Üç boyutlu Biyomimetik Teknoloji: Roman Biorubber Kollajen Hidrojeller içinde Mikro ve Makro ölçekli Mimarileri Tanımlı oluşturur

Bu protokolün genel amacı, in-vivo dokunun mimari özelliklerine, bileşimine ve mekanik özelliklerine benzeyebilen üç boyutlu kollajen iskeleleri tasarlamaktır. Bu yöntem, diğerlerinin yanı sıra ECM hücre etkileşimleri, mimari özelliklerin mühendislik dokularının oluşturulmasındaki etkisi ve doku replasmanlarının geliştirilmesi gibi doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, biyolojik olarak parçalanabilen bir malzemede iç akış kanallarının ve yollarının mikro geometrisini yüksek doğrulukla özetlemek için uygun bir prosedür sağlamasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir ortak olan Veronica Rodriguez-Rivera olacak. BSA kauçuğunu hazırlamak için kullanılan malzemeler, BSA kauçuğunun zamanından önce sertleşmemesi için kullanıma hazır olana kadar saklanmalı ve soğuk tutulmalıdır. Sterilite de bu prosedür için çok önemlidir.

İlk önce dağıtıcıyı sterilize edin. Hücre olmayan bir kültür başlığında, O halkalarını, şırıngayı, kapağını, karışım ucunu ve dörde bir dağıtıcıyı yerleştirin. Bu malzemeleri 30 dakika boyunca UV ile sterilize edin.

İlk olarak, iki paslanmaz çelik kalıp parçasını birbirine vidalayın ve Luer kilidini takın. Dağıtıcıyı monte etmeden önce, pipetleri ve reaktifleri davlumbaza yerleştirmeden önce %70 etanol püskürtün. Önce uç kapağını çözelti tutucusuna takın.

Ardından, %30 BSA solüsyonunu diğer hazneyi kirletmeden daha büyük hazneye yükleyin. O halkasını takmak için yeterli alan bırakın. Ardından, daha küçük dağıtıcı haznesini yüzde üç gluteraldehit ile yükleyin ve başka bir O halkası takın.

Şimdi, şırıngayı dağıtıcıya takın. Ardından düzeneği, kapak üstte olacak şekilde eğin ve kapağı bir karıştırma ucuyla değiştirin. Ardından, hava kabarcıklarının yukarı doğru hareket etmesine izin vermek için yanlara hafifçe vurun.

Ardından, egzoz solüsyonunu içermek için dağıtıcıyı otoklavlanmış bir torbanın içine yerleştirin. Torbada, dağıtıcı dik durumdayken, şırıngadaki tüm havayı temizlemek için az miktarda çözelti dağıtın. Havanın uzaklaştırılması çok önemlidir.

Ardından, hızlı bir şekilde paslanmaz çelik Y kalıbının Luer kilidini şırınga ucuna takın. Şimdi, baskın olmayan elinizdeki kalıpla, çıkış kanallarının sol ve sağ egzozlarına alternatif çıkarma solüsyonu. Egzozlara bastırın, böylece iç boşlukları çözelti ile doldurun.

Ardından kalıbı yatay olarak konumlandırın ve dağıtıcı hacminin yarısı kullanılana kadar üzerine daha fazla çözelti enjekte edin. Kalıp şimdi bir tabağa yerleştirilmeli, parafilm ile sarılmalı ve gece boyunca dört santigrat derecede saklanmalıdır. Bu prosedür dört gram asitlenmiş kollajen olarak ölçeklendirilir.

Kullanılana kadar soğuk tutun. Kollajen ağırlıklandırıldıktan sonra, çözeltiyi gama radyasyonu ile sterilize etmeye devam edin. Hazırlık olarak, suda taze 0.2 normal HEPES çözeltisi yapın.

Ardından içeriği 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Konsantre sodyum hidroksit kullanarak pH'ı dokuza ayarlayın. Başlığı UV ile sterilize ettiğinizden ve forseps, spatula ve neşteri otoklavladığınızdan emin olun.

Kaputta, 1,5 mililitre HEPES çözeltisini 1,5 mililitre 10x MEM ile karıştırın. Bu karışımı buz üzerinde saklayın. Ayrıca, 12 oyuklu bir plakayı ve 20 mililitrelik bir şırıngayı dondurucuda 10 dakika soğutun.

Daha fazla sterilite için, kaputa yerleştirmeden önce tüplere ve plakalara %70 etanol püskürtün. Kalıp plakasını püskürtün ve davlumbazın içine yerleştirin. Ardından, BSA kauçuk kalıplarını forseps ile çıkarın.

Ardından, bir neşter kullanarak egzoz kanallarını kalıptan kesin. Daha sonra, HEPES-MEM karışımını kısaca girdaplayın ve kollajene bir mililitre ekleyin. Ardından, çözeltiyi steril bir spatula ile iyice karıştırın.

