Name: Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin izoelektrik beyin durumunda tek nöronların özelliklerini in vivo olarak nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem, sinaptik girdiler olmadan nöron hesaplamalarını ve ağ etkisini değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Fondation de France, Institut National de la Sante Et de la Recherche MEDICALE, Pierre &amp; Marie Curie Üniversitesi ve programın &#39;Investissements d&#39;avenir&#39; ANR-10-IAIHU-06 hibe ile desteklenmiştir.

Tüm işlemler Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak yapılmıştır (direktif 2010/63 / AB) ve Hayvan Deneyleri Charles Darwin Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ancak çoğu adımlar herkesin özel ihtiyaçlarına uygun şekilde adapte edilebilir, burada rutin laboratuvarda kullanmak prosedürü açıklar. 1. Cerrahi Hazırlık Not: Tüm kesi ve basınç noktaları tekrar tekrar lokal anestezi (lidokain veya bupivakain) ile infiltre edilmelidir. aseptik hazırlanışı çeşitli modifikasyonlar uygulanmalıdır gerekli ise, bu işlem, bir terminaldir. <ol><li> İki yerel olarak ayrılmış intraperitonal (IP) enjeksiyon sodyum pentobarbital (40 mg / kg) ve ketamin (50 mg / kg) ile, bir sıçan anestezisi. </li><li> Hayvan genel anestezi altında gitmek ve tekrar tekrar anestezi cerrahi düzlem (kısma ayak hiçbir tepki) elde doğrulamak edelim. Bir fe sıçan yerleştirinedback ısıtma battaniye ve 37 ° C civarında çekirdek sıcaklığını korumak için bir rektal prob takın. </li><li> Anestezik ajanların sonraki enjeksiyon kolaylaştırmak ve tekrarlanan iğne delikleri 30 ile organları perforan önlemek için periton boşluğuna bir kateter yerleştirin. <ol><li> Midenin alt sağ veya sol kadran içinde yer alan bir bölgede üzerindeki alana - küçük (3 mm ~ 2) üzerinden saç klibi. Not: Depilasyon krem ​​de kullanılabilir. </li><li> keskin bir makas veya neşter ile cilt üzerinde 3 mm kesi - 2 yapın. periton boşluğu görülmektedir kadar künt diseksiyon kullanarak, yağ ve kas tabakaları kaldırmak. </li><li> boşluğunda küçük bir kateter 2 cm ve cerrahi yapıştırıcı ile yarayı kapatmak - yaklaşık 1 yerleştirin. (. Örneğin, 2 Fransızca - iç çapı 0.043 mm karşılık gelen) Not: çap ve kateter toplam uzunluğu en az olmalıdır ölü hacimleri azaltmak için. Poliüretan tüpler en uygundur. </li><li> bir döngü ve dikiş t yapmako yere sabitlemek için cilde kateter. </li></ol></li><li> Suni solunum sırasında havalandırma kontrol etmek için bir trakeal tüp takın. <ol><li> Bir önceki adımda olduğu gibi, ilgi alanı hazırlamak (1 - sağ manubrium yukarıdaki trakea üzerinde 2 cm), saç kaldırmak ve cildi insizyon. </li><li> yağ ve kasların ilk katmanları incelemek künt, sonra bir kenara tükürük bezi taşımak ve yavaşça kasların son katmanını diseksiyon ile trakea maruz kalmaktadır. </li><li> Dikkatle trakea üzerinde dokuları kaldırmak ve küçük forseps kullanarak altında bir iplik kaydırın. iplik ile bir cerrahın düğümü yapmak ancak henüz sıkı değil. </li><li> İki kıkırdak halkaları arasındaki trakea enine doğru İnsizyon. trakea varsa içinde Swab kan. </li><li> Uygun