Name: Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Öğrenin, yetişkin fare korti organını üç tam dönüş olarak izole etmek için tam dağı diseksiyon ve immünofloresan yöntemini. Bu teknik, saç hücreleri ve destek hücrelerinin üç boyutlu yapısını korur ve konfokal mikroskopi ile görüntülemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Deniz Araştırmaları Ofisi'nden (N000141310569) bir hibe ile desteklenmiştir. Southern Illinois Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Görüntüleme Tesisi ekipmanı, Ulusal Araştırma Kaynakları-Sağlık Merkezi (S10RR027716) tarafından desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Tıp Southern Illinois University School Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Temporal Bones 1. Ekstraksiyon <ol><li> Fare kafatası 13 tabanındaki zamansal kemikler tespit ve standart model forseps kullanılarak kranial sinirler kazınması. </li><li> Kapsüllü koklea çıkarmak için otik kapsül ucunda aşağı posteriyor semisirküler kanal üzerinde ters elle basının başparmak ile standart model forseps yerleştirin. </li><li> El başparmak ve işaret parmağı ile ya da 10.5 cm ince makas kullanarak kafatası temporal kemiğin alt yarısı boşaltın. </li></ol> 2. Geçici Bones Post-fix <ol><li> 10 mM fosfat tamponlanmış tuzlu su içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) pH 7.4 ile inkubasyondan - 250 ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüpleri içine zamansal kemikler yerleştirin20 saat - 2 RT&#39;de yedik. NOT: yuvarlak veya oval pencereye PFA apikal kap veya enjeksiyon Hiçbir açılması gereklidir. Cam şişe içinde% 16 konsantrasyonda satın alınabilir metanol ücretsiz, ultra saf, elektron mikroskobu (EM) notu PFA kullanmanızı öneririz. Bir şişe açıldı ve 1 seyreltilmiş sonra:% 4 çözelti haline PBS 4 (Bazı antikorlar tolere edebilir kısa tespiti ve diğerleri gerektiren 4 o C&#39;de saklandığında, o kadar 2 hafta boyunca kullanılabilecek O / N (O / N) tespit). </li></ol> 3. decalcify Temporal Bones <ol><li> Tespit edildikten sonra, bir pipet kullanılarak, PFA çıkarın ve 120 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), biraz daha fazla 2 ml ile değiştirin. Tüp kapalı olduğunda hava kabarcıkları önlemek için tüm 2 ml&#39;lik ependorf tüp doldurmak için emin olun. <ol><li> Hemen dekalsifiye Eğer değilse, o 4 ° C&#39;de 10 mM PBS, pH 7,4 ve mağaza örnekleri ile PFA yerine Not: Tespit edildikten sonra, temporal kemik variab saklanabilirle antijenleri bağlı dekalsifikasyon incelenmeden önce zaman tutarındadır. </li></ol></li><li> Uçtan aşırı uca rotator yerleştirin tüpler ve RT&#39;de 4 rpm&#39;de döndürün. Bir pipet kullanarak günlük EDTA çözeltisi değiştirin. Dekalsifikasyon uzunluğu numunesinin yaş ve diseksiyon yaparak bilim adamı tercihine bağlıdır. <ol><li> Inkübasyon sürelerinde aşağıdaki yönergeleri kullanarak EDTA temporal kemikler inkübe: 8 P15 numunelerin doğum sonrası gün (P): 2-4 saat; P21 için numuneler P15 için: O / N; P30 örnekleri P21 için: 2 O / N; 3 ya da daha fazla, O / N: P30 daha büyük numuneler için. NOT: Decalcification süreleri kullanıcıların tercihine tabidir ve gerektiği gibi uzatılabilir. Decalcification süresi yaklaşık 8 saat arayla, günde iki kez EDTA çözeltisi değiştirerek düşürülebilir. Bulaşmasını önlemek için daha uzun bir süre için 3 gün dekalsifiye Bazı laboratuarlar EDTA solüsyonuna% 1 PFA ekleyin. </li></ol></li><li> Numune yeterince dekalsifiye ise o zamansal kemikler koyun belirlemek içinna silikon diseksiyonu çanak elastomer kaplamalı ve yavaşça salyangoz şeklindeki koklea üzerine forseps basın. Doku süngerimsi ise, yumuşatma işlemi tamamlanır. </li><li> Yumuşatma işlemi tamamlandıktan sonra, bir pipet kullanılarak EDTA çıkarın ve 10 mM PBS pH 7.4, 500 -1000 ul ekle. Kadar hazır 4 o C&#39;de saklayın örnekleri incelemek için. </li></ol> 4. Silikon Elastomer kaplı Diseksiyon Dish oluştur <ol><li> Taban ve üreticinin talimatlarına göre bir silikon elastomer kapsülleyici kitinin sertleştiriciyi birleştirin ve iyice karıştırın. </li><li> Çözüm siyah olana kadar toz kömür 3 yemek kaşığı ve iyice karıştırın - yaklaşık 2 ekleyin. NOT: Sıvı mürekkep veya sıvı kömür solüsyonu ile karıştırmak olmaz ve kullanılamaz. Silikon elastomer enkapsülant kitleri adım 4.2 atlanabilir sağlayan siyah satın alınabilir. </li><li> Kaplamak için yeterli alt doldurma 60 mm cam veya plastik petri kaplarının içine solüsyonu dökülür. Bu takdirdebbles, mevcut yüzey üzerinde hava ile puf. Ayarlamak için oda sıcaklığında en az 24 saat bekletilir. Not: Silikon elastomer kaplı tabaklar yıl tekrar tekrar kullanılabilir. Bu silikon elastomer çatlamasına neden olur Ancak, temizlik için etanol kullanmayın. </li></ol> (P7 ve Yaşlı Örnekleri için) Kohlea 5. Tüm Dağı Diseksiyon <ol><li> Orta / apikal döner bazal dönüş ayırın <ol><li> 10 mM PBS pH 7.4 ile üçte ikisi dolu dolu bir silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak bir dekalsifiye zamansal kemik yerleştirin ve aşağıdaki adımlar için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. </li><li> 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ve 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanılarak vestibüler bölgede zamansal kemiği tutun, kenarları boyunca ve apeks yukarıda aşırı otik kapsül doku kesip. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, oval pencere içine bir bıçak takın ve spiral ligament / yanal boyunca birkaç küçük kesikler yapmakBazal dönüş duvarı. </li><li> 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve temporal kemik dışında diğer bıçağı yerleştirin oval pencereye medial. Bu kesim, orta ve apikal döner gelen bazal dönüş ayırır. </li></ol></li><li> Bazal dönüş tam diseksiyonu. <ol><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, bazal sırayla gerginliği ve vestibüler organların ayrılması bazal dönüş kesim için modiolus bağlanmak spiral ganglion sinir liflerini kesti. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, Corti organı yukarıda ve aşağıda hem spiral ligament / lateral duvar kaldırmak için küçük kesikler bir dizi yapmak. Doku rehberlik 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanın. Silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak spiral ganglion sinir liflerini Pin, ancak doku gözyaşı gibi bu bölgede tutunmaya yok. </li><li> Önceki adımlarda, Reissner en membranın bazı sırasındae sık sık silinecektir. Herhangi hala kalırsa, 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ile Reissner en zarı kavramak ve Corti organı uzak çekin. NOT: örtü oluşturan zar nadiren görülür ve genellikle kaldırılması için özel bir adım gerektirmeden uzak yüzer. </li><li> Sonunda için, mümkün olduğunca düz dönüş yapmak ve spiral ganglion kalan aksonlar tutarak, disseke bazal dönüşü aktarmak için 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanmak için, spiral ganglion akson kalınlığını azaltmak için çeşitli kesimler yapmak Bir 48-yuvalı plaka (veya odacık slayt) 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul ihtiva etmektedir. </li></ol></li><li> Ayrı orta ve apikal dönüşler <ol><li> Koklea, aşağı apikal tarafında kalan üçte ikisini yerleştirin. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, kullanılan orta dönüş bazal dönüş bağlanacak scala ortamı içine bir bıçak yerleştirin ve th spiral ligament / yan duvar boyunca birkaç küçük kesikler yapmake orta dönüş. </li><li> 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece bıçağın üstüne yerleştirilir orta çevirmek ile kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve apikal ucundan 90 o açıyla, kemikli labirent dışında diğer bıçağı yerleştirin. Bu tepe dönüş gelen orta dönüş ayırır. </li></ol></li><li> Bazal da benzer bir şekilde, orta dönüş tam diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız). </li><li> Apikal dönüş tam diseksiyonu. <ol><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, apikal dönüş kapsayan kapağı açın. Bazal da benzer bir şekilde komple diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız). Not: Dissected koklear döner immün önce birkaç hafta içinde 4 o C&#39;de 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) içinde 10 mM PBS, pH 7.4 içinde saklanabilir. Üzerine bakteriyel veya mantar büyümesi neden olabilir 3 hafta - Ancak PBS uzun 2&#39;den buharlaşması ve periyodik olarak doldurulan gerekiyor ve depolama olacakgörüntünün kalitesini düşürebilir doku. Biz undissected temporal kemik olarak numunelerin uzun vadeli depolama öneririz. </li></ol></li></ol> Floresan Tagged Antikorlar 6. immün <ol><li> Diseksiyon sonra, 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul batırılmış bir 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) ayrı bir kuyunun her koklear dönüş depolar. Aşağıdaki adımlardan her biri için koklear dönüş, sıvı batık gereken üstte yüzen değil ya da kuyunun yanına yapışmış. NOT: her bir sıvının sökerken, bu koklear dönüşler kaybetmek ya da pipet o kadar emmek için kolaydır. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak 200 ul pipet ile çözümler Değişen bu önlemeye yardımcı olur. </li><li> Bir pipet kullanarak, her bir oyuğa PBS çıkarıp yerine ~ 200 - / bloke permeabilizasyon çözeltisi (oyuk başına 300 ul% 1 Triton X-100,% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS) 10 mM PBS içinde seyreltilmiş pH 7.4). 3B rotator oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Not: kullanılan herhangi bir birincil antikor, bir keçi konukçuda yapılmış ise, o zaman ikinci bir anti-keçi antikoru gerekli olacak ve NGS herhangi bir aşaması için kullanılmamalıdır gerekir. Normal at serumu NGS için bir yedek olarak kullanılabilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak bloke / geçirimli hale çözeltisini çıkarın ve primer antikor çözeltisi, oyuk başına 100 ul ~ ile değiştirin (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). Her primer antikor için sulandırma faktörü değişir. 3D döndürücüde 4 o C&#39;de O / N (en az 14 saat) inkübe edin. Not: birden çok birincil antikoru kullanıldığında, tüm sadece her birincil antikor farklı ev sahibi olduğundan emin olun, inkübasyon için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak birincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. Her bir yıkama 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum kuluçkaya. </li><li> Geçen P kaldırBS, bir pipet kullanılarak ve ikincil antikor çözeltisinin oyuk başına 100 ul ile ul yerine yıkama (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). 500 ya da 1: 1000 her biri için sulandırma faktörü floresan ikincil antikor, genellikle 1 olan etiketli. Floresan ışıktan korumak sekonder antikorlar etiketli bir kara kutu 48-plaka koyun. 3B rotator oda sıcaklığında 3 saat - 2 inkübe edin. Not: birden fazla ikincil antikor ihtiyaç varsa, inkubasyondan için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. Çapraz etiketleme imkanı yoktur emin olun (örn., Keçi anti-tavşan ve tavuk anti-keçi ikincil antikorlar kullanarak) </li><li> Bir pipet kullanılarak ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. </li><li> Bir pipet kullanarak son PBS yıkama çıkarın ve Hoec oyuk başına ~ 100 ul ile değiştirinçekirdekleri etiketlemek için: hst 33.342 (10 mM PBS pH 7.4 2,000 1 seyreltilmiş). 3B rotator oda sıcaklığında 20 dakika - 15 inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. Uzun 20 dakika inkübe yapmayın. </li><li> Bir pipet kullanılarak Hoechst çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. </li><li> Gerekirse tüm adımlar birkaç saat, Hoechst inkübasyon hariç uzatılabilir. Herhangi bir aşamada reaksiyonu durdurmak için, sadece 10 mM PBS pH 7.4 ~ 500 ul örnekleri batırmayın ve protokol saat veya 1 sürdürmek için hazır olana kadar 4 o C&#39;de 48 eh plaka (veya bölme slayt) saklamak - 2 gün sonra . </li></ol> 7. Dağı Koklear slaytlar açar <ol><li> Etiket kullanılan örnek ve antikorlar konusunda ilgili bilgiler slaytlar. </li><li> Pipet montaj medya ~ 50 ul her slayt üzerine ve dikkatli olmakkabarcıklarını engellemek için. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için montaj ortamı içeren tüp santrifüj. </li><li> 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanarak, hafifçe montaj medyada slayt ve yere 48 plaka itibaren bir koklear dönüş transfer spiral ganglion aksonları kavramak. Slayt başına Dağı tek koklear dönüş görüntüleme işlemi sırasında ışığa maruz ve photobleaching önlemek için. </li><li> Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, kullanım # 4 ya da 5. düz kuyumcu forseps koklear dönüş yeniden konumlandırmak için. </li><li> Slayt üzerinde bir lamel bir ucunu yerleştirin ve yavaşça lamel düşmesine izin için bırakın. </li><li> Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, yavaşça koklear dönüş yeniden konumlandırmak için ileri ve geri lamel hareket ettirin. </li><li> Yer slaytlarböylece bir slayt klasörüne onlar düz koymak. Montaj edelim medya kür O / oda sıcaklığında N (DARK tutmak) </li><li> Net oje ve mağaza oda sıcaklığında veya -20 o C Seal lamelleri kadar görüntülenmiş. Slaytlar slayt klasör veya slayt kutusunda saklanabilir. NOT: Slaytlar -20 o C veya -80 o C ve floresan uzun süreli saklanabilir birkaç ay için muhafaza edilecektir. </li><li> Immün işlemi sırasında kullanılan ikincil antikorlar göre uygun dalga boyunda bir konfokal mikroskop kullanılarak Görüntü slaytlar. Parlaklık ve kontrast ayarı konfokal satıcı tarafından sunulan görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Başarılı tüm montaj diseksiyonu ve immün için birkaç kritik adımlar vardır. Bu yöntemlerden birini gerçekleştirilir Ancak önce, koklear dokusunun uygun sabitleme gereklidir. Biz metanol, ücretsiz, ultra saf, EM dereceli PFA kullanmanızı öneririz. PFA metanol ve immünofloresan kalitesini düşüren dengesiz bir pH izlerini olabilir toz yaptı. Diğer gruplar, benzer diseksiyon formaldehit 14-16 içermeyen kullanılarak mümkün olan sabitleyiciler olduğunu göstermiştir. Sabitleme uzunluğu da önemlidir ve antikor ...

Temporal kemik içinde yer alan iç kulağın spiral şekilli koklea, Corti, memelilerde işitsel duyu uç organ organı ev sahipliği yapmaktadır. Koklea tonotopically düzenlenen ve yaygın olarak apikal ortadan ayrılır ve bazal tepesi 1 taban ve düşük frekans tespiti yüksek frekanslı ses algılama ile farklı frekans bölgelerine tekabül eden döner bir. Saç hücreleri, Corti organı mechanosensory hücreleri, farelerin 2,3 yaklaşık 6 mm uzunluğunda koklea, uzunluğu çalıştırın. Bu hücreler, merkezi işitsel yapıları tarafından işlenen sinirsel sinyalleri içine, sıvı dolu Membranöz labirent aracılığıyla iletilen ses dalgalarının, mekanik enerjiyi dönüştürmek. Burada anlatılan teknik, (yaş bir hafta yetişkinliğe kadar numuneler için) koklea kalsifikasyonu sonra Corti organı tüm bağlar hazırlanması için bir yöntem, tamamlandığında içerir. Ayrıca immunosta için bir yöntem mevcutbütün ining koklear doku monte edilebilir. Koklear bütün bağlar tüm saç hücrelerinin görselleştirme ve doğal uzamsal düzenlemeler destekleyici hücrelerin çevredeki için çok önemlidir ve konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu olarak analiz için izin. Dr. Hans Engstrom ve Harlow Ades aslında onlar hızla mikroskopik analiz 4 Corti organı kısa bozulmamış kesimleri koruyarak, düzeltmek ve memelilerin çeşitli sıvı batık kalsifiye cochleae incelemek için bir teknik detaylı 1966 yılında bir bütün montaj koklear diseksiyon yöntemi tarif. Bir sabitlenmemiş, kalsifiye sıçan Kokleanın diseksiyonu da bir öğretim video 5&#39;te gösterilen edilmiştir. Dr. Barbara Bohne ve Washington Üniversitesinde Gary Harding bu yönteme pek çok önemli değişiklikler yaptı. Koklear tüm montaj yönteminin kendi versiyonunda, temporal kemik, dekalsifiye oldu plastik gömülü ve beş yarım dönüşler veya on çeyrek dönüşler dissec edildited 6,7. O plastik gömme 8 gerekli değildi bu yüzden Dr. Charles Liberman ve Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Göz ve Kulak Infirmary&#39;de meslektaşları, bu tekniği modifiye. Tekniğin daha da modifikasyon Burada sunulan diseksiyon yöntemi haberdar St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi 9-12 Dr. Jian Zuo&#39;nun laboratuarında meydana geldi. Biz tam apikal, orta ve bazal dönüşler izolasyonuna izin veren Bohne ve Liberman daha Corti, organı erişmek için farklı bir strateji kullanın. Böylece disseke doku büyük ve diseksiyon veya immün işlemleri sırasında kayıp ya da hasar olasılığı daha azdır. Buna ek olarak, güncel yöntem apikal uç veya frekans bölgesini tanımlamak için bazal kanca mesafenin ölçülmesini kolaylaştırır. Birçok laboratuarları koklear dokusunun immün gerçekleştirin rağmen bu yöntem nereden geldiğini, bu belli değildir. Bunun sonucunda Buffe engellemek için çeşitli tarifler vardırrs ve bireysel birincil antikor performansını etkileyebilir antikor inkübasyon tamponları. Burada, işitsel alanda en yaygın olarak kullanılan antikorlar için de geçerlidir floresan isim levhası antikor ile immünboyama için bir yöntem sunulmaktadır. Koklea karmaşık şekli, Corti organı hassas yapısı ve kemik kapatma histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sağlamak. Çeşitli teknikler şu anda bu zor özellikleri aşmak ve Corti, kendi avantajları ve dezavantajları ile her tekniğin organı içindeki hücreleri görselleştirmek için işitme alanında kullanılmaktadır. Burada sunulan protokol küçük bir değişiklikle, potansiyel olarak bu alanda kullanılan diğer model organizmaların çeşitli cochleae içindeki kritik yapılara incelemek için kullanılabilir, yetişkin fare koklea bütün montaj diseksiyon sağlar ve.

<table><tbody><tr><td>Standart&nbsp; desen forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11000-12</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>10,5 cm ince makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14060-11</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>2 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>%16 formaldehit, metanol içermez, ultra saf, EM sınıfı</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>ZEHİRLİ --eldiven giyin ve lavaboya atmayın. Diğer satıcılardan satın alınabilir.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr>uçtan<td>uca tüp döndürücü</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>60 mm petri kabı</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 silikon kapsülleyici kiti</td><td>Ellsworth Yapıştırıcılar</td><td>184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>aktif kömür</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>stereo diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Dumont #4 kuyumcu forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kuyumcu forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mm Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15001-08</td><td>kavisli&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15003-08</td><td>düz</td></tr><tr><td>48 oyuklu plakalar</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>8 kuyulu oda kızakları</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>BSA, kesir V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>diğer satıcılardan satın</td></tr> alınabilir <tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>diğer satıcılardan satın</td></tr> alınabilir <tr><td>3D döndürücü</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Western blot kuluçka kutusu XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>Prolong altın antifade montaj ortamı</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir, ancak montaj ortamları foto ağartmaya karşı koruma yeteneklerine göre farklılık gösterir</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>lameller 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>şeffaf oje</td> Yerel <td>eczane</td><td></td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>karton slayt klasörü</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr><tr><td>plastik sürgülü kutu</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>diğer satıcılardan satın alınabilir</td></tr></tbody></table>

tüm dağı diseksiyon ve yetişkin fare kohlea immünofloresan

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

İç kulağın kokleasında bulunan Corti organı, spiral şeklinde düzenlenmiş ve ses algılama için tonotopik bir gradyana sahip mekanosensoriyel tüy hücreleri ve çevresindeki destekleyici hücreleri içerir. Fare kokleası yaklaşık 6 mm uzunluğundadır ve analiz için genellikle üç tura (tepe, orta ve taban) bölünür. Hücre kaybını, hücre bölünmesini veya mozaik gen ekspresyonunu araştırmak için, kokleanın tüm montajı veya yüzey hazırlığı yararlıdır. Bu diseksiyon yöntemi, z eksenindeki farklı düzlemlerdeki hücreleri görüntülemek için immünoboyama ve konfokal mikroskopi ile birleştirildiğinde Corti organı içindeki tüm hücrelerin görüntülenmesine izin verir. Bu z-yığını görüntülerinden çoklu optik kesitler de elde edilebilir. Ek olarak, farklı bir fiksasyon yöntemine ihtiyaç duyulmasına rağmen, elektron mikroskobunu taramak için tüm montaj diseksiyon yöntemi kullanılabilir. Burada, Corti organını üç sağlam koklear dönüş (apeks, orta ve taban) olarak izole etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bir haftalıktan yetişkinliğe kadar değişen fareler için kullanılabilir ve kokleanın kalsifikasyonunun eksik olduğu yenidoğan örnekleri için kullanılan teknikten farklıdır. Sıçan kokleasının diseksiyonu için biraz değiştirilmiş bir versiyon kullanılabilir. Ayrıca floresan etiketli antikorlarla immün boyama için bir prosedür gösteriyoruz.

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve tabanı) Şekil 1&#39;de sunulan anahtar diseksiyon adımlarla, kalsifiye olan koklear dokudan olarak Corti organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Gelişiminin ilk doğum sonrası haftasında, kalsifikasyon sırasında Fare koklea eksiktir ve daha basit bir diseksiyon yöntemi 13 kullanılabilir. Corti organı P7 gelen kokleadaki ve gözyaşları içinde eski fareler sonuçları ve parçalama ile neonatal tüm montaj diseksiyonu...

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası &#39;antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Bu bütün mount diseksiyon yönteminin genel amacı, kalsifiye yetişkin kokleanın duyusal bölgesini üç sağlam sarım şeklinde izole etmektir: apeks, orta ve taban. Bu diseksiyon yöntemi, Corti organının üç boyutlu yapısını korur ve Z eksenindeki farklı düzlemlerde görüntüleme yapmak için immünboyama ve konfokal mikroskopi ile birleştirildiğinde tüm hücrelerin görselleştirilmesine olanak tanır. Önceki diseksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, immünboyama sürecinde kaybolma veya hasar görme olasılığı daha düşük olan ve daha büyük üç koklear sarım oluşturan farklı bir strateji kullanıyoruz.Diseksiyonun öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Corti organı hassas olduğundan, spiral ligaman çıkarılırken hata payı oldukça düşüktür. Onaylanmış prosedürlere göre hayvan ötanize edilip beyin çıkarıldıktan sonra, fare kafatasının tabanındaki temporal kemikleri tanımlayarak başlayın.Ardından, standart patern pensler kullanarak kranial sinirleri kazıyın. Pensleri otik kapsülün ucuna yerleştirin ve enkapsüle kokleayı yerinden çıkarmak için karşı elinizin baş parmağıyla posterior semisirküler kanala bastırın. Temporal kemiğin alt yarısını ya baş parmak ve işa

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Genç erişkin ve yaşlı gerbil kokleae'lerin afferent sinaptik yapıların ve saç hücrelerinin immüno-etiketlenmesi, yaşlı dokudaki otofloresansın söndürülmesi, kokleae'nin uzunluğunun diseksiyonu ve tahmin edilmesi ve konfokal görüntüleme ile elde edilen görüntü yığınlarındaki sinapsların nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması

Burada, gürültüye bağlı işitme kaybının (NIHL) bir fare modeli için bir protokol sunuyoruz. NIHL'yi teşvik etmek için oluklu plastik, bir fare kapanı kafesi ve bir hoparlör kullanarak yeni ve basit bir cihaz geliştirdik. İşitme fonksiyonunu değerlendirmek için sırasıyla işitsel beyin sapı yanıtı ve immünofloresan görüntüleme ve dış tüylü hücre hasarı kullanıldı.

Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi

Tüm kokleayı görüntülemek ve dijitalleştirmek için bir ışık tabakası mikroskobu geliştirilmiştir.

Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Fare iç kulak dokusunun acemi kullanıcıları için tasarlanan bu protokol, kesit immün boyama için farklı gelişim aşamalarında fare iç kulaklarının işlenmesine yönelik adımları kapsamlı bir şekilde detaylandırır.

Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

Öğrenin, yetişkin fare korti organını üç tam dönüş olarak izole etmek için tam dağı diseksiyon ve immünofloresan yöntemini. Bu teknik, saç hücreleri ve destek hücrelerinin üç boyutlu yapısını korur ve konfokal mikroskopi ile görüntülemeyi sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Daha fazla video keşfet