Slp1 Polimerler ve Monolayer Au-etkileşimden Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, biyomoleküler metal Çalışmaları Araçlar olarak ICP-MS ve AFM

Bu deneyin genel amacı, sunulan bakteri suşunun S-tabakası proteinleri tarafından altın emilim davranışını ekolojik ve teknolojik bir bakış açısıyla araştırmaktır. Bu yöntemler, sorpsiyon işlemleri ve metallerin uzaklaştırılması ve geri kazanılması gibi çevre ile ilgili bilimdeki kilit sorulara cevap verebilir. Bu tekniklerin ana avantajı, metal sorpsiyonunu ve nanopartikül adsorpsiyonunu başka bir ölçek aralığında tespit edebilmenizdir.

QCM-D kullanarak bunu gerçek zamanlı bir ölçümde tespit etmek mümkündür. Bu prosedüre başlamak için, sıvı hücrelerini sensör mankenleri ile donatın. QCM-D ve tüp sistemi aracılığıyla ultra saf suda %20 alkali sıvı temizleme maddesinin modülü başına en az 2 mililitre pompalayın.

Bunu takiben, üreticinin protokolüne göre dakikada 300 mikrolitreye kadar bir akış hızıyla sistemden ultra saf su modülü başına beş kat hacim pompalayın. Akış modüllerinin dışındaki silikon dioksit sensörlerini %2 sodyum dodesil sülfat çözeltisinde en az 20 dakika inkübe ederek temizleyin. Ardından, sensörleri birkaç kez ultra saf suyla durulayın.

Kristalleri filtrelenmiş basınçlı hava ile kuruttuktan sonra, 20 dakika boyunca bir ozon temizleme odasına koyun. Bunu takiben, tüm organik içerikleri çıkarmak için temizleme prosedürünü iki kez tekrarlayın. Bağlı metalleri sensör yüzeyinden çıkarmak için sensörleri bir molar nitrik asitle durulayın.

Ardından sensörleri birkaç kez ultra saf suyla durulayın. Daha sonra, sensörleri, katman katman veya LBL tekniğini kullanarak daldırma kaplama yoluyla litre başına üç gram alternatif polietilenimin ve polistiren sülfonat katmanları ile değiştirin. Sensörleri derin kuyulu plakalardaki uygun polielektrolit çözeltisinin içine yerleştirin ve bunları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Ardından, sensörleri polielektrolit solüsyonundan çıkarın ve her daldırma kaplama adımı arasında ultra saf su ile yoğun bir şekilde durulayın. Harici değişiklik tamamlandıktan sonra, sensörleri akış modülünün içine yerleştirin. Deneylere başlamadan önce sensörleri ultra saf suyla durulayarak dengeleyin.

Bu noktada, polimerleri monomerlere dönüştürmek için önceden izole edilmiş ve saflaştırılmış Slp1'i formül üre içinde çözün. Daha büyük protein topaklarını çıkarmak için monomerize proteinleri bir saat boyunca 15.000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Çözündürülmüş ve santrifüjlenmiş Slp1 süpernatanı yeniden kristalleştirme tamponu ile litre başına 0.2 gramlık bir nihai protein konsantrasyonuna karıştırın.

Akış modülleri içindeki polielektrolit modifiye sensörlerin üzerinde başarılı bir protein yeniden kristalizasyonundan sonra, kaplanmış sensörleri yeniden kristalleştirme tamponu ile dakikada 125 mikrolitrelik bir akış hızıyla kararlı frekans ve dağılım kaymaları değerleri tespit edilene kadar yoğun bir şekilde durulayın. Akış modüllerinde başarılı bir Slp1 kaplamasından sonra, elde edilen Slp1 katmanını, kararlı frekans ve dağılım kaymaları değerleri tespit edilene kadar 1.6 milimolar sitrat tamponu pH 5.0 ile yoğun bir şekilde durulayın. Daha sonra, önceden hazırlanmış bir milimolar nanopartikül çözeltisini dakikada 125 mikrolitre akış hızına sahip akış modüllerine pompalayın.

Ardından, Slp1 katmanına kütle adsorpsiyonunu izleyin. Metal nanopartikül etkileşimini tamamladıktan sonra, zayıf bağlı metalleri veya nanopartikülleri çıkarmak için tabakayı nanopartikül içermeyen tamponla durulayın. Bir atomik kuvvet mikroskobu veya ters çevrilmiş optik mikroskoplu AFM kullanarak, görüntüleri doğrudan kaplanmış QCM-D sensörlerine ultra saf su kullanarak sıvı içinde kaydedin.

QCM-D deneylerinden sonra sensörleri ultra saf suyla durulayın ve AFM sıvı hücresinin içine yerleştirin. Suda rezonans frekansı yaklaşık 25 kilohertz ve sertliği metre başına 0,1 newton'dan az olan bir konsol kullanın. Tarama hızını saniyede 2,5 ila 10 mikrometre arasında ayarlayın.

Konsol, rezonans frekansında bir Piezo tarafından uyarılırken dinamik temas modunda görüntü çekin. Son olarak, salınım sönümlemesi ile konsolun yüzeye olan mesafesini belirleyin. Süspanse edilmiş Slp1 ile altın üçünün maksimum metal bağlama kapasiteleri, araştırılan pH aralığında 24 saatlik inkübasyon sırasında stabil bir şekilde bağlandığını göstermektedir.

Frekanstaki ani azalma, hızlı bir adsorpsiyonu ve proteinlerin polielektrolit modifiye edilmiş yüzeye yüksek bir afinitesini gösterir. Dağılma da hemen artar, bu da hızlı sönümleme nedeniyle viskoelastik moleküllerin yüzeye adsorpsiyonunu gösterir ve bu da dağılma değerlerinin artmasına neden olur. Önceden sentezlenmiş altın sıfır nanopartikülleri Slp1 ile inkübe edildi ve nanopartiküllerin Slp1 yapısını bozmadığını gösteren QCM-D verilerini doğrulayan SDS-PAGE ile analiz edildi.

Önceden sentezlenmiş metalik altın sıfır nanopartiküllerin adsorpsiyonu, delta F-delta D grafiklerinde QCM-D deneyleri için ve kalınlık ve kütle profilleri olarak gösterilmiştir. Polielektrolit modifiye sensörler üzerinde yeniden kristalize edilen Slp1'in protein kafesi burada gösterilmektedir. Kafes sabiti 13 ila 14 nanometre olarak belirlendi ve katman kalınlığı 10 artı veya eksi iki nanometre olarak bulundu.

AFM çalışmaları, altın üç etkileşiminden sonra Slp1 kafesinin tamamen sağlam kaldığını doğruladı ve bu da kaplamanın stabilitesini öngören QCM-D sonuçlarını doğruladı. AFM, Slp1 kafesi üzerindeki altın sıfır nanopartiküllerin adsorpsiyonunu doğrular, ancak partikül boyutu nedeniyle, Slp1'in p4 simetrisini takip etmezler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir iş günü içinde yapılabilir.

Bu yöntemleri takiben, kızılötesi spektroskopi veya helyum iyon mikroskobu gibi diğer teknikler, belirli bağlanma manzaraları veya altın veya altın nanopartikülleri ile etkileşim gibi daha ileri soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Sunulan teknik, uzrachem'in biyomoleküllerin metallerle etkileşimlerini ve örneğin farklı türdeki yüzeylerde adsorpsiyon ve disorpsiyon davranışını incelemesinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, metallerin biyolojik çözücülerle etkileşimlerini nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız ve lütfen bu yöntemi kullanırken gözlük, laboratuvar önlüğü ve tabii ki eldiven kullanmayı unutmayın.