Kısa bir girdap ile takip edin ve çözeltiyi hızlı bir şekilde soğuk, 20 mililitrelik şırıngaya aktarın. Şimdi, BSA kauçuğunu kuyunun içine sabitlerken, kollajen hidrojel çözeltisinin yarısını kuyu dibine dağıtın. Daha sonra, cımbız kullanarak kalıbı, kauçuk giriş ve çıkış uçları kuyu duvarlarına temas edecek şekilde konumlandırın.

Ardından kalıbı kollajen hidrojel ile örtün. Şimdi, kuyuyu parafilm ile kapatın ve plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yükleyin. Kollajenin polimerize olması için bir saat bekleyin.

Bu süre zarfında davlumbazdaki UV ışığını açık tutun. Ayrıca, UV çapraz bağlama aparatını santimetre kare başına 630.000 mikrojul verecek şekilde ayarlayın. Şimdi, eldivenli ellerinize %70 etanol püskürtün ve kollajen kaplı kalıpların bulunduğu plakayı çapraz bağlayıcıya yükleyin ve ışınlama işlemini başlatın.

Işınlamadan sonra eldivenlerinizi tekrar püskürtün ve plakayı çapraz bağlayıcıdan boşaltın. Daha sonra, steril bir spatula kullanarak jeli kuyudan çıkarın, ters çevirin ve hidrojelin altını çapraz bağlayın. Son çapraz bağlama döngüsünden sonra, enzim sindirimine devam edin.

Kollajen iskelesini bozmadan BSA kauçuğunu çıkarmak için, pH 7.8'de steril %0.25 tripsin çözeltisi kullanın ve 0.20 mikronluk bir filtreden geçirin. Yeterince filtrelenmiş tripsin çözeltisini yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Ardından, kollajen hidrojeli enzim çözeltisini içeren konik tüpe aktarın.

Hidrojelin solüsyonla tamamen kaplandığından emin olun. Tüpü parafilm ile kapatın ve yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe girdaplayın. Daha sonra, tüpü 30 santigrat derecede inkübe edin ve sindirimin 15 ila 24 saat sürmesine izin verin.

İlk dört saat boyunca, tüpü her 15 ila 30 dakikada bir çıkarın ve BSA kauçuğunun sindirimini tamamlamaya yardımcı olmak için hafifçe girdap yapın. Ertesi gün, çözelti içinde hiçbir kauçuk yüzmediğinde veya hidrojelde parçalanmış kauçuk parçaları olmadığında sindirim tamamlanmış kabul edilir. Şimdi, tripsin çözeltisini steril Mosconas çözeltisi ile değiştirin ve tüpün 30 dakika boyunca dört santigrat derecede çalkalanmasına izin verin.

Daha sonra Mosconas solüsyonunu aspire edin ve kollajen iskelesini tamamen temizlemek için bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Biyokauçuğun kullanımını optimize etmek için çok sayıda test kullanılmış ve metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Optimize edilmiş protokol ve üç katı kalıp parçası kullanılarak, kollajen hidrojeller üretildi ve ayrıntılı olarak incelendi.

İhtiyaç duyulan Y kalıbı bir Microlution makinesinde üretildi. Y kalıbına% 30 BSA ve % üç glutaraldehit enjekte edildi ve bu da gece boyunca dört santigrat derecede reaksiyona girdi. Daha sonra, BSA kauçuğu kollajen ile döküldü ve bir saat boyunca 37 santigrat dereceye kadar ısıtıldı.

Kauçuk, 15 saat boyunca enzim sindirildi, bu da onu kollajen hidrojelin geometrisini etkilemeden düşme noktasına kadar zayıflattı. Kalıp tarafından dökülen dört milimetrelik giriş kanalı, kollajen hidrojelde tam olarak dört milimetre olacak şekilde kaliperlerle ölçüldü. Kalıbın stabilitesi test edildiğinde, 300 mikron kadar küçük boyutların güvenilir bir şekilde tasarlanabileceği bulundu.

Ek olarak, iskeleler Mosconas yıkamalarından sonra kalıntı glutaraldehit açısından test edildi ve herhangi bir kalıntı bulunmadı. Bu videoyu izledikten sonra, in-vivo geometrileri taklit etme potansiyeline sahip 3D kollajen iskelelerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için in-vivo dokuların 3D modellerinin oluşturulması ve belirli mimari özelliklere sahip kalıpların üretilmesi gibi bu tekniği tamamlayan diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, in vitro modellerde hücrelerle iç mimari özellikler ve matris bileşenleri arasındaki etkileşimi keşfetmelerinin yolunu açtı.