Name: Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinde genom düzenleme yöntemini. Elektroporasyon ve koloni izolasyonu ile AAVS1 lokusunu hedefleyerek EGFP ekspresyonu ve antibiyotik direnci kazandırma tekniğini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Helen Bateup bir Beyin Araştırmaları Vakfı Tohum Grant (BRFSG-2014-02) tarafından desteklenmiştir. Dirk Hockemeyer Ellison Tıp Vakfı Yaşlanma Yeni Bir Scholar ve Glenn Vakfı yanı sıra Shurl ve Kay Curci Vakfı tarafından desteklenmektedir. DH ayrıca NIH hibe 1R01CA196884-01 tarafından desteklenmektedir.

Bu yazıda anlatılan prosedürleri gözden ve UC Berkeley Kök Hücre Araştırma Gözetim Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Düzenleme için Kök Hücreler hazırlayın <ol><li> Büyüme ve mitomisin C ile pasifleştirilmiş fare embriyonik fibroblast 2,4 x 10 6 hücre / levha ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka kültür insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) (MEF) besleyiciler jelatin 32 üzerinde büyümüş. Oyuk (HESC ortamı) başına insan embriyonik kök hücre ortamının 3 ml hPSCs korumak ve 37 büyümesini % 3 O 05/02% CO2 ile ° C inkübatör. Not: Bu protokolün başarısına için, düşük oksijenli bir inkübatör hPSCs korumak için gerekli değildir; Ancak bu kat ve hücre sayıları buna göre ayarlanması gerekir, böylece hPSCs yüksek O 2 ortamında hızlı çoğalan dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, düşük oksijen muhafaza hPSCs kendiliğinden farklılaşma 33 alt fiyat sahip olduğuna dikkat edilmelidir. <ol><li> TO 500 mi HESC ortam 380 ml DMEM / F12, 75 mi Fetal Sığır Serumu (FBS) kombine olmak, 25 mi nakavt Serum Replacement (KSR). Glutamin (1 mM nihai konsantrasyon), 5 ml 100x, esansiyel olmayan amino asitler, 100 birim / ml Penisilin-Streptomisin (P / S), bazik Fibroblast Gelişim Faktörü (bFGF) (4 ng / ml nihai konsantrasyon), ve 2- ekleme merkaptoetanol (5.5 uM nihai konsantrasyon). </li></ol></li><li> Medya (3 ml) tüm hacmini çıkarmadan bir cam pipet ve vakum kullanarak ortamı değiştirin. 3 ml ılık hESC medya serolojik bir pipet kullanarak değiştirin. HPSCs yaklaşık% 50 konfluent (Gün -1) kadar tekrarlayın medya her gün değiştirin. </li><li> Bir gün (Gün -1) hedefleme önce, eski medya kaldırılması ve 10 uM Y-27632 ile desteklenmiş sıcak hESC medya ekleyerek, HESC ortamı değiştirmek. </li><li> Ayrıca Gün -1 üzerine, DR4 farelerinin (2.4 x 10 6 hücre / plaka) 34 ilaç dirençli MEF besleyici hücreler iki 6-kuyu veya 10 cm plakalara birini hazırlamak. Not: Genel olarak, 6 kuyu plakalar reklam vardıravantajdır üzerinde 10 cm&#39;lik tabak, onlar daha çok medyayı ağırlayacak olarak. 6 kuyu plakaları da farklı kuyulardan farklı klonlar bağımsız olmasını sağlamak. Bununla birlikte, 10 cm plaka, bu işlem için uygun bir mikroskop bağlı olarak, daha kolay toplama sağlayacaktır. </li></ol> 2. Düzenleme Pluripotent Kök Hücreler <ol><li> 1.5 ml tüp içine CRISPR / Cas9 px330 kodlayan plazmid (Şekil 1) ZFN 1 ve 2, TALEN, 1 ve 2 ya da 15 ug 5 ug her bir pipetleme transfeksiyon çözelti hazırlayın. Pipet 30 de bu tüpün içine onarım plazmid mikrogram. Son olarak, tüpe pipet 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) 300 ul hacmi getirmek için. Not: 300 ul transfeksiyon altında çözeltisinin hacmi tutmak için 300 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyona sahip en az (herhangi bir kit uygundur) bir Midiprep plazmidler hazırlayın. Bu plazmid düz hale getirmek üzere, ya da endoto kullanmak için, fenol / kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirmek için gerekli değildirXin ücretsiz plazmid hazırlık kiti. </li><li> Cam bir pipet ve vakum kullanılarak hPSCs ortamı çıkarın. Her bir kuyunun içine Pipet 2 ml ılık 1x PBS hücrelerini yıkamak için. </li><li> Hemen bir cam pipet ve vakum kullanılarak PBS çıkarın. Her bir gözdeki hücrelerin doğrudan 0,5 ml% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Yaklaşık 10 dakika boyunca bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO 2/3% O 2) yerleştirin. ya da besleyici tabaka plakasını kaldırın başlayana kadar. </li><li> Tripsin reaksiyonu durdurmak için her bir oyuğa, 2 ml sıcak esWash ortamı (470 ml DMEM / F12, 25 mi FBS, 100 ünite / ml P / S) ekleyin. </li><li> Bir yaprak gibi dökülmek bu besleyici hücreler olun. Tüm kuyuları birleştirerek, iyi bir tek 50 ml&#39;lik konik tüp içine her içeriğini pipetle. 10 ml&#39;lik serolojik pipet kullanarak triturate hücreleri. Bu besleyici tabaka kırmak için gerekli değildir; hPSCs dikkatlice toz haline getirilerek besleyici tabakanın ayrılırlar. Hücre süspansiyonunun yaklaşık 15 ml olmalıdır. </li><li> VOLU getirmek için tüp esWash ortam 25 ml ilave edilirBeni en fazla 40 ml toplam. Büyük besleyici topakları 1-2 dakika boyunca tüpün dibinde yerleşmek için izin verin. Yeni 50 ml konik tüp içine bir serolojik pipet ve mevduat kullanarak tüpten (~ 38 ml) çıkarın. </li><li> 190 x g&#39;de 5 dakika aşağı doğru döndürün. Cam bir pipet ve vakum kullanılarak tüpten çıkarın. Hücre pelet rahatsız değil emin olun. PBS 1x 500 ul hücrelerin tekrar. Daha önce hazırlanan plazmid transfeksiyon solüsyonu ile birleştirin. Bu aşamada hücreleri saymak. Elektroporasyon başına 5-10 milyon hücre kullanın. </li><li> , 4 mm&#39;lik bir elektroporasyon küveti içine tüm 800 ul süspansiyon Pipet 3-5 dakika buz üzerine yerleştirin. 250 V, 500 iF, ∞ direnci ve 4 mm küvet boyutu: elektroporasyon aşağıdaki parametrelerle sistem üzerinde üstel programı kullanarak electroporate hücreleri. Elektroporasyondan sonra, 3 dakika boyunca geri buz üzerine küvet kullanır. Not: elektroporasyon sistemi üzerinde elektroporasyon sabit süresine uyulmalıdır. Zaman sabitihücre sayısı ve DNA saflığı ile değişir. Listelenen koşulları ve gen üreteci II kullanırken Başarılı nakiller genellikle 10-14 msn arasında sabit bir zaman var. Zaman sabitleri bu değerlerden değişir daha düşük elektroporasyon verimleri oluşabilir. </li><li> Sıcak HESC Medya 10 uM Y-27632 ile desteklenmiş 18 ml electroporated hücreleri tekrar süspansiyon. Plaka 3 DR4 besleyici hücreler ile bir 6 yuvalı plaka her oyuğuna, bu, tek bir hücre süspansiyonunun mi. Inkübatör (37 ° C /% 5 CO 2 /% 3 O 2) geri dönün. </li></ol> Pozitif Kolonilerin 3. Seçim <ol><li> Gün 2, bir cam pipet ve vakum kullanılarak tüm medyayı çıkarın. 10 uM Y-27632 ile takviye edilmiş, sıcak HESC ortamının 3 ml değiştirin. 3. Gün, cam pipet ve vakum kullanılarak tüm medyayı çıkarın. Y-27632 de dahil olmak üzere olmadan sıcak HESC ortamının 3 ml değiştirin. 4. Gün, cam pipet ve vakum kullanılarak tüm medyayı çıkarın. 3 ml selecti antibiyotik ile takviye edilmiş, sıcak HESC ortamı değiştirinüzerinde. Inkübatör (37 ° C /% 5 CO 2 /% 3 O 2) geri dönün. Not: direnç kaseti bağlıdır kullanılan antibiyotik türü tamir şablonunda dahil. WIBR 3. hPSCs (NIH kayıt 0079), 0.5 ug / ml puromisin, 70 ug / ml G418 (genetisin) ve 35 ug / ml higromisin çalışırken başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Seçimi için konsantrasyonlar yaklaşık bir hafta içinde, vahşi tipli hücreleri öldürmek için gereken antibiyotiğin asgari konsantrasyon kurarak ampirik olarak belirlenmelidir. </li><li> Gün 5-12, antibiyotikler ile desteklenmiş sıcak hESC medya ile eski Ortam her zaman yerine günlük ortamı değiştirmek. Not: Hücre ölümü büyük miktarda bekleyin. Bireysel koloniler günde 8-10 civarında anlaşılacaktır. Antibiyotiksiz düzenli HESC ortam sürekli seçimi 12-14 gün sonra kullanılabilir. Hücre yoğunluğu yüksek ya da hücre ölümü yavaş ise, ortam asitleştirilmesi kaçınılmalı ve bu ortam VOLU arttırmak gerekli olabilirSeçimin ilk birkaç gün boyunca beni (4-5 ml). </li></ol> 4. Toplama Seçilen koloniler (Gün 12-14) <ol><li> Günde 12-14 koloniler gözlemleyin. Diseksiyon mikroskobu üzerinde almak ve onlar ayırt başlıyor hücreleri içermediğinden emin olmak için hazırız koloniler gözlemleyin. Yaklaşık boyutu 800-1,200 uM olmalıdır. Koloniler günde 12 önce bu büyüklüğe ulaşmak ise, daha sonra çekilmesi gerektiği önerilmektedir. Not: Her hedefleme deney için, istenilen genotip izole sağlamak için gerektiği kadar koloniler seçin. Bir örnek olarak, AAV-CAGGS EGFP onarım bir şablonla AAVS1 düzenleme sürekli olarak sağlam bir entegrasyon gösterilen ve sadece 12-24 koloniler, yaklaşık 5-10 heterozigotik hedeflenen klonlar elde etmek üzere alınmayı gerektiren gelmiştir. Daha fazla koloni gerektirebilir diğer hedefleme deneyleri (Tablo 1) çekilecek. Doğru hedefleme olaylarının sıklığı gibi SS verimliliği gibi faktörlere bağlıdırN DSB, insert büyüklüğü ve seçim stratejisi tanıtmak. Doğru düzgün hedeflenmiş bir klon elde edilmesi için gereken koloni sayısını azaltarak, bir hedef bölgeye entegre olduğunda burada sunulan AAVS1 lokusu için gen trap yaklaşım durumunda, seçim marker yalnızca ifade edilir. </li><li> (Her koloni aldı doları / plaka 2.4 x 10 6 hücre, bir de kullanılır) Bir gün almadan önce MEF&#39;ler 12-kuyu plakaları hazırlamak. </li><li> Toplama gününde, bir cam pipet ve vakum kullanılarak 12 de MEF plakaları tüm medya kaldırmak ve 1 ml hESC medya ile değiştirin. Ayrıca toplama gününde, seçilmiş olacak 6 kuyu plakalar üzerinde hESC ortamı değiştirmek. </li><li> Besleyici katmandaki tek tek kolonilerin mekanik ayrışma için cam pipetler çekin. Bir in-kaputu Bunsen beki üzerinde pipetler indirin ve cam dövülebilir kadar genişleme noktasında yumuşadı. Hızla alev kaldırmak ve pipet ayrı bir açısal noktası oluşturma çekin. Kırındar bir kanal bırakarak eğilmiş eksene yaklaşık 2 cm etmektedir. 1-2 saniye alev teşhir ederek kanalın sonuna lehçe. Not: İsteğe bağlı, ancak bu kültürün klonalite azaltabilir, koloniler bir p20 pipet ucu almak, donuk ucu potansiyel sonraki avanta kirletici, ortama her koloninin hücreleri büyük miktarlarda çıkarmak olabilir. </li><li> P1000 filtre pipet alarak ve dar ucuna bir emme ampul takarak cihazı toplama birleştirin. Geniş sonunda çekti cam pipet yerleştirin. </li><li> HPSCs bir 6-deney levhası, bir doku kültürü kaputu monte edilen bir diseksiyon mikroskobu aşamasında alınmayı yerleştirin. Toplama cihazının ampul sıkıştırın ve yavaşça ortama parçaları serbest bırakmak için özen tüketim ve 10-20 eşit büyüklükte parçalar halinde bireysel koloni kesti. Ampulü bırakarak pipet içine koloni kesilmiş hPSC parçalarını alın. Aktarım sırasında mümkün olduğunca az medyayı almaya çalışın. </li><li> Transfer 12 kuyu MEF plaka tek bir kuyudan, şimdi kırık koloni bırakmadan doğrudan kuyuya tekrar ampulü sıkıştırarak bireysel koloni. Tek hücreden türeyen klonlann belirlenmesine olanak sağlamak için eşsiz bir Her çukurun etiketleyin. Cam pipet her zaman değişen gerektiği gibi birçok koloniler için tekrarlayın. Not: Toplama koloniler öğrenmek için biraz zaman alabilir. Bu hedeflenen koloniler izole etmeye çalışırken önce bazı kontrol hücreleri üzerinde deneyci uygulaması tavsiye edilir. </li><li> Hafifçe her bir orta hücre birikimini önlemek için birinci plaka, sallanan kuluçka makinesi (37 ° C /% 3 O 05/02% CO2) 12 gözlü levha üzerinde döndürür. </li><li> Bir sonraki gün, her takip eden gün bir cam pipet ve vakum kullanılarak ortamın hacmini çıkarın ve hücreleri, yaklaşık% 50 konfluent kadar ılık HESC ortamı 1,5 ml ile değiştirin (bu genellikle 10-12 gün sürer). </li><li> 10-12 gün sonra, her bir iki koloni birini seçmek ve yeniden yeni 12-kuyu MEF plakaları transferpeating bir yineleme plaka üretmek için 4.1-4.8 adımları tekrarlayın. </li><li> Orijinal MEF plakaların her kalan koloniler DNA (aşağı bakınız) ekstrakte edin. <ol><li> Cam bir pipet ve vakum kullanılarak tüm kuyulardan bulunan ortamı çıkarın. Iyi hücreleri yıkamak için her üzerine PBS 1x Pipet 1 ml. Cam pipet ve vakum kullanılarak PBS çıkarın. Pipet hücre parçalama tamponu 250 ul (H2O içinde nihai konsantrasyonlar: 10 mM Tris HCI, 5 mM EDTA,% 0.2 SDS, 200 mM NaCI, 0.08 mg / ml proteinaz-K) her üzerine yerleştirin. Inkübatör Yeri (37 ° C /% 3 O 2 /% 5 CO 2) O / N. </li><li> Sonraki gün, pipet Her oyuğun içeriği bireysel 1.5 mi borular. Pipet Her tüpe izopropil alkol 250 ul DNA çökeltildi. Kuvvetlice tüpü çalkalayın. Beyaz bir çökelti görünür olmalıdır. </li><li> Bir masa üstü santrifüjü içinde 13,000 rpm&#39;de 3 dakika için her bir tüp dönerler. Spin aşağı sonra sıvı atık haline boşaltılarak süpernatant atın. Bir küçük DNA pelet altına sıkışmış kalmalıdırtüp. DNA pelet yıkamak için her bir tüp içine% 70 etanol içinde 250 ul Pipet. Kuvvetlice sallayın. Bir masa üstü santrifüjü içinde 13,000 rpm&#39;de 3 dakika için her bir tüp dönerler. </li><li> Aşağı iplik sonra, sıvı atıklar içine boşaltılarak süpernatant atın. Küçük bir DNA pelleti, tüpün altına takılıp kalması gerekir. Tüp sol herhangi bir sıvı yoktur yani süpernatant geri kalanını pipetle. 5-10 dakika masa üstü kuruması için açık tüp bırakın. Kurutma işleminden sonra, 250 ul TE tamponu içinde yeniden süspanse DNA. DNA, çözünmesi için 6 saat süre ile 37 ° C &#39;de yerleştirin. </li></ol></li><li> PCR optimize önceden veya güney leke strateji kullanarak her bir örnek Genotip. Not:.. AAVS1 AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu kullanan hedefleme için, Güney benek stratejisi ve arkadaşları, 2009 4 kapsamlı bir güney lekeleme protokolü Southern bulunabilir Hockemeyer bulunabilir 2006 35 arasında çoklu PCR genotipleme için. Aynı deney, astar ve koşullar olabilirTablo 2 36 bulunabilir. </li><li> Doğru hedeflenmiş olmayan kuyular atın ve her gün doğru hedeflenmiş hücreler üzerinde HESC medya değiştirerek devam edin. Bunların yaklaşık% 50 konfluent olduğunda, hücreleri aşağı Freeze protokolü dondurma için aşağıya bakınız. <ol><li> Bir gün dondurmadan önce, eski medya kaldırılması ve 10 uM Y-27632 ile desteklenmiş sıcak hESC medya ekleyerek, HESC ortamı değiştirmek. </li><li> Donma günde iki 15 ml konik tüp içinde dondurulur olan bir 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu çözelti A ve çözelti B, 0.5 ml, her hazırlayın. Buz üzerinde yerleştirin çözümleri. Çözelti A:% 50 hESC medya ve% 50 FBS; Çözelti B:% 80 FBS ve% 20 dimetil sülfoksit (DMSO). </li><li> Dondurmadan önce tek hücre içine hPSC kolonileri ayırmak. Buna göre hacimleri ölçekleme, bunu yapmak için adımlar 2,2-2,8 izleyin. Çözelti A&#39;nın 0.5 ml tam tekrar süspansiyon hücre topağı </li><li> Hücre süspansiyonu, pipet up 0.5 ml solüsyon B ekleyin ve aşağı hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için. Take 2 ml cryotube hücre süspansiyonu (~ 1 mi) ve yatağın toplam hacim. Kapağı sıkıca kapatılır. </li><li> -80 ° C dondurucu O / N yerleştirin cryotube. Dondurma gün sonra, -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş hücreleri çıkarmak ve hemen uzun süreli depolama için sıvı azot tankına yerleştirin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+targetable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with targetable nucleases.</a> Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+zinc-finger+nuclease-induced+gene+targeting+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila.</a> Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>DeKelver, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics%2C+proteomics%2C+and+regulatory+DNA+analysis+in+isogenic+settings+using+zinc+finger+nuclease-driven+transgenesis+into+a+safe+harbor+locus+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome.</a> Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+the+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2Fcas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genomes+with+rare-cutting+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases.</a> Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZiFiT+%28zinc+finger+targeter%29%3A+An+updated+zinc+finger+engineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool.</a> Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).</li>
<li>Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+construction+and+in+vitro+testing+of+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), e82(2011).</li>
<li>Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Podhajska, A. J., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+the+FokI+endonuclease+to+a+universal+restriction+enzyme%3A+Cleavage+of+phage+M13mp7+DNA+at+predetermined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites.</a> Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).</li>
<li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation.</a> Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+viral+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.</a> Cell. 136 (5), 964-977 (2009).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).</li>
<li>Chiba, K., Hockemeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+site-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases.</a> Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+O2+tensions+and+the+prevention+of+differentiation+of+hES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Southern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Southern+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Southern blotting.</a> Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR%3A+Critical+parameters+and+step-by-step+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol.</a> BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Sexton, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+identification+of+three+human+TPP1+functions+in+telomerase+action%3A+Recruitment%2C+activation%2C+and+homeostasis+set+point+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation.</a> Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).</li>
<li>Merkle, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+generation+of+knockin+human+pluripotent+stem+cells+lacking+undesired+mutations+at+the+targeted+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus.</a> Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+parkinson+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li>
<li>Forster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+tissue+with+adult+stem+cell+properties+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+specificity+of+TALE-based+genome+editing+using+an+expanded+RVD+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire.</a> Nat Methods. , (2015).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Sci Rep. 4, 5400(2014).</li>
<li>Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.

Gen-düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerin homojen popülasyonları izole etmek için burada sunulan yöntem hedeflenen loküsündeki sadece farklı izojenik hPSC hatları oluşturmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu hücreler insan hücre farklılaşması ve gelişimi mekanizmaları prob hem de kontrollü bir genetik ortamda monogenik hastalıkların patofizyolojisi anlamak için ideal bir sistem bulunmaktadır. Burada gösterildiği gibi, bu AAVS1 lokusuna yönelik entegrasyonu sağlamak için üç bağımsız SSK tasarım stratejileri (ZFNs, TALENS ve CRISPR / Cas9) kullanmak mümkündür. Bu yöntemlerin her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Potansiyel ZFNs bir avantajı, bir dereceye kadar, TALENS bağımsız nükleaz 42 bağlanma domenlerinin DNA geliştirmek amacıyla yinelemeli mühendisliği sağlar tasarım esnekliği vardır. Bu nukleaz optimizasyonu CRI ile başarılabilir ötesinde ZFNs ve Talens özgünlüğünü artırabilirSPR / Cas9 sistemi. Bu tür seçiciliği, hedef yüksek bir spesifite derecesi gerektiren klinik uygulamalar için önemli olabilir. CRISPR / Cas9 sisteminin en önemli avantajı kullanım kolaylığı olduğunu. TALEN ve ZFN yapım setleri (Addgene 21 aracılığıyla, yani,) kamuya olmasına rağmen sadece gerekli özelleştirme bir 20 baz çifti oligonükleotid olarak px330 plazmidi kullanıldığında, CRISPR / Cas9 tabanlı SSNs (oluşturmak için önemli ölçüde daha kolay Tasarım 14). Bu basitlik kendi çalışmalarında genom düzenleme dahil etmek isteyen araştırma laboratuarları için avantajlı olduğunu kanıtlamaktadır. Gen-düzenlenmiş hPSC satırları oluşturmak için nucleofection 43, dahil olmak üzere alternatif transfeksiyon teknikleri vardır; Ancak elektroporasyon, tutarlı ve düşük maliyetli 4,5,25 olduğu gösterilmiştir. Nucleofection SSK etkinliği yükselen doğrudan çekirdeğin içine Cas9-kılavuz RNA ribonükleoprotein kompleksleri transfekte etmek için kullanılabilird sadakat 44. MEF&#39;lerden üzerinde hPSCs Büyüyen aşırı farklılaşma olmadan bir pluripotent devlet hPSCs korumak için sağlam ve ucuz bir yöntemdir. Buna ek olarak, bu genetik olarak özdeş kolonilerin kolay izole edilmesini sağlar. Alternatif olarak, bununla birlikte, bu kültür koşulları besleyici göre kültürler daha pahalı olabilir MEF&#39;ler içermeyen kültür hPSCs mümkündür. Bundan başka, tüm süreç çok nadir düzenleme etkinlikleri izolasyonu veya paralel düzenleme deneylerinde, birçok farklı hücre serilerinin jenere edilmesi için izin ölçeklenebilir. Burada açıklanan protokol sağlamdır; Ancak doğru düzenlenmiş klonlar elde edilebileceği ile verimliliği etkileyen birçok önemli adımlar vardır. Bu yöntem için en kritik bileşeni yüksek kaliteli MEFS ve ilaca dirençli DR4 MEFS yaşıyor. Tek hPSCs sağkalım ince ve düşük kaliteli MEF&#39;ler farklılaşmamış hPSC hatlarının izolasyonu engel olacak. İkinci olarak, Y-27632 kullanımı daanormal karyotip 45 olan hücreler için selektif bir basınç oluşturmadan tek hücre hayatta kalmasını garantileyen, anahtar. Üçüncü olarak, iyi aralıklı koloniler çekme türetilen hücre çizgilerinin genetik homojenlik sağlar. Son olarak, bu açılış birçok küçük parçalar halinde koloni kırmak için yeterince küçük olacak şekilde birden fazla koloniler yeni kuyuda büyüyecek sağlanması, cam pipetler hazırlamak için önemlidir. Bir kopya plaka genotiplemeye izole kolonilerin orijinal plaka bırakarak, kültürde var Bu iyi aralıklı alt-klon toplama izin verir. Bu protokolde zorlu kısmı cam pipetler çekerek manuel; Bu daha önce uygulanmalıdır. Bir cam pipet gerektirmeyen klonu toplama birden çok teknik vardır olduğuna dikkat edilmelidir. Deneyci kendileri için en uygun olanı bulmak için teşvik edilir. Basit modifikasyonlarla aşılabilir, bu protokole sınırlamalar vardır. O amaçlayan bir deneynly kimin tamir şablonu seçme kaseti içermiyor, düzenlendiği hücrelerin zenginleştiren başka bir yöntem kullanmanız gerekir tamir veya biri olmadan ilgi odağı bozabilir. Pozitif bir klon bulmak için çekilmesi gereken koloni sayısı, seçim yapılmadan büyük ölçüde artırır unutmayın. Verimliliğini artırmak için bir strateji, bir flüoresan proteini eksprese eden bir bütünleşmeyen plazmid birlikte transfekte etmektir. Hücreler iki gün boyunca geri bırakıldıktan sonra, hedef hücreler, flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif kullanılarak pozitif floresans kriteri ve 29 replated olabilir. Bu işlem, elektroporasyon ile plazmit ile transfekte edilmiş hücreler için zenginleştirir ve böylece hücre içinde aynı anda düzenleme olayın olasılığını arttırır. Burada açıklanan teknikler aynı anda birkaç loci 14,46,47 hedef için birden fazla rehber RNA&#39;ların kullanmak için uzatılabilir. Birçok protokol hPSCs ayırt etmek için kurulmuşturfarklı hücre tiplerine, ilgi 30 hücre tiplerinde çeşitli genetik manipülasyonlar izin. Genel olarak, biz ne olursa olsun SSN seçim hPSCs etkili genom düzenleme potansiyelini ortaya koymuştur. Bu teknik, herhangi bir genomik loküsündeki gen düzenlenmiş olan izojenik hPSC satırları oluşturmak için adapte edilebilir öneriyoruz.

Genom düzenleme teknolojileri hızla moleküler ve hücre biyolojisi 1 için standart araçları haline gelişmektedir. HPSCs genetik olarak sağlam primer insan hücreleri, bir kendi kendini yenileyen kaynağı temsil insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) genetik mühendisliği, özellikle ilgi çekicidir. hPSCs hastalığı modelleme veya transplantasyon terapisi 2,3 için bir kaynak gibi çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir. AAVS1 mahalinde bir raportör yapısının hedeflenen entegrasyonu için endojen DNA tamir mekanizmaları ile birlikte siteye özgü nükleazlardır (SSNs) üç farklı tipte kullanan bir protokoldür burada gösterdi. HPSCs içine SSNs transfeksiyonu sonra, muhabir barındıran izojenik hücre popülasyonlarının izole etmek için nasıl gösterilmektedir. Özellikle pluripotent hücre genomları kök, genom manipüle etme yeteneği kullanarak SSNs çinko parmak nükleazlardır (ZFNs) ve transkripsiyon activat yararı olarak yeni bir fenomen değil,gen düzenleme için veya benzeri bir efektör nükleazlar (Talens) birkaç yıl önce 4-10 gösterilmiştir. Ancak, S. pyogenes CRISPR gelişiyle / Cas9 teknolojisiyle 11-13 ile gen düzenleme 14 yaygın olarak erişilebilir hale gelmiştir. Tüm SSNs homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homoloji yönettiği onarım (HDR) 15 kullanılarak endojen hücresel mekanizmalar tarafından tamir edilir belirtilen hedef sitenin 1,4,5,11 bir çift sarmallı DNA kırılmasını (DSB) tanıtmak. NHEJ hata eğilimli ve yeni elemanlar SSN sahip bir tamir şablonunun ko-transfeksiyon yoluyla uygulanabilir için HDR izin verirken, gen fonksiyonunun kaybıyla sonuçlanan çerçeve kayma mutasyonları neden olabilir. Gen düzenleme kolaylaştırmak DNA tamiri altında yatan ilkeler, her SSN büyük ölçüde aynı olduğu düşünülen edilirken, platformlar arasında bazı farklılıklar dikkat edilebilir. De ZFNs ve novo tasarım esnekliği ve nukleaz optimizasyonu 16 alenen bununla birlikte kullanılmasını sağlarBireysel ZFNs tasarım mevcut montaj kütüphaneleri ve tarama araçları zaman alıcı olabilir. ZFN aracılı hedefleme için istenen lokus belirlendikten sonra, ZFN çiftleri online bir araç ZiFit 17 ile tasarlanabilir. Tasarımı sonra ZFNs modüler plasmid klonlama 18 birkaç tur ile monte edilebilir. Alternatif olarak, birçok ticari olarak temin edilebilen, önceden onaylanmış ZFNs 19 vardır. TALE nükleazlar aynı zamanda online araçları ve kamuya açık bileşenler 17,20 kullanılarak dizayn edilebilir. Örneğin, hızlı bir şekilde TALENS FLASH düzeneğinin 21 veya PCR bazlı bir hiyerarşik Altın Kapı düzeneği 22 kullanılarak yoluyla beş TACE tekrarlarının bloklarından monte edilebilir. SSN tasarımı ve CRISPR / Cas9 kullanarak inşaat hızının kolaylığı yaygın erişilebilir düzenleme aracı genom yaptık. Kılavuz RNA&#39;lar çoklama tek yapı 14 ile birkaç loci hedef için CRISPR kısa kılavuz RNA aracılı hedefleme / Cas9 da izin verir. DizaynHedef mahaline proksimal gen düzenleme için Cas9 bir protospacer bitişik motif (S. için bir NGG trinucleotide Cas9 pyrogenes PAM) sadece kimlik gerektirir. Px330 plasmid 14 içine PAM 20 baz çifti 5 &#39;e karşılık gelen bir oligonükleotid sokulmasıyla, yapı, bir klonlama adımında birleştirilebilir. S. ek olarak pyogenes Cas9, N arasından Cas9 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;(PAM) tanır meningitidis (NmCas9) hPSCs 23 verimli gen düzenleme için izin vermek için gösterilmiştir. SSK tasarım kolaylığı farklılıklara ek olarak, her bir platform belirli özelliklere sahiptir. Örneğin, ZFNs ve TALENS Cas9 çok oluşturmak uçlu DSBs künt düşünülmektedir ise dört nükleotid 5 &#39;çıkıntı 24 oluşturur Foki nükleaz etki kullanmaktadır. ZFNs, TALENS ve Cas9, açma-kapama hızı hedef DNA, protein stabilitesi açısından farklılık ve DNA tarama modu her biri cteorik düzenleme sonucu 1 küçük farklılıklara neden ould. Ileri çalışmalara tam bu farklılıkların sonuçlarını anlamak için gerekli olacak, biz burada üç platformlarda son derece sağlam ve kolaylıkla genetiği değiştirilmiş hPSCs oluşturmak için kullanılabilecek bir protokol açıklar. Ne olursa olsun SSN seçim, elektroporasyon hPSCs 25 içine Sosyal Güvenlik Numaralarını ve benzerlik onarım şablonları transfect sağlam bir işlemdir. Antibiyotik direnci için seçimden sonra koloniler hayatta sayısı lokus spesifik parametreler ve düzenleme stratejisi (transgenik ekin ve seçim modu, örneğin boyutu) bağlıdır. Burada açıklanan protokol genellikle yaklaşık 150-400 tek hücreli türetilmiş koloniler halinde sonuçlanır. Gen-düzenleme, bu protokolü kullanarak AAVS1 loküsündeki önce SSNs 4,5 etkinliğini göstermek için kullanılır olmuştur. AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu bir gen tuzak str kullanırategy locus spesifik bir şekilde puromisin direnç kazandırmak için. Kısaca, tamir şablonu yükselticisiz puromisin direnç kasetinin üst kısmında bulunan bir bağlayıcı alıcı alanı ihtiva eder. AAVS1 lokusundaki PPP1R12C geninin ilk intronu içine doğru entegrasyon üzerine, direnç kaseti düzenlenmiş genin promoterinden ifade edilir. Bu özel AAVS1 tahlil sağlamlığı bize her SSN platformunun etkinliğini karşılaştırmak için izin verir. Sosyal Güvenlik Numaralarını kullanarak Gen düzenleme bozabilir ve / veya teorik herhangi geni değiştirmek için yeteneği verilen güçlüdür. HPSCs bu stratejiyi uygulanması hPSCs daha sonra, nöronlar 26 gibi insan hücre tiplerinin bir çok ayrışmıştır edilebilir, çok yönlü ve çok 27 hepatositlerin ve 28 kardiyomiyositlerin. Buna ek olarak, bir hastada elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımı, bir hastaya özgü genetik temelinde 29 onarım ya da bilinen hastalığa neden olan mutasyonlar devreye girmesine olanak </sup&gt;, Hastalık mekanizmaları ve hastanın kendi hücrelerini kullanarak test 30 terapötikleri araştırmak için bir platform sağlar. Özetle, hPSCs gen düzenleme insan gelişimi ve hastalığın 31 temel biyoloji araştırmak için etkili ve çok yönlü bir yaklaşımdır.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (HI)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Büyüme Faktörü - Temel</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Elektroporasyon küvetleri</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gen pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10 kez; Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH7.4&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri, tıkalı</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz-K</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil Alkol</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Tampon</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Kriyotüpler</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

genom düzenlenmiş İnsan pluripotent kök hücre hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen gönderen

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) Genomu düzenleme insani gelişmeyi anlamak ve hastalığın patofizyolojisi araştırmak için hangi genetik olarak kontrol ve klinik olarak anlamlı bir platform sağlar. Genom düzenleme için siteye özgü nükleazlardır (Sosyal Güvenlik Numaralarını) kullanılarak, bir başka izogenik ortamda belirli genetik değişikliklerin barındıran yeni hPSC hatlarının hızlı türetme mümkün olur. Çinko parmak nükleazlar (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromic tekrarlar (CRISPR) / Cas9 en sık kullanılan SSNs vardır. Bu nükleazlara her böylece bir genomik lokusta kesin gen düzenleme teşvik, belirli bir sahada iki iplikçikli bir DNA kırılmasının katılmasıyla işlev görürler. SSN-meditasyon genom düzenleme ekleme / silme mutasyonlar veya alt tanıtmak ya hücrenin endojen DNA onarım mekanizmaları, homolog olmayan uç (NHEJ) katılmadan ve homoloji yönettiği onarım iki (HDR), sömürençift ​​sarmallı mola yerinde bir homolog onarım şablonu kullanarak genom er. HPSCs Elektroporasyon gibi floresan gazetecilere ve antibiyotik direnç kasetleri olarak transgenlerin dahil Sosyal Güvenlik Numaralarını ve onarım şablonları transfecting etkin bir yoludur. Elektroporasyondan sonra, antibiyotik direnç seçilerek, tamir yapısı dahil yalnızca hPSCs izole etmek mümkündür. Mekanik hPSC koloniler alınır ve genotipleme boyunca hedef yerde uygun bir entegrasyon teyit doğru hedef ve genetik olarak homojen bir hücre hatlarının izolasyonu sağlar. Bu protokolün geçerliliği EGFP ve puromycin direnç insan pluripotent kök hücreleri AAVS1 güvenli liman mahaline içine inşa dahil her üç SSN platformları kullanarak burada gösterilmektedir.

Burada Genetiği hPSC satırları oluşturmak için üç farklı SSN platformları ile uyumlu bir protokol göstermektedir. Biz EGFP muhabiri ve bir puromycin direnç kaset 4 tanıtan bir onarım şablonu kullanarak daha önce yayınlanmış ZFNs 4, Talens 5 ve CRISPR / Cas9s 37 kullanılarak AAVS1 loküsündeki WIBR 3. insan embriyonik kök hücrelerini hedef aldı. Biz farklılaşmamış hPSCs bakım ve genişletme izin veren bir hücre kültürü iş akışı (Şekil 2) için MEF&#39;ler bizim hPSCs kültürlü, o da etkili ve ölçeklenebilir maliyetidir. Hücreler gerekenden daha uzun büyüdüklerinde transfekte pluripotent hücrelerin sayısını ve dolayısıyla elde edilen doğru hedef hPSC koloni sayısını azaltarak, artan farklılaşma riski vardır. Bu electropSSN platformu başına 5.0 x 10 6 hücre orated ve DR4 MEF&#39;lerin tek 6 plaka üzerine her hedef hücreleri kaplı. Seçimden sonra, her platform EGFP-pozitif koloniler (Şekil 3) ve hedefsiz homozigotik ve heterozigotik olarak hedef hedef klonlar (; Tablo 3 Şekil 4A, B) bir kombinasyonu ile sonuçlanmıştır. Burada yer alan şartlar altında, AAVS1 TALENS en EGFP-pozitif klonlar neden olduğunu bulmak. Bu deney için kullanılan onarım şablonu EGFP raportör ve puromisin direnç kasetinin üst kısmında bulunan bir bağlayıcı alıcı alan oluşur. Bu &quot;gen trap&quot; stratejisi (Şekil 1) kullanılarak, yapı puromisin dirençli bir kasetin ekspresyonunu tahrik etmek için endojen promotör ile, AAVS1 lokusunun ilk intronu eklemek gerekir. Ekspresyonu engellemelidir onarım şablonu içinde puromisin direnç geni ekspresyonunu tahrik eden promoterden olmaması<html> rastgele entegrasyon olay. Bu nedenle, tüm puromycin dirençli klonlar AAVS1 sitesinde hedef olacağını bekliyoruz. Bu ancak en PCR stratejileri (Şekil 1, Şekil 4C) ile klonların bir alt kümesi, bir iç probu kullanılarak Southern blot ile tespit edilebilir AAVS1 lokusunda olarak anormal entegrasyonlar taşıdığına işaret edilmelidir 4. Bu entegrasyon olaylar büyük olasılıkla donör plazmid 4 çoklu entegrasyonlar yol açan heterolog hedef olayların sonucudur. Her SSN deneyinden 24 koloniler aldı ve tüm platformlar çok yüksek hedefleme verimliliği vardı ve sadece çok az farklılıklar gösterdiğini gördük. PCR tarafından sorguya gibi TALEN platformu en homozigotik hedeflenen klonlar (Tablo 3) varken, CRISPR / Cas9 en doğru hedeflenmiş klonları elde edilmiştir. /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Gen Şekil 1. şematik AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu. Dan Hockemeyer ve ark. Modifiye kullanarak AAVS1 lokusunu düzenlenmiş, 2009. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> WIBR 3. hücrelerinin Şekil 2. kolonileri. 3 insan embriyonik kök hücreleri önce hedeflemesine WIBR # kolonileri Temsilcisi parlak bir alan görüntüler. Farklılaşma eksikliği ve ideal olmayan bir (sağ) farklı olarak ideal bir kolonisi (solda) besleyici tabakadan net bir ayrım unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3. EGFP-pozitif WIBR 3. hücreleri. WIBR # AAVS1 mahalinde bir EGFP-ifade onarım şablonu ile hedeflenen 3 hücrelerinin Temsilcisi görüntüler. ZFNs düzenlenmiş temsilci kