Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm bu montaj diseksiyon yönteminin genel amacı, kalsifiye olmuş yetişkin kokleanın duyusal bölgesini üç sağlam dönüş olarak izole etmektir: apeks, orta ve taban. Bu diseksiyon yöntemi, Corti organının üç boyutlu yapısını korur ve Z ekseninde farklı düzlemlerde görüntü almak için immün boyama ve konfokal mikroskopi ile birleştirildiğinde tüm hücrelerin görüntülenmesine olanak tanır. Önceki diseksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, immün boyama sürecinde daha büyük ve kaybolma veya hasar görme olasılığı daha düşük olan üç koklear dönüş oluşturan farklı bir strateji kullanıyoruz.

Diseksiyonun öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Corti'nin organı kırılgan olduğundan, spiral ligament çıkarılırken küçük bir hata payı vardır. Hayvanı onaylanmış prosedürlere göre ötenazi yaptıktan ve beyni çıkardıktan sonra, fare kafatasının tabanındaki temporal kemikleri tanımlayarak başlayın.

Daha sonra standart desen forseps kullanarak kraniyal sinirleri kazıyın. Forsepsleri otik kapsülün ucuna yerleştirin ve kapsüllenmiş kokleayı çıkarmak için arka yarı dairesel kanala bastırmak için karşı elin başparmağını kullanın. Temporal kemiğin alt yarısını kafatasından manuel olarak veya başparmak ve işaret parmağıyla veya 10,5 santimetre ince makas kullanarak serbest bırakın ve sabitlemek için metanol serbest elektron mikroskobu derecesi% 4 paraformaldehit içine yerleştirin.

Fiksasyondan sonra, protokolün yazılı kısmındaki talimatlara göre temporal kemikleri kireçten arındırın. Numunenin yeterince kireçten arındırılıp arındırılmadığını belirlemek için, temporal kemikleri silikon-elastomer kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirin ve salyangoz şeklindeki koklea üzerine forsepsleri hafifçe bastırın. Doku süngerimsi ise, dekalsifikasyon tamamlanmıştır.

Diseksiyon kabına PBS ekleyin ve ardından stereo diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, temporal kemiği vestibüler bölgede tutmak için dört veya beş numaralı forseps ve yanlar boyunca ve apeksin üzerindeki fazla otik kapsül dokusunu kesmek için beş mililitre Vannas-Tübingen yaylı makas kullanın. 2,5 mililitre Vannas yaylı makas kullanarak, oval pencereye bir bıçak yerleştirin ve bazal dönüşün spiral bağı boyunca birkaç küçük kesim yapın. Şimdi, beş mililitrelik Vannas-Tübingen yaylı makasın bir bıçağını az önce kesilen bölgeye yerleştirin ve diğer bıçağı temporal kemiğin dışına, oval pencerenin medialine yerleştirin.

Bu kesim, bazal dönüşü orta ve apikal dönüşlerden ayırır. Daha sonra, bazal dönüşün diseksiyonunu tamamlamak için, bazal dönüşteki gerilimi serbest bırakmak için modiolusa bağlanan spiral ganglion sinir liflerini kesmek için 2,5 mililitrelik yaylı makası kullanın. Vestibüler organlardan ayırmak için bazal dönüşün altında kesin.

Dokuyu yönlendirmek ve spiral ganglion liflerini silikon-elastomer kaplı tabağa sabitlemek için forseps kullanın. Spiral ligamenti Corti organının hem üstünden hem de altından çıkarmak için bir dizi küçük kesi yapın. Spiral ganglion lifleri silikon-elastomer kaplı tabağa tutturulmuşken, Corti organından kalan Reissner zarını çıkarmak için forsepsleri kullanın.

Spiral ganglion aksonlarının kalınlığını azaltmak için birkaç kesim yapın. Daha sonra spiral ganglionun kalan aksonlarını forseps ile kavrayın ve diseke bazal dönüşü yaklaşık 500 mikrolitre PBS içeren 48 oyuklu bir plakaya aktarın. Şimdi, önce koklea apikal tarafının kalan üçte ikisini aşağı gelecek şekilde yerleştirerek orta ve apikal dönüşleri ayırın.

Daha sonra, 2,5 mililitrelik makasın bir bıçağını, orta dönüşün daha önce bazal dönüşe bağlı olduğu skala ortamına yerleştirin ve orta dönüşün spiral bağı boyunca birkaç kesim yapın. Beş mililitrelik makası kullanarak, orta dönüş bıçağın üzerine gelecek şekilde bir bıçağı kesim bölgesine sokun. Diğer bıçağı kemikli labirentin dışına, apikal uçtan 90 derecelik bir açıyla yerleştirin.

Bu kesim, orta dönüşü apikal dönüşten ayırır. Daha sonra, spiral ligamenti Corti organından çıkararak orta dönüşün diseksiyonunu tamamlayın. Disseke dönüşü daha önce olduğu gibi 48 oyuklu bir plakaya aktarın.

Şimdi, apikal dönüşü kaplayan kapağı açmak için 2,5 mililitre Vannas yaylı makas kullanın ve apikal dönüş spiral ligamentini Corti organından çıkarmak için prosedürü tekrarlayın. Disseke dönüşü daha önce olduğu gibi 48 oyuklu bir plakaya aktarın. İmmün boyama prosedürüne başlamak için, önce her bir oyuktan PBS'yi aspire edin, daha sonra 200 ila 300 mikrolitre bloke edici çözelti ile değiştirin ve bir 3D döndürücü üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

İnkübasyon süresi geçtikten sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve taşıyıcı çözelti içinde uygun şekilde seyreltilmiş 100 mikrolitre birincil antikor ile değiştirin. Bir 3D döndürücü üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve her bir kuyucuğu oda sıcaklığında her seferinde en az beş dakika boyunca 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Yıkamayı iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PBS'yi aspire edin ve pipet ucundaki disseke dönüşü emmemeye dikkat edin. Taşıyıcı çözelti içinde seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikorun kuyusu başına 100 mikrolitre ile değiştirin.

Işıktan korumak için 48 oyuklu plakayı kara bir kutuya yerleştirin ve oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe etmek için 3D döndürücüye yerleştirin. İnkübasyonun ardından, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve daha önce olduğu gibi PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, çekirdekleri etiketlemek için 100 mikrolitre Hoechst ekleyin.

Işıktan koruyun ve 3D döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Son olarak, Hoechst solüsyonunu çıkarın ve daha önce olduğu gibi PBS ile üç kez yıkayın. Her slaytı etiketledikten sonra, her slayta 50 mikrolitre montaj ortamı pipetleyin.

Daha sonra dört veya beş numaralı düz kuyumcu forsepslerini kullanarak, spiral ganglionun aksonlarını kavrayın ve 48 oyuklu plakadan bir koklear dönüşü yavaşça montaj ortamına aktarın. Kesilen dönüşün katlanmadığından veya bükülmediğinden emin olmak için mikroskobu kullanın. Kapak kaymasının bir ucunu bir sürgünün üzerine yerleştirin ve kapak kaymasının düşmesine izin vermek için yavaşça bırakın.

Koklear dönüşün bir hava kabarcığının yakınında olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Böyle bir durumda, koklear dönüşü yeniden konumlandırmak için kapak kızağını yavaşça ileri geri hareket ettirin. Diğer koklear dönüşler için işlemi tekrarlayın.

Görüntüleme işlemi sırasında ışığa maruz kalmayı ve foto ağartmayı önlemek için slayt başına bir koklear dönüş monte edin. Slaytları düz duracak şekilde bir slayt klasörüne yerleştirin. Işıktan koruyun ve montaj ortamının gece boyunca oda sıcaklığında kürlenmesine izin verin.

Ertesi gün, kapak fişlerini şeffaf oje ile kapatın ve görüntülenene kadar oda sıcaklığında veya 20 santigrat derecede saklayın. Bu konfokal kesit görüntüsü, bir p15 fareden izole edilen koklear orta dönüşü göstermektedir. Tüm orta dönüşü yeniden oluşturmak için 420X görüntüleri üst üste bindirildi.

Bir tavşan anti-miyozin VIIa birincil antikoru ve bir Alexa 647 konjuge ikincil antikoru ile işaretlenmiş saç hücreleri macenta görünür. Bir keçi anti-SOX2 birincil antikoru ve bir Alexa 568 konjuge ikincil antikoru ile etiketlenmiş destekleyici hücreler yeşil görünür. Hoechst boyası nedeniyle çekirdekler mavi görünür.

Ölçek çubuğu 100 mikronu temsil eder. Bu görüntü, X, Z düzleminde altı haftalık bir fareden izole edilen orta dönüşün optik bir kesitini göstermektedir. Yine saç hücreleri macenta bir florofor ile ve destekleyici hücreler yeşil görünen bir florofor ile etiketlenir.

Bu, artı işaretlerinin kaldırılmasıyla önceki görüntünün artırılmış bir büyütmesidir. Ölçek çubuğu 20 mikronu temsil eder. Aşağıdaki dört resim, tüm montaj diseksiyonu sırasında veya kızaklarda koklear dönüşleri monte ederken oluşabilecek bazı sorunları göstermektedir.

Burada, görüntünün sol tarafında, koklear doku, dış tüy hücrelerinin son sırasının yanında kesildi ve bu hücrelerin çoğunun çeşitli açılarda monte edilmesine neden oldu. Bu görüntüde Corti'nin sol tarafındaki organının bir bölümü kesilmiştir. Görüntünün ortasında dış kıl hücresi bölgesinde açılmış bir delik vardır.

Burada Corti'nin organı birkaç yerde katlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm montaj diseksiyon tekniği 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu işlemi yaparken forsepsleri Corti organına yerleştirmekten kaçınmak ve spiral ligamenti çekmekten veya kavramaktan kaçınmak önemlidir.

Bunun yerine, forsepsleri kapatın ve spiral ganglion liflerini silikon-elastomer kaplı tabağa sabitleyin. Bir ila üç haftalık farelerden alınan örnekler, diseksiyon yöntemini öğrenmek için daha bağışlayıcı ve faydalıdır. Ek olarak, saç hücresi hasarı olan numunelerin incelenmesi daha zordur, gürültüye maruz kalan doku özellikle zor ve kırılgandır.

Bu diseksiyon prosedürünü takiben, taramalı elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bununla birlikte, farklı bir fiksatife ihtiyaç vardır. Ek olarak, sıçan koklear dokusunun diseksiyonu için bu protokolde küçük değişiklikler yaptık ve gelecekte, chinchilla, gerbil ve guinea pig'den koklea diseksiyonu için daha fazla değişiklik yapmayı umuyoruz.