarını koklear kanalın tabanında sıkıştırmak için ince bir forseps kullanın ve yukarı doğru bir hareketle soyun. Duyusal epitel de dahil olmak üzere koklear kanalın dorsal yönünü görselleştirin. Ardından, kokleanın tabanındaki tektoryal zarı sıkıştırmak için 55 numaralı forseps kullanın ve tepeye doğru yukarı doğru soyun.

İmmünohistokimya ile en iyi görüntüleri elde etmek için tektoryal membranın tamamen çıkarılması gerekir ve taramalı elektron mikroskobu için gereklidir. Corti organını açığa çıkardıktan sonra, dokuyu daha fazla sabitleyin ve immünohistokimya yapın veya protokolün yazılı bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi taramalı elektron mikroskobu için hazırlanın. Doku lekelendikten sonra, numuneyi PBS içeren siyah bir silikon elastomer tabağa yerleştirin.

İnce forseps kullanarak, vestibüler bölgeyi koklear spiralden çıkarın. Ardından, alttaki kıkırdağı ve mezenşimi koklear spiralden çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Kalan koklear spiral, iç sulkusu, Corti organını ve dış sulkusu içerir.

Koklear spirali bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilmiş bir damla PBS'ye aktarın. PBS'yi emici bir doku veya filtre kağıdı parçasıyla fitilleyin ve epitel kaymış ve kendi üzerine binmişse koklear spirali nazikçe yeniden konumlandırın. Bir damla montaj ortamını doğrudan koklea örneğine ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli bir şekilde doğrudan numunenin üzerine bir kapak fişi yerleştirin.

Koklear kıl hücresinin apikal yüzeyinin görüntülerini yakalamak için yüksek büyütme ve yüksek sayısal açıklık objektifleri ile donatılmış bir epifloresan veya lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Koklear kanalın uzunluğunu ölçmek için koklear spiralin üst üste binen görüntülerini çekmek için daha düşük objektifleri kullanın. Aşağıdaki resimler, doğum sonrası birinci gün tipi koklea olan bazal dönüşün immünofloresan boyamasını göstermektedir.

Phalloidin, stereosiliadaki filamentli aktini ve hücre çevresindeki kortikal aktini etiketler. Miyozin VIIA, iç ve dış saç hücreleri için bir belirteçtir. ZO_1, hücreler arasındaki sıkı bağlantıları etiketler, bu da onu hücre sınırlarını ayırt etmek için harika bir işaretleyici yapar.

Asetillenmiş alfa-tubulin, beyaz okla gösterildiği gibi, demetin tepe noktasındaki kinocilium için bir işaretleyici olarak kullanılır. İç mikrotübüller ayrıca, beyaz yıldızlarla gösterildiği gibi, özellikle sütun hücrelerinde bol miktarda bulunan asetillenmiş alfa-tübülin ile etiketlenir. Asetillenmiş tübülin ile boyanmış E18.5'teki disseke koklear kanalların bu görüntüsü, kontrole kıyasla IFT20 koşullu nakavt koklear kanallarının belirgin şekilde kısaldığını göstermektedir.

Aşağıdaki görüntü, doğum sonrası sıfırıncı günde bir BBS8 nakavt farelerinde bazal koklear dönüşün tam montajlı bir hazırlığıdır. BBS8 nakavt koklealarındaki stereosiliyer demetler, sağ okla gösterildiği gibi değişken bir şekilde döndürülür veya orta okla gösterildiği gibi düzleştirilir ve yanlış lokalize edilir. Kinosilia yanlış lokalize veya sol okla gösterildiği gibi aksonemler eksik.

Koklear fenotipi analiz için hazırlarken, genetik arka plandaki farklılıkların koklear fenotipi değiştirebileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, analiz için littermate kontrollerini kullanmak önemlidir. Diğer analizler arasında, çeşitli sinyal aktivatörleri veya inhibitörleri ile tedaviye izin veren ve böylece ilgili gelişimsel süreçlerin mekanik olarak anlaşılmasına katkıda bulunan koklear eksplantların odyometrik testleri ve kültürlenmesi yer almaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, siliyer bileşenlerin rolünü ve bunların PCP sinyali üzerindeki farklı etkilerini analiz etmek için koklear dokunun nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.