Name: Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Keşfedin fare kochleasında düzlem-hücre-polarite fenotiplerini analiz etme yöntemlerini. Bu protokol, silyum mutantlarında PCP sinyalini ve iç kulak gelişimini anlamak için immunohistokimya ve taramalı elektron mikroskobisi kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar yazının eleştirel değerlendirilmesi için Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer ve Zoe Mann teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sofja Kovalevskaya Ödülü (Humbodlt Vakfı) ve Johannes-Gutenberg Üniversitesi, Mainz, Almanya tarafından finanse edildi.

<ol><li>Waters, A. M., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%3A+an+expanding+disease+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies: an expanding disease spectrum.</a> Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).</li>
<li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+Wnt+signaling%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1, 7(2012).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Ezan, J., Montcouquiol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+planar+cell+polarity+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting planar cell polarity in the inner ear.</a> Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).</li>
<li>Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Noncanonical+Wnt+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways.</a> Cell. 131, 1378(2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37, 980-985 (2005).</li>
<li>Montcouquiol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Vangl2+and+Scrb1+as+planar+polarity+genes+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals.</a> Nature. 423, 173-177 (2003).</li>
<li>May-Simera, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+Bbs8+and+Ift20+promote+planar+cell+polarity+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea.</a> Development. 142, 555-566 (2015).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nat Genet. 40, 69-77 (2008).</li>
<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hearing research. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+hair+bundle+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the hair bundle and mechanotransduction.</a> The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+deveoping+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse.</a> J. Neurocytol. , 821-835 (1999).</li>
<li>Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinocilium+of+auditory+hair+cells+and+evidence+for+its+morphogenetic+role+during+the+regeneration+of+stereocilia+and+cuticular+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates.</a> Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+developing+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse.</a> Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).</li>
<li>van Dam, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SYSCILIA+gold+standard+%28SCGSv1%29+of+known+ciliary+components+and+its+applications+within+a+systems+biology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium.</a> Cilia. 2, 7(2013).</li>
<li>Blacque, O. E., Sanders, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+within+a+compartment%3A+what+C.+elegans+can+tell+us+about+ciliary+subdomain+composition%2C+biogenesis%2C+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease.</a> Organogenesis. 10, 126-137 (2014).</li>
<li>Wallingford, J. B., Mitchell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strange+as+it+may+seem%3A+the+many+links+between+Wnt+signaling%2C+planar+cell+polarity%2C+and+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia.</a> Genes & development. 25, 201-213 (2011).</li>
<li>Borovina, A., Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFT88+plays+a+cilia-+and+PCP-independent+role+in+controlling+oriented+cell+divisions+during+vertebrate+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development.</a> Cell reports. 5, 37-43 (2013).</li>
<li>Huang, P., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dampened+Hedgehog+signaling+but+normal+Wnt+signaling+in+zebrafish+without+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia.</a> Development. 136, 3089-3098 (2009).</li>
<li>Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+not+required+for+normal+canonical+Wnt+signaling+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo.</a> PloS one. 4, e6839(2009).</li>
<li>Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy%3A+preparation+and+imaging+for+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM.</a> Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Celsr1+disrupts+planar+polarity+of+inner+ear+hair+cells+and+causes+severe+neural+tube+defects+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse.</a> Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Frizzled3+and+Frizzled6+in+neural+tube+closure+and+in+the+planar+polarity+of+inner-ear+sensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).</li>
<li>Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+planar+polarity+proteins+in+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).</li>
<li>May-Simera, H., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+planar+cell+polarity+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).</li>
<li>Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+phenotypes+between+different+vangl2+mutants+demonstrates+dominant+effects+of+the+Looptail+mutation+during+hair+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development.</a> PloS one. 7, e31988(2012).</li>
<li>Rachel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Cep290+and+Mkks+ciliopathy+alleles+in+mice+rescues+sensory+defects+and+restores+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis.</a> J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).</li>
<li>Jagger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alstrom+Syndrome+protein+ALMS1+localizes+to+basal+bodies+of+cochlear+hair+cells+and+regulates+cilium-dependent+planar+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity.</a> Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).</li>
<li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alstrom+Syndrome+Protein%2C+ALMS1%2C+Interacts+with+alpha-Actinin+and+Components+of+the+Endosome+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway.</a> PloS one. 7, e37925(2012).</li>
<li>Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+refinement+of+auditory+hair+cell+planar+polarity+deficits+occurs+in+the+absence+of+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).</li>
<li>Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usher+syndrome+protein+network+functions+in+the+retina+and+their+relation+to+other+retinal+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies.</a> Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).</li>
<li>Hebert, J. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+cre+to+the+Foxg1+%28BF-1%29+locus+mediates+loxP+recombination+in+the+telencephalon+and+other+developing+head+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures.</a> Dev Biol. 222, 296-306 (2000).</li>
<li>Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Measurement+of+the+auditory+brainstem+response+%28ABR%29+to+study+auditory+sensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).</li>
<li>Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Assessment+of+cochlear+function+in+mice%3A+distortion-product+otoacoustic+emissions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).</li>
<li>Finetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+required+for+polarized+recycling+of+the+TCR%2FCD3+complex+to+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse.</a> Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).</li>
<li>Sedmak, T., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+molecules+in+ciliary+and+nonciliary+cells+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina.</a> J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons%3A+ciliary+proteins+reach+beyond+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia.</a> Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).</li>
<li>Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+blueprint+at+the+apical+surface+establishes+planar+asymmetry+in+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells.</a> Developmental cell. 27, 88-102 (2013).</li>
<li>Ezan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+migration+depends+on+G-protein+signalling+control+of+subapical+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton.</a> Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).</li>
</ol>

Yazar, rekabet eden herhangi bir mali çıkar beyan etmemektedir.

analiz için koklear doku hazırlanırken, akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, genetik arka planda farklılıklar gerekli analiz ve tek yavru kontrollerle karşılaştırılması hale koklear fenotip değiştirebilirsiniz. İkincisi, örtü oluşturan zarın tam olarak çıkarılması immünhistokimya ile en iyi görüntü elde etmek için gerekli ve SEM için gereklidir edilir. örtü oluşturan zar opak bir yapıdır ve görüntüleme daha zorlu hale altındaki doğrudan duyusal epitel hücreleri önünü kapatabilir. Bazen işlem s...

Birincil kirpikler birçok memeli hücre yüzeyinden uzanan uzun bir mikrotübül göre uzantıları vardır. Birincil kirpikler sıklıkla hangi zaman hücre başına birden fazla var, hareketli kirpikler ile karıştırılmamalıdır ve Amacı membran yüzeyleri boyunca sıvıyı taşımak için vardır. Birincil sil, aksine, duyu rol kabul eder ve buna bağlı olarak aynı zamanda, duyusal kirpikler adlandırılır. Bir kez çoktan unutulmuş, bu organel son zamanlarda insan genetik hastalıklar 1 çok sayıda ile dernek sonucunda &#39;yeniden keşfedilen&#39; olmuştur. İdeal bir sinyal organel olarak konumlandırılmış, birincil kirpik sayısız sinyal doku homeostazında ve hastalık değil, sadece önemli olan birçok yollar, aynı zamanda gelişim 2 sırasında düzenleyen gösterilmiştir. kirpikler fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir birinci sinyal yollarının bir düzlemsel hücre polarite (PCP) yol olarak da bilinen standart olmayan Wnt oldu <sup<html> &gt; 3. Başlangıçta Drosophila tanımlanan bu sinyal çağlayan, embriyogenez için kritik öneme sahiptir; yakınsama ve uzatma işlemleri için özellikle ve epitel 4 düzleminde hücrelerin doğru yönlendirmesi için. Düzenleyici proteinler kümesi çekirdeğin sıralı sinyal sonuçta hücre iskeleti düzenlenmeleri yol açabilir ve bir düzlemde 5 epitel hücrelerinin koordine polarizasyon neden yönlü ipuçları çevirir. Yakınsama ve uzatma işlemi kesinlikle uzamasına koklear kanal ve doğru hücresel desenlendirme 6 için gereklidir. Bu PCP yolunun aktivasyonu yoluyla düzenlenir olarak, koklea PCP mutantlar en çarpıcı fenotipleri bir dağınık duyusal epitel 7 kısaltılmış koklear kanal olduğunu. Düzenlenir bu aydınlatılamamıştır gerekmektedir tam olarak nasıl olsa Benzer şekilde, aynı zamanda, kirpikler eksikliği fare mutantlar, böyle bir yakınsama ve uzatma fenotip 8,9 sergilerler. yakınsama ve uzatma işlemleri koklear kanalın akıbet ve koklear kanal içinde duyusal epitel hücre desenlendirme için kritik olduğundan ve_content &quot;&gt;, gelişmekte olan koklea omurgalı gelişimi sırasında PCP sinyalizasyon incelemek için ideal bir organdır. organı Corti, koklear kanal, muntazam 10 çalışması kokleadaki için yönelik olmalıdır olmayan duyu destek hücreleri ve mechanosensory saç hücrelerinin oluşur hatları uzman duyusal epiteline verilen terim. mechanosensory saç hücreleri yani çünkü denir cuticular plaka uzanan stereociliary demetleri her duyusal saç hücre 11 (apikal yüzeyi). mechanosensation ve stereocilia olarak adlandırılması rağmen birincil dönüştürücüler gibi bu hareket, aslında modifiye aktin filament esaslı mikrovilluslar oluşmaktadır. her zikzak şeklinde saçlar içinde demet, stereocilia üç satır bir çok sipariş edilen ve düzenli pa düzenlenirBir merdiven durumda benzeri şekilde ttern. Gerçek mikrotübül göre sil, olarak adlandırılan kinocilia, stereociliary demetlerin 12 geliştirilmesi ve yönlendirme için gereklidir. her hücre üzerine tek kinocilium fiziksel stereocilia uzun satıra merkezi bitişik olarak bulunur stereocilia demetine takılır. Kinocilium kesin işlevi belirsizdir ve bir hipotez onlar mikrovillus 12 olgun olarak kinocilium şekle stereocilia &#39;çeker&#39; olmasıdır. Omurgalılarda, koklea kinocilia geçici de yer alır ve 11,13,14 işitme başlangıcından önce farelerde saç hücrelerden geri. Ciddi kısaltılmış koklear kanallarda gelişen koklea sonuçlarında kirpikler tamamen kaybedilmesi yanlış oluşmuş ve stereociliary demetleri yanı sıra yanlış yerleştirilmiş bazal organları 8,9 mis odaklı. Fonksiyonel kirpik sadece siliyer aksonem oluşan değildir. cilia ile ilgili birçok proteinfonksiyonu, bazal vücut geçiş bölgesi ya da silier aksonem 15 olarak kirpikler-ilişkili alt etki alanları lokalize kompleksleri meydana gelir. sentrozom annesi centriole türetilen bazal vücut, hücre vücuda uzak cilium uzanan mikrotübüller için mikrotübül organize merkezidir ve hücre içi ticaretini yanı sıra siliyer ticaretini düzenleyen. Siliyer geçiş zonu siliyer fonksiyon siliyer bileşiklerinin 16 ithalat ve ihracat organize bakımından düzenlenmiştir başka bölgedir. Kesin mekanizması 17 belirsiz olmasına rağmen birçok çalışma, kirpikler ve kurallı olmayan Wnt (PCP sinyal) arasında bir bağlantı tespit ettik. Silier ve PCP genlerinin yedekleme ve genelleştirilmiş hücresel anormallikler hücre polarite duyarlılığı, zor doğrudan PCP özgü açıkları bir mutasyon bağlantı yapmak. PCP sinyalizasyon okuma çıkışları biri bazal vücut ve Primar konumlandırma olduğunuy kirpik, bu nedenle ikincil kusurları birincil yavru zordur. Zebra balığı ve fare mutantlar Bazı çalışmalar 18-20 sinyalizasyon kirpikler ve Wnt arasında bir bağlantı olduğunu ileri sürmüştür. verilerdeki Farklılıklar türler, doku ya da Wnt sinyal yolunda siliyer katkıları temporal bağımlı farklılıkları yansıtıyor olabilir. bazal organları işlevsel kalır Ayrıca, eğer normal bir Wnt yanıt muhafaza edilebilir. hücresel sinyal yolları ve diğer biyolojik olayların içinde siliyer proteinlerinin rolü daha derin bir anlayış bizim hücresel ve gelişimsel biyoloji anlayışı yanı sıra hedeflenen tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için için çok önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Araç/Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon elastomer - Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td>Bkz. Not 2</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon makası-düz bıçak</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps (no. 5 ve 55) ve künt forseps</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu.</td><td>Çeşitli Kaplamasız</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cam mikroskop slaytları</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak kızakları (22 mm ve kez; 40 mm ve kez; 0,15 mm)</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minutien pimleri</td><td>&nbsp; Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SEM numune tutucu</td><td>tousimis</td><td>8762</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu saplamaları</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Sekmeleri: Karbon yapıştırıcı</td><td>TED PELLA</td><td>16084-3</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskop</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kritik Nokta Kurutucu</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taramalı Elektron Mikroskobu</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam mikroskop slaytları</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Doku&nbsp;</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce Boya Fırçası Reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kez; Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp; (PFA) (EM için gerekli EM notu)</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>1 kez% 4'lük bir çözelti hazırlayın; PBS her seferinde taze yapılır. EM için gerekli EM notu.</td></tr><tr><td>% 2.5 Glutaraldehit Grade1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7.5)</td> <td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Eşek Anti-Fare IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Montaj ortamı</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>10 kez; Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco/Yaşam Teknolojileri</td><td>14065</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco/Yaşam Teknolojileri</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit (OsO4)</td> <td>Sigma-Aldrich/Fluka Analitik</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Tanik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 kanıt</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti Arl13b</td><td>Protein Tech</td><td>17711-1-AP</td><td>Önerilen konsantrasyon 1: 1.000</td></tr><tr><td>anti asetillenmiş tübülin (611-B1)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>Önerilen konsantrasyon 1: 800</td></tr><tr><td>anti gama tübülin (GTU-88)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td>Önerilen konsantrasyon 1: 200</td></tr><tr><td>anti Zo_1 & nbsp;</td><td>Invitrojen</td><td>40-2300</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:500</td></tr><tr><td>Miyozin VI</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6791</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:1000</td></tr><tr><td>Miyozin VIIa</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:1.000</td></tr><tr><td>anti Vangl2</td><td>Merk Millipore</td><td>ABN373</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:250</td></tr><tr><td>anti G & alfa; i3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4040</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:300 - 1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Önerilen konsantrasyon 1:300 - 1.000</td></tr></tbody></table>

ciliopathy fare mutant kohlea planar-hücre-polarite fenotipleri değerlendirilmesi

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Son yıllarda, primer kirpikler çok sayıda sinyal yolunu etkileyerek gelişim ve hastalıkta anahtar düzenleyiciler olarak ortaya çıkmıştır. Siliyer fonksiyonla ilişkili olduğu gösterilen en eski sinyal yollarından biri, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyali olarak da adlandırılan kanonik olmayan Wnt sinyal yoluydu. Omurgalı gelişimi sırasında düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyallemesinin etkilerini incelemek için en iyi yerlerden biri memeli kokleasıdır. Fare kokleasındaki PCP sinyal bozulması, tümü silia disfonksiyonundan etkilenen koklear büyümeyi, hücresel modellemeyi ve tüy hücresi oryantasyonunu bozar. Bu protokolün amacı, gelişmekte olan memeli kokleasında PCP sinyalizasyonunun fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analizini tanımlamaktır. Yakınsama ve ekstansiyondaki kusurlar, koklear kanalın kısalması ve/veya hücresel paternlemedeki değişiklikler olarak kendini gösterir ve bu, gelişmekte olan fare mutantlarından diseksiyon sonrasında ölçülebilir. Stereosiliyer demet oryantasyonu ve kinocilia uzunluğu veya pozisyonundaki değişiklikler, immünofloresan veya taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak gözlemlenebilir ve ölçülebilir. Siliyer proteinlerin hücresel sinyal yolaklarındaki ve diğer biyolojik olaylardaki rolüne ilişkin daha derin bir kavrayış, hücresel ve gelişimsel biyolojiyi anlamamızın yanı sıra hedefe yönelik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Salyangoz Diseksiyon ve Doku Hazırlanması Beynin çıkarılmasından sonra, (Şekil 1A, beyaz ok) görüntülenmiştir ve kaldırılabilir arkadan görülen bir P0 fare kafası, kemik labirent, post orta hat sagital diseksiyon. Şekil 1B koklear saçlı izole kemik labirentler gösterir yukarı, ventral (sol) ve arkasından bakan, dorsal (sağda). oval pencereye beyaz ok noktaları hangi bir dış kı...