çaplı bir trakeal tüp takın ve istikrarlı tüp güvenli parçacığının düğüm sıkın. Ek stabilite için iplik daha trakea borusunun daha yüksek bir noktasında eklenebilir. </li><li> sütüre yara yakın veya cerrahi zımba kullanın. Trakeal tüp yeniden amaçlanmıştır burada cerrahi yapıştırıcı kaçının. </li></ol></li><li> Stereotaksik çerçeve içinde hayvan takın ve dikkatlice aşağıdaki fizyolojik değişkenleri izlemek: EcoG, SpO 2, EtCO 2, ve iç sıcaklık (elektrokardiyogram, EKG aracılığıyla) kalp hızı. Monitör ve anestezi ve fizyolojik durumu uygun bir derinlik tutmak için bu değişkenleri ayarlayın. Özellikle, sodyum pentobarbital küçük bir doz (10 mg / kg), gerekirse anestezi tamamlar. </li><li> kuruma önlemek için her iki göze göz merhemi sürün. uzunlamasına bir kesi (~ 2 cm) yapmak, kafa derisi üzerinde saç klibi ve bir neşter veya küret kullanılarak kafatası örten bağ dokuları rezeksiyonu. </li><li> Bir diş matkap ile ilgi bölge üzerinde küçük bir (~ 1.5 mm çap) kraniotomiye olun. Not: Burada, birincil somatosensoriyel korteks varil alanı hedeflenmektedir (7-8 mm anterior interaural hattına, 4.5- 5,5 mm) orta hat 31 lateral. ısıyı dağıtmak için art arda durulayın. </li><li> yavaşça dura küçük bir delik yapmak için ekstra ince forseps kullanın. EcoG elektrot yerleştirmek için kranial trepanasyon içinde ~ 0,5 mm bölgesini ayırmak (sonraki adıma bakın). Kalıcı% 0.9 NaCl çözeltisi (ya da yapay beyin omurilik sıvısı) ile nemli korteks tutmak. </li><li> değil menenjlerin kapsadığı kortikal bölgeyi kaçınarak, dura üzerinde düşük empedans (~ 60 kÊ) gümüş elektrot (EcoG elektrot) yerleştirin ve başın diğer tarafında bir kafa derisi kas üzerindeki referans elektrot yerleştirin. </li><li> Bu aşamada (son sodyum pentobarbital enjeksiyondan sonra 30 dakika), bir IP kateter vasıtasıyla sodyum pentobarbital (10-15 mg / kg / saat) veya fentanil (3-6 ug / kg / sa) tekrarlanan enjeksiyonu ile anestezi bakımı. ikincisi desynchronized, uyanma gibi, kortikal profiline neden olur, oysa önceki yavaş salınım, uyku-benzeri, ECoG model ile sonuçlanır. </li><li> yapay v ayarlayınsolunum frekansı ve hacim sıçan spontan solunum (- 115 nefes / dk 32 normal aralık 70) benzemektedir böylece entilation sistemi. Ardından, trakeal tüp mekanik ventilasyon bağlamak ve (her iki tarafta) uygun göğüs kafesi enflasyonu kontrol edin. Eğer değilse, nefes borusu ekseni havalandırma boru konumunu ayarlamak. Gerekirse, bir şırınga ya da bir vakum pompasına bağlı bir kateter ile trakea mevcut salgılanmasını emmek. </li><li> 29,36 desen anestezi istikrarlı bir cerrahi uçağı yansıtan 32-35 ve EcoG tüm fizyolojik değişkenler, sıçan, 40 mg felç için her bacaktaki gallamine trietiodidi bir kas içi enjeksiyon yaparsanız / ilk enjeksiyon için kg ve daha sonra 20 mg / kg her 2 saatte 19,29,36,50. </li></ol> 2. Hücre içi Kayıtlar <ol><li> Bir ~ 0.2 mikron ucu ile bir cam mikropipet (keskin mikroelektrot) çekin gibi direnci betwee aralıkların, 50 ile 80 M? kez 2 M potasyum asetat (KAC) ile doldurulur. </li><li> (Bir kafa aşamasında aracılığıyla) bir hücre içi amplifikatöre pipet çözüm bağlamak için gümüş / gümüş-klorür (Ag / AgCl) tel ile belirli bir tutucu pipet yerleştirin. sahibinin bir micromanipulator eklenmelidir. Sıçan boyun kasları üzerinde bir Ag / AgCl referans elektrodu yerleştirin. </li><li> Yavaş yavaş ilgi bölgeye aşağı beyinde pipet eklemek ve mevcut adımlarla cevaben düşer gerilim izleyerek direncini doğrulayın. Gerekirse pipet temizlemek için amplifikatörün düğmesini vızıltı kullanın (ya da zap). </li><li> kraniotomiye beyin hareketlerini azaltmak için silikon elastomer ya da% 4 agaroz ile kaplayıp önce (ECoG ya da hücre içi elektrotlar dokunmamaya dikkat edin) kuru pamuklu çubuklarla veya sentetik emilim üçgenleri kullanın. </li><li> Bir hücre yaklaşırken direnci artar kadar 2 mikron adımda - 1 pipet indirin. Sonra PENETRA için amplifikatörün vızıltı işlevini kullanınnöron içine te. </li></ol> 3. Isoelectric State øndükle <ol><li> Aynı anda nöronun membran potansiyelini, ECoG ve fizyolojik değişkenleri izlerken bu aşamada uygun deneysel protokol (örneğin, yanıtları ateş hücre enjekte akımlar, akım-gerilim ilişkileri, duyusal uyaranlar yanıtları) gerçekleştirin. </li><li> Hücre içi elektrot kayıt oturum boyunca membran potansiyeli ve aksiyon potansiyel tıbbi özellikleri metanet analizi ile hücre içinde stabil olduğundan emin olun. Değilse, sonraki adıma geçin ve kayıt stabil hale gelene kadar tekrar beklemek veya başka bir nöron için aramazlar. </li><li> sodyum pentobarbital yüksek, ancak alt-ölümcül doz enjekte IP hattı ile (~ / kg 90 mg, pentobarbital, ilk durumda 35 mg / kg fentanil ilk durumuna gelen 155 mg / kg &#39;a kadar düşük olabilir). Not: 15 içinde - 20 dakika hücre içi ve EcoG waveforms geçici giderek tam bir izoelektrik duruma çöker, hangi 37,38 profil sözde &quot;patlama-bastırma&quot; ulaşmak için aralıklı elektrik sessizlikler ile yavaşlatmak gerekir. Kalp hızı belirgin olarak (~ 10 tarafından -% 20) yavaşlatır beklenmektedir ancak SpO2 ve EtCO 2 nispeten sabit kalmalıdır. </li><li> izoelektrik devlet ulaşılamaması halinde, sodyum pentobarbital küçük bir miktar enjekte (~ adım 3.1 dozun% 10). izoelektrik devlet hala elde değilse daha fazla anestezik eklemeden önce 15 dakika bekleyin. </li><li> Kaydedilen nöronun bütünleştirici özellikleri üzerine ağ dinamiklerinin etkisini karşılaştırmak için deneysel protokol tekrarlayın. Not: anestezik enjeksiyon kesilmesinden sonra, elektriksel beyin aktivitesi tamamen 3 ila 4 saat içinde kurtarmak gerekir. </li><li> Deneyin sonunda, sodyum pentobarbitalin letal doz enjekte (200 mg / kg, ip) sıçan euthanize. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz burada ağ ve hücresel düzeydeki in vivo spontan serebral elektriksel aktivitenin içinde bastırmak için yeni bir yöntem tarif. Bu prosedür, izoelektrik koma 41 olarak bilinen bir aşırı beyin durumuna yol açar. görünümünde bir klinik açıdan bakıldığında, böyle bir elektroserebral hareketsizlik EEG görülebilir en ağır anormallik olduğunu. Çoğunlukla ya ölüyor ya da kalıcı bitkisel 42 devam tüm hastalarla, geri dönüşü olmayan bir koma ile ilişkili, ancak (örneğin tiyopental gibi) ...

herhangi bir çevresel uyaranlara veya davranışsal görevlerin yokluğunda, &quot;dinlenme&quot; beyin elektroensefalografi (EEG) dalgalar olarak kafa derisi kaydedilebilir elektriksel aktivitenin sürekli bir akış oluşturur. Bu endojen serebral aktivitenin hücre içi korelasyon afferent ağlar 1,2 sürekli aktiviteyi yansıtan eksitatör ve inhibitör sinaptik potansiyellerin bir arada oluşur (aynı zamanda &quot;sinaptik gürültü&quot; olarak da bilinir) arka plan membran voltaj dalgalanmaları ile karakterizedir. Bu spontan aktivite teyakkuz farklı devletleri ile frekans ve genlik değişir. Tek nöronların eksitabilite ve cevaplılığı üzerine ağ etkinliğinin etkisini aydınlatılması sinirbilimlerden 3,4 büyük zorluklardan biridir. Birçok deneysel ve hesaplamalı çalışmalar bütünleştirici propertie devam eden sinaptik aktivitenin fonksiyonel etkilerini araştırdınöronların s. Ancak, arka plan sinaptik gürültü etkilenen farklı nöronal parametrelerin rolü belirsiz kalır. Örneğin, membran depolarizasyon ortalama seviyesi pozitif 5,6 veya negatif 7-9 aksiyon potansiyelleri tetiklemek için algılama verilerinin yeteneği ile ilişkili bulunmuştur. Bazı araştırmalar afferent sinaptik girdi sürekli değişen akışından kaynaklanan zar potansiyeli dalgalanmalar, güçlü bir şekilde giriş-çıkış ilişkisi 3,10-13 kazancını düzenlenmesiyle tek nöronların yanıt etkilediğini düşündürmektedir oysa Ayrıca, diğerleri göstermektedir inhibisyonu şant aracılık ettiği zar girişi iletkenlikteki değişimler ne olursa olsun, membran dalgalanmalar 14,15 büyüklük nöronal kazanç modüle edilmesi için yeterli olmaktadır. Son olarak, uyanık hayvanlar üzerinde yapılan son çalışmalar, tek bir nöron duyusal bilginin işleme eleştirel uyanıklık a durumuna bağlıdır nasıl vurguladınd mevcut davranışsal talep 16,17. son derece enterkonnekte sistemin belirli bir sürecin işlevsel rolünü aydınlatmak için bir basit strateji yokluğu özellikle sistemin işleyişini nasıl değiştirdiğini tespit etmektir. Bu yöntem geniş bir deney lezyonlar ya da farklı beyin bölgeleri 18-21 inaktivasyonunu veya spesifik iyon kanalları 22,23 farmakolojik blokajı kullanılarak, örneğin, nörolojik araştırmalarında kullanılmıştır. Özellikle, fonksiyonel bağlantı ve ağ dinamikleri tek hücre hesaplama 24-27 nasıl etkilediğini açıklayacak in vivo olarak tatbik edilmiştir. Bununla birlikte, bugüne kadar yerel manipülasyonlar nöronların ateş engellemek ve / veya kısmen etkili olabilir temel biyofiziksel özellikleri karıştırmayı amaçlanmıştır ve nispeten küçük beyin hacmi 28 ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları aşmak için, in vivo deneysel bir yaklaşımla yeni bir geliştirilmişSıçan tüm beyin sinaptik etkinlik 29 tamamen bastırılmasıyla sonra elde edilen belirli bir ağ, dinamik gömülü belirli bir beyin durumda kaydedilen tek nöronların, yani, elektrofizyolojik özellikleri karşılaştırma. Kontrol koşulları olarak, iki farklı kortikal dinamikleri oluşturulabilir. Uyku benzeri elektrokortikografik (ECOG) desenleri, sodyum pentobarbital orta doz enjeksiyonu ile indüklenmiştir. Seçenek olarak ise, uyanıkken (uyanık benzeri örneği) temel kortikal aktivite ile karşılaştırılabilir küçük genlikli hızlı ECoG dalgaları fentanil enjeksiyonla üretilebilir. Aynı ECoG ve hücre içi kayıt korurken Daha sonra, endojen beyin elektriksel aktivitesi tam bir susturma izoelektrik ECOG ve hücre içi faaliyetleri, özelliği, sodyum pentobarbital yüksek doz, sistemik enjeksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Böyle bir aşırı koma indüksiyon potansiyel olarak ölümcül Ardışık olabilir çünkübiyolojik fonksiyonları ces, fizyolojik değişkenlerin dikkatli ve sürekli izleme gerekliydi. Bu nedenle, biz titizlikle deneyler boyunca kalp atım frekansını, end-tidal CO 2 konsantrasyonu (EtCO 2), O 2 doygunluğu (SpO2) ve sıçan çekirdek sıcaklığını izledi. Biz, in vivo uzun ve istikrarlı bir kayıtlar için uygundur keskin Mikroelektronlar kullanarak bu farklı durumlarında tek nöronlar özelliklerini değerlendirir. Burada tarif edilen prosedür, diğer elektrofizyolojik ve görüntüleme yaklaşımları ile kombine edilebilir ve diğer hayvan modelleri genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>Sodyum Pentobarbital</td><td>Centravet,</td><td>Pentobarbital</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 500</td><td>Merial</td><td>Imalg & egrave; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>Fentanil&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanil</td><td></td></tr><tr><td>Ksilokain</td><td>Santrifüjü</td><td>Ksilometre</td><td></td></tr><tr><td>Gallamin trietiyodür</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>ECoG amplifikatör</td><td>A-M Sistemleri</td><td>AC amplifikatör, Model 1700</td><td></td></tr><tr><td>Hücre içi amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama arayüzü</td><td>Cambridge Elektronik Tasarım</td><td>CED gücü 1401-3 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Veri analiz yazılımı</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 sürüm 7</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatör</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Çektirme</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş tel 0.125 mm (hücre içi kayıt)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Ag-AgCl referansı</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş tel 0,25 mm (ECoG kayıt)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>Suni solunum sistemi</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>Fizyolojik parametrelerin izlenmesi</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Battaniyesi</td><td>Harvard Aparatı</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Forseps Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Forseps Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP Poliüretan kateter - 0.43x0.69 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>Silikon elastomer</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Diş matkabı</td><td>NSK</td><td>Y1001151 ve P496</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi yapıştırıcı</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

bir izoelektrik beyin devlet indüksiyon nöronal eksitabilite üzerinde endojen sinaptik faaliyet etkisini araştırmak için<em&gt; İn vivo</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

yolu nöronlar işlem bilgileri kendi içsel membran özelliklerine ve afferent sinaptik ağının dinamikleri hem de bağlıdır. kuvvetle uyanıklık durumunun bir fonksiyonu olarak değişmektedir özellikle endojen üretilen ağ aktivitesi, olarak, önemli ölçüde nöronal hesaplama modüle eder. Spontan serebral dinamikleri tek nöronların bütünleştirici özelliklerini nasıl etkilediğini farklı araştırmak için, sodyum pentobarbital yüksek dozda sistemik enjeksiyonu yoluyla in vivo olarak serebral aktivitesi bastırmada oluşan sıçan yeni bir deneysel strateji geliştirmiştir. Sürekli kombine elektrokortikogram (EcoG) ve hücre içi kayıtları tarafından izlenen kortikal faaliyetleri, giderek istikrarlı bir izoelektrik profiline lider, yavaşlar. derin bir koma halinde sıçan koyarak bu aşırı beyin devleti, dikkatle deneyler boyunca hayvanın fizyolojik sabitleri ölçülerek izlendi. Hücre içi recordings bize karakterize ve uyku-uyanıklık döngüsü karşılaşıldığı gibi fizyolojik ilgili kortikal dinamikleri, içine gömülü aynı nöronun bütünleştirici özelliklerini karşılaştırmak için izin ve beyin tamamen sessiz olduğu zaman.

Uyaran ve bir izoelektrik beyin durumunu korumak in vivo deneysel prosedürde bir hassastır. Doğrudan sinirsel uyarıların ve transfer fonksiyonunun 29 kortikal ağ etkinliğinin etkisini incelemek için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Şekil 1 (Şekil 1A önce hayvanın fizyolojik durumunun ECOG ve hayati sabitleri de dahil olmak üzere çok parametreli izleme, gösterir izoelektrik devletin) ve sonra (Şekil 1B) i...

Bu prosedür bir izoelektrik beyin devlet sonuçlanan fizyolojik ilgili beyin durumlarında ve devam eden elektrik faaliyetlerinin tam kaldırılmasından sonra tek nöronların uzun ömürlü in vivo hücre içi kayıtları gerçekleştirir. hayvanın fizyolojik sabitleri dikkatle yapay komada durumuna geçiş sırasında izlenir.

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için<em&gt; İn Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Bu protokolün genel amacı, sinaptik girdilerin yokluğunda tekil nöronların entegre özelliklerini incelemek için in vivo ortamda genel bir serebral inaktivite durumu oluşturmaktır. Burada sunduğumuz yöntem, ağ aktivitesinin tekil hücre hesaplamaları üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi veya komatöz durumdaki nöronların tepkiselliğinin incelenmesi gibi nörofizyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nöronal özelliklerin, bozulmamış bir in vivo preparasyonda ağdan izole bir şekilde incelenebilmesidir.Bu prosedüre başlamak için, tamamen anestezi uygulanmış bir sıçanı ısıtma battaniyesine yerleştirin. Vücut çekirdek sıcaklığını yaklaşık 37 °C civarında tutmak için hayvanın rektumuna bir prob yerleştirin. Anestezik ajanların sonraki enjeksiyonlarını kolaylaştırmak amacıyla periton boşluğuna bir kateter yerleştirmek için, önce epilasyon kremi kullanarak karnın sağ veya sol alt kadranındaki küçük bir alandaki tüyleri temizleyin.Lokal anestezik enjekte edildikten sonra cerrahi alanı sterilize edin ve keskin makasla cilt üzerinde iki ila üç milimetrelik bir insizyon yapın. Künt uçlu makas kullanarak, periton boşluğu görünene kadar yağ ve kas katmanlarını uzaklaştırın. Ardından, boşluğa yaklaşık bir ila iki santimetrelik küçük bir kateter yerleştirin ve yarayı cerrahi yapıştırıcı ile kapatın.Kateteri yerine sabitlemek için bir loop yapın ve cilde sütüre edin. Yapay solunum sırasında ventilasyonu kontrol etmek amacıyla bir trakeal tüp yerleştirmek için, tüyleri temizleyin, bölgeyi sterilize edin ve manubriumun hemen üzerindeki trakea üzerindeki cildi insize edin. İlk yağ ve kas tabakasını künt diseksiyonla ayırın.Tükürük bezini kenara çekin ve kasların son tabakasını nazikçe disseke ederek trakeayı açığa çıkarın. Trakeayı dikkatlice izole edin ve küçük bir pens yardımıyla altına bir ip kaydırın. Ardından ip ile gevşek bir cerrah düğümü atın.Trakeayı iki kıkırdak halka arasından transvers olarak kesin. Ardından, uygun çapta bir trakeal tüp yerleştirin ve tüpü sabitlemek için ipliğin düğümünü sıkın. Ek stabilite için ip, trakeal tüpün daha üst bir noktasına da bağlanabilir.Yarayı kapatmak için dikiş atın veya cerrahi zımba kullanın. Ardından, hayvanı stereotaksik bir çerçeveye transfer edin ve kurumayı önlemek için göz pomadı uygulayın. Daha sonra, elektrokardiyogram, kan oksijen satürasyonu ve son ekspiryum karbondioksit basıncı gibi fizyolojik değişkenlerini izlemek için uygun probları yerleştirin.Ardından, saç derisindeki tüyleri temizleyin ve cerrahi alanı sterilize edin. Bir skalpel kullanarak iki santimetrelik boylamasına bir insizyon yapın ve kafatasının üzerindeki bağ dokularını rezeke edin. Daha sonra, preparasyonu stabilize etmek için kafatasına ve dokulara cerrahi yapıştırıcı uygulayın.Ardından, bir dental frez ile ilgi bölgesinin üzerinde 1.5 millimeter çapında küçük bir kraniyotomi yapın. Sonrasında, dura üzerinde nazikçe küçük bir delik açmak için ekstra ince bir pens ve vena makası kullanın. Elektrokortikografik elektrodu yerleştirmek için kranyal trepanasyon içerisinde 0.5 millimeter'lik bir bölgeyi ayırın.Korteksin %0,9 sodyum klorür solüsyonu veya aCSF ile nemli tutulduğundan emin olun. Ardından, karşıt taraf kafa derisi kasına bir referans elektrot ve dura üzerine düşük empedanslı bir elektrokortikografik elektrot yerleştirin. Yapay ventilasyon sistemini, solunum frekansı ve hacmi sıçanın spontan solunumuyla benzer olacak şekilde ayarlayın.Tüm fizyolojik değişkenler ve elektrokortikografik paternler normal değerler içerisindeyse, hayvanı felç etmek için her iki bacağa gallamine triethiodide enjekte edin. Ardından, trakeal tüpe mekanik ventilasyonu bağlayın ve göğüs kafesinin her iki tarafta da düzgün şekilde şiştiğini doğrulayın. Bu adımda, 0,2 mikrometre uçlu bir cam mikropipet çekin ve içini iki molar potasyum asetat çözeltisi ile doldurun.Pipeti, pipet solüsyonunu bir hücre içi amplifikatöre bağlamak için gümüş/gümüş klorür telli özel bir tutucuya yerleştirin. Ardından, sıçanın boyun kaslarına bir gümüş/gümüş klorür referans elektrodu yerleştirin. Pipeti ilgilenilen bölgenin üzerine konumlandırın.Amplifikatörün buzz düğmesini, gerektiğinde pipeti temizlemek için kullanarak pipeti beyne istenen derinliğe kadar yavaşça yerleştirin. Amplifikatörün köprü devresini kullanarak akım basamaklarına yanıt olarak meydana gelen voltaj düşüşlerini sıfırlayıp pipet direncini kompanse edin. Ardından, kraniyotomi bölgesini kurutmak için pamuklu çubuklar veya sentetik absorbsiyon üçgenleri kullanın ve beyin hareketlerini azaltmak için bölgeyi silikon elastomer veya %4 agarose ile kapatın.Ardından, pipeti, bir hücreye yaklaşırken direnç artana kadar bir veya iki mikrometrelik adımlarla aşağı indirin. Nörona nüfuz etmek için amplifikatörün buzz fonksiyonunu kullanın. Kayıt stabilize olduğunda, nörona küçük akım adımları enjekte edilirken köprü (bridge) parametresini ayarlayarak elektrot direncini kompanse edin.Ardından, nöronun intrinsik özelliklerini çıkarmak için hücre içine akım enjekte etmek veya duyusal stimülasyonlar uygulamak gibi uygun deneysel protokolü gerçekleştirin. Daha sonra, intraperitoneal hat üzerinden yüksek ancak infraletal dozda sodyum pentobarbital enjekte edin. 15 ila 20 dakika içinde, hücre içi ve elektrokortikografik aktiviteler, geçici olarak sözde burst suppression profiline ulaşmak üzere aralıklı elektriksel sessizliklerle yavaşlamalı ve bu profil kademeli olarak tamamen izoelektrik bir duruma dönüşmelidir.Kalp hızının önemli ölçüde yavaşlaması beklenmektedir ancak SPO2 ve EtCO2 değerleri nispeten sabit kalmalıdır. Ardından, ağ dinamiklerinin kaydedilen nöronların integratif özellikleri üzerindeki etkisini karşılaştırmak için stimülasyon protokolünü tekrarlayın. Anestezik enjeksiyonların durdurulmasından sonra, elektriksel beyin aktivitesi üç ila dört saat içinde tamamen düzelmelidir.Bu şekil, uykunun erken evrelerinde veya uyanıklık sırasında endojen olarak üretilen kortikal dinamikleri taklit eden, iki farklı anestezik koşul altındaki spontan hücre içi ve elektrokortikogram aktivitelerini göstermektedir. Uyku benzeri durum sodyum pentobarbital enjeksiyonu ile, uyanıklık benzeri durum ise fentanil ile indüklenmiştir. Her iki durumda da, ardından yapılan yüksek doz sodyum pentobarbital enjeksiyonu, ECOG'da ve eş zamanlı olarak kaydedilen nöronlarda spontan aktivitenin tamamen ortadan kalkmasına neden olmuştur; bu nedenle izoelektrik terimi kullanılmıştır.Süregelen sinaptik aktivitenin baskılanması, nöronal membran potansiyelinde belirgin bir hiperpolarizasyonla sonuçlanmıştır. Akımla uyarılan yanıtlar, izoelektrik durumun indüklenmesinden önce ve sonra oluşturulabilir. Bu durum, artan yoğunluktaki akım basamaklarına yanıt olarak ana uyarılan ateşleme hızı şeklinde ifade edilen nöronların girdi-çıktı transfer fonksiyonu üzerinde farklı serebral aktivitelerin karşılaştırılmasına olanak tanır.Bu prosedür uygulanırken, güvenilir serebral dinamikler ile ilişkili yüksek kaliteli kayıtlar elde etmek için hayvanın en iyi fizyolojik koşullarda tutulmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu yaklaşım, geri dönüşümsüz veya geri dönüşümlü derin koma durumlarında nöronların yanıt verme kapasitesini incelemek için bir model olarak da kullanılabilir.

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, ince uçlu bir cam mikropipet ve özel bir kurulum kullanılarak tek beyin nöronlarından gelen elektrik sinyallerinin kaydını göstermektedir. Mikropipet, farenin beynine dikkatlice yerleştirilir ve iç nöronal elektrik sinyallerini kaydetmek için nörona nüfuz etmesi için vızıldar.

Tek Bir Nörondan Hücre İçi Sinyallerin İn Vivo Kaydı

Burada, ikili işlevlere sahip bir cam pipet yapıyoruz: ilaçların mikroenjeksiyonları ile derin beyin yapılarının inhibisyonu ve eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlar yoluyla etkilerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesi.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Çalışmalar, katodal transkraniyal doğru akım stimülasyonunun ilaca dirençli nöbetler üzerinde baskılayıcı etkiler yaratabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada, farelerin beyin dilimi hazırlığında nöbet benzeri aktivitenin doğru akım stimülasyonu ve çoklu elektrot dizisi kaydının değerlendirildiği bir in vitro deney düzeneği tasarlanmıştır. Doğru akım stimülasyon parametreleri değerlendirildi.

Fare Beyin Dilim Hazırlık içinde nöbet benzeri Faaliyet doğrudan akım Stimülasyon ve Multi-elektrot Dizi Kaydı

Uyanık farelerde hücre dışı nöral aktiviteyi aynı anda kaydetmek ve kayıt bölgelerinin yakınında birden fazla nöroaktif madde salmak için elektrotların yapımı için yöntemler sunuyoruz. Bu teknik, ilgilenilen nörona varsayılan yerel sinaptik girdilerin ayrıntılı analizine izin verir.

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

4 aminopyridine uyarılan epileptiform aktivite kayıt ve elektrik modülasyon elektrot dizileri kullanma kemirgen beyin dilimler halinde gerçekleştirme göstermektedir. Özel kayıt odası doku canlılığı uzun süreli deneysel oturumları boyunca korur. Elektrot eşleme yaşamak ve uyarıcı çiftlerinin seçimi özel bir grafik kullanıcı arabirimi tarafından yapılmaktadır.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Akut kriz modelleri epileptiform olaylar altında yatan mekanizmaları eğitim için önemlidir. Ayrıca, epileptiform olaylar üstünde-istek oluşturma yeteneği kendi başlatma altında yatan olay tam sırası çalışmaya son derece verimli bir yöntem sağlar. Burada, fare ve insan dokusu içinde kurulan akut 4-aminopyridine kortikal nöbet modelleri açıklar.

Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma

Beyin sapı uyarılmış reaksiyon odyometrisi klinik nörofizyolojide önemli bir araçtır. Günümüzde hem farmakolojik hem de genetik hayvan modellerini içeren temel bilim ve preklinik çalışmalarda beyin sapı uyarılmış yanıt Odyometri de uygulanır. Burada işitme beyin tepkileri yanıtlarının farelerde nasıl başarıyla kaydedilip analiz edileceğini ayrıntılı bir şekilde tarif ediyoruz.

Farelerde beyin sapı uyarılmış yanıt odyometrisi veri edinme ve Analizi

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Beyin elektriksel alan ölçümleri ve ilgili bir biyobelirteç-serebral kan akışı açısından ekstrakraniyal stimülasyon için doz-yanıt eğrilerini değerlendirmek için bir protokol tanımladık. Bu protokol beyne invaziv elektrot yerleştirilmesini içerdiğinden, kontrollü solunum yerine spontan solunum tercih edilerek genel anestezi gerekir.

Anestezi Uygulanmış Farelerde Ekstrakraniyal Uyarıcı Elektrotların Yerleştirilmesi ve Serebral Kan Akımı ve İntrakraniyal Elektrik Alanlarının Ölçülmesi

Burada, ex vivo beyin dilimlerinde tutulan dorsal lateral genikülat çekirdekten röle nöronlarında nöronal içsel uyarılabilirliğin uzun vadeli plastisitesini indüklemek için bir protokol açıklıyoruz.

Dorsal lateral genikülat çekirdeğin nöronlarında içsel nöronal uyarılabilirliğin uzun süreli plastisitesinin indüklenmesi

Öğrenin izoelektrik beyin durumunda tek nöronların özelliklerini in vivo olarak nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem, sinaptik girdiler olmadan nöron hesaplamalarını ve ağ etkisini değerlendirmeye olanak tanır.

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için İn Vivo (Video) | JoVE Journal

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için

Daha fazla video keşfet