Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Bu protokolün genel amacı, farelerin kulaklarından ve kuyruklarından primer fibroblast kültürleri oluşturmaktır. Bu yöntem, sağlıklı hücreler ile kanser hücreleri arasındaki fark gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu çalışmanın temel avantajı, hücreleri izole etmeden önce oda sıcaklığında besi yerinde 10 güne kadar saklanmış kulaklardan fibroblast üretebilmemizdir.

Bu yöntem fare biyolojisine dair içgörü sağlayabilse de sıçanlar ve tavşanlar gibi diğer memeli hayvan organizmalara da uygulanabilir. Dokuları toplamadan önce, 10 santimetrelik kültür kaplarına 10 mililitre tam besiyeri doldurun. Ardından, fare ötanize edildikten sonra sterilize edilmiş aletler kullanarak doku örneklerini toplamaya geçin.

Yaklaşık bir santimetre yarıçapında kulak dokusu ve yaklaşık beş santimetre uzunluğunda kuyruk dokusu toplayın. Dokuları, 40 milliliters %70 etanol içeren konik bir tüpe aktarın. Dokuları beş dakika boyunca bekletin ve ardından bir kültür davlumbazı içinde, açık 10 centimeter kültür kabında beş dakika boyunca havada kurutun.

Dokular kuruduktan sonra, onları besiyeri yüklü plakaya aktarın. Şimdi, tüm dokulardaki kılları makasla kesin ve ardından dokuları üç milimetreden daha küçük parçalara bölün. Doğranmış dokuyu kriyotüp tüplere aktarın ve ardından tüpleri 1.8 mililitre çizgisine kadar kollajenaz D pronaz solüsyonu ile doldurun.

Şimdi dokuları 37 °C'de, 200 rpm hızında çalkalayarak 90 dakika boyunca inkübe edin. Çeker ocak altında, bir kaba 10 mL komple besiyeri doldurun. Kabın üzerine 70 µm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve inkübasyonun ardından doku sindirim karışımını süzgece aktarın.

Şimdi, dokuları bir piston kullanarak süzgeç içinde ezin. Bu işlemi en az beş dakika boyunca sürdürün. Ayrışmış hücreleri yıkamak için süzgeci ara ara ortamın içine doğru sallayın.

Yeterli sayıda hücre elde edebilmek için sindirilmiş kulak ve kuyruk dokularının iyice ezilmesi önemlidir. Ayrıca, dokuları ezdikten sonra hücre süzgecini salladığınızdan emin olun. Bu işlem, süzgeçten ek hücrelerin yıkanarak çıkmasını sağlayacaktır.

Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Daha sonra, süzgeci 10 mililitre besiyeri ile durulayın ve durulama çözeltisini toplanan örneğe ekleyin. Şimdi, hücreleri yıkayın.

İlk olarak, hücreleri soğutmalı bir santrifüjde çöktürün. İkinci olarak, süpernatanı uzaklaştırın. Üçüncü olarak, hücreleri 10 milliliters tam besiyerinde süspanse edin.

Yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın ve prosedürü, hücreleri kültüre hazır halde tam besiyerinde bırakarak tamamlayın. Hücreleri kültüre etmek için öncelikle hücre süspansiyonlarını 10 mililitrelik kültür kaplarına aktarın. Ardından, her bir kültüre 10 mikrolitre amphotericin B çözeltisi ekleyin.

Şimdi, hücreleri üç gün boyunca inkübe edin. Üçüncü günde, besiyerini amphrotericin B içeren taze komple besiyeri ile değiştirin. Kısa süre sonra kültürler %70 konfluense ulaşacaktır. Bu noktada, besiyerini uzaklaştırın ve kültürü beş mililitre 1X PBS ile durulayın.

Ardından, PBS'yi iki mililitre 1X tripsin EDTA çözeltisi ile değiştirin ve hücreleri beş dakika boyunca inkübe edin. Kısa süreli inkübasyonun ardından, kaplara hafifçe vurun ve her bir kaba altı mililitre taze komple besiyeri ekleyin. Şimdi, kaptan salınan hücreleri pipetle iki adet 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Ardından, tüpleri soğutmalı bir santrifüjde 450 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peletleri beş mililitre tam besiyerinde yeniden süspande edin ve süspansiyonların hücre yoğunluğunu ölçün. Şimdi, hücreleri 10 santimetrelik kaplara kap başına 200.000 adet olacak şekilde ekleyin.

Bu hücreleri %70 konfluens düzeyine ulaşana kadar üç ila dört gün inkübe edin ve ardından hücreleri toplama ve belirli bir yoğunlukta yeniden ekme işlemini tekrarlayın. Bu şekilde 25 güne kadar büyütülebilirler. Hücre ekstraksiyonundan üç gün sonra, besiyeri değişiminden önce kültürde önemli miktarda debris gözlemlenmiştir.

Hücre kalıntıları beyaz oklarla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 100 mikronu temsil etmektedir. Yeni besiyeri, hücre kalıntılarını önemli ölçüde azaltmıştır.

Oda sıcaklığında 10 gün boyunca saklanmış dokulardan elde edilen üç günlük kültürler, fibroblastların oldukça dayanıklı olduğunu göstermiştir. Bu dokulardan, beş ila altı gün sonra %70 ila %80 fibroblast konfluensine ulaşılmıştır. Hücreler, kırmızı renkte görülen bir fibroblast belirteci olan vimentin ile işaretlenmiştir.

Çekirdekleri etiketlemek için DAPI kullanılmıştır ve bunlar mavi renkte görülmektedir. Ölçek çubuğu 10 microns'dır. Homojen boyama, fibroblast kültürünün saf olduğunu göstermektedir.

Tanımlanan protokol rutin olarak bu sonucu vermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, primer fibroblast kültürlerinin nasıl hızlı ve güvenilir bir şekilde kurulacağına dair bu sonuca ulaşmış olmalısınız. Bu prosedür uygulanırken, dokulardan fibroblastların çıkarılması sırasında ekstra dikkat gösterilmelidir; çünkü dokunun yetersiz ezilmesi, daha düşük hücre sayılarıyla sonuçlanacaktır.