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Bu protokolün genel amacı, siliyer mutant fare kokleasını düzlemsel hücre polaritesi (PCP) fenotipleri açısından incelemektir. Bu teknikler, koklear fenotipin ayrıntılı bir şekilde ortaya çıkarılmasını sağlayarak, omurgalı PCP sinyalizasyonunun kurulmasında siliyer katılımın daha kesin bir şekilde anlaşılmasına olanak tanır. Bu protokolün temel avantajı, yöntem kavrandıktan sonra, diseke edilen koklear epitelin çeşitli farklı fenotipik analiz türleri için kullanılabilmesidir.E16.5 ile p3 arası gelişim aşamasındaki deney hayvanlarından reaktifler ve dokular hazırlandıktan sonra, burundan başlayıp kotileye kadar uzanan sagital orta hat boyunca başı diseke etmek için bir bistüri ucu veya küçük bir makas kullanın. Beyni, kafatasının her iki yarısından bir penset yardımıyla çıkarın. Ardından, iç kulağın gelişmekte olan kemik labirentlerini içeren temporal kemikleri belirleyin.Numuneyle bir diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, pensle kemik labirentlerin altından nazikçe geçerek onları kafatasından ayırın. Diseksiyondan sonra, diseksiyon pensinin ucuyla oval ve yuvarlak pencereleri temizleyin ve koklear spiralin apeksinde küçük bir delik açın. Ardından, tektoryal membranın kolayca çıkarılmasını sağlamak için kemik labirentleri buz üzerinde, 1,5 mililitre %4 paraformaldehit içinde beş dakika sabitleyin.Şimdi, diseksiyonu kolaylaştırmak için PBS içeren, siyah silikon elastomer kaplı bir diseksiyon kabına kemiksi labirentleri yerleştirin. Koklear duktunu açığa çıkarmak için dış kıkırdağı uzaklaştırmak üzere 5 numara forseps kullanın. Oval pencereden başlayarak, forsepsin uç kısmını oval pencereye yerleştirin ve kıkırdağı nazikçe kanırtarak yavaşça apexe doğru yukarı yönlü hareket edin.Ardından, ince uçlu bir penset kullanarak koklear kanalın tabanındaki Reissner membranını sıkıştırın ve yukarı doğru bir hareketle soyun. Sensör epitel dahil olmak üzere koklear kanalın dorsal kısmını görüntüleyin. Daha sonra, kokleanın tabanındaki tektorial membranı sıkıştırmak için 55 numara penset kullanın ve apeks yönünde yukarı doğru soyun.İmmünohistokimya ile en iyi görüntüleri elde etmek için tektoryal membranının tamamen uzaklaştırılması gerekir ve bu işlem taramalı elektron mikroskobu için temel şarttır. Corti organı açığa çıkarıldıktan sonra, protokolün yazılı bölümünde detaylandırıldığı üzere dokuyu daha fazla fikse edin ve immünohistokimya uygulayın veya taramalı elektron mikroskobu için hazırlık yapın. Doku boyandıktan sonra, numuneyi PBS içeren siyah bir silikon elastomer kaba yerleştirin.Hassas pensler kullanarak, vestibüler bölgeyi koklear spiralden ayırın. Ardından, koklear spiralin altındaki kıkırdak ve mezankimi çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Geriye kalan koklear spiral; iç oluk, Corti organı ve dış oluğu içerir.Koklear spirali, bir lam üzerine yerleştirilmiş bir damla PBS'ye aktarın. PBS'yi emici bir doku veya filtre kağıdı parçasıyla çekin ve eğer epitel tabakası kaymışsa ve kendi üzerine biniyorsa koklear spirali nazikçe yeniden konumlandırın. Doğrudan koklea örneğinin üzerine bir damla kapatma medyumu ekleyin ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek bir lamelliği nazikçe örneğin üzerine yerleştirin.Koklear tüy hücresinin apikal yüzeyinin görüntülerini yakalamak için yüksek büyütmeli ve yüksek sayısal açıklıklı objektiflerle donatılmış bir epifloresan veya lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Koklear kanalın uzunluğunu belirlemek için koklear spiralin üst üste binen görüntülerini almak üzere daha düşük büyütmeli objektifler kullanın. Aşağıdaki görüntüler, doğum sonrası birinci gün tipindeki kokleanın bazal kıvrımının immünofloresan boyamasını göstermektedir.Faloidin, stereosiliyumlardaki filamentli aktini ve hücre çevresindeki kortikal aktini işaretler. Miyozin VIIA, iç ve dış tüy hücreleri için bir belirteçtir. ZO_1, hücreler arasındaki sıkı bağlantıları işaretleyerek onu hücre sınırlarını ayırt etmek için mükemmel bir belirteç haline getirir.Asetillenmiş alfa-tübulin, beyaz okla belirtilen demetin tepe noktasındaki kinosilin için bir belirteç olarak kullanılmıştır. İç mikrotübüller de asetillenmiş alfa-tübulin ile işaretlenmiştir ve bunlar, beyaz yıldızlarla gösterildiği üzere özellikle sütun hücrelerinde bol miktarda bulunur. E18.5 dönemindeki diseke koklear kanalların asetillenmiş tübulin ile boyanmış bu görüntüsü, IFT20 koşullu nakavt koklear kanalların kontrole kıyasla belirgin şekilde kısaldığını göstermektedir.Aşağıdaki görüntü, postnatal sıfırıncı gündeki bir BBS8 nakavt faresinin bazal koklear kıvrımının tüm monte (whole-mount) preparasyonudur. BBS8 nakavt koklealarındaki stereosiliyer demetler, sağ okla belirtildiği gibi değişken şekilde rotasyona uğramış veya orta okla belirtildiği gibi basıklaşmış ve yanlış konumlanmıştır. Sol okla belirtildiği gibi kinosiliyalar yanlış konumlanmıştır veya aksonemler eksiktir.Koklear fenotip analiz için hazırlanırken, genetik altyapıdaki farklılıkların koklear fenotipi değiştirebileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, analizlerde aynı batından kontrol hayvanların kullanılması önem taşır. İleriki analizler arasında, çeşitli sinyal aktivatörleri veya inhibitörleri ile işlem yapılmasına olanak tanıyan ve böylece ilgili gelişimsel süreçlerin mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlayan odyometrik testler ve koklear eksplant kültürleme yer almaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, siliyer bileşenlerin rolünü ve bunların PCP sinyalizasyonu üzerindeki belirgin etkilerini analiz etmek için koklear dokunun nasıl hazırlanacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Akış sitometrisi, spesifik hücre popülasyonlarının izole edilmesine ve incelenmesine olanak tanıyan güçlü bir araçtır. Bu protokol, neonatal transgenik farelerin koklear dokularından LacZ eksprese eden hücrelerin izole edilme adımlarını açıklamaktadır. Dissosiye edilmiş koklear hücreler, akış sitometrisi ile ayrılmadan önce β-galaktosidazın floresan konjuge substratları kullanılarak işaretlenmiştir.

Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Tüm mount ve histolojik analiz için postnatal farelerden işitsel bül, kapsül ve kemikçikleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Bu çalışma, farklı yaşlarda farenin iç kulağından endolenfatik kesenin nasıl diseksiyon yapılacağını açıklamaktadır. Benzer bir diseksiyonun sonucu, endolenfatik kesenin genişlemesinin bir Slc26a4-null fare modelinde gösterilmiştir. Endolenfatik kese içinde eksprese edilen bir floresan raportöre sahip bir transgenik fare, endolenfatik kesesi kolayca görselleştirmek için bir model ve eğitim aracı olarak sunulmaktadır.

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Keşfedin fare kochleasında düzlem-hücre-polarite fenotiplerini analiz etme yöntemlerini. Bu protokol, silyum mutantlarında PCP sinyalini ve iç kulak gelişimini anlamak için immunohistokimya ve taramalı elektron mikroskobisi kullanır.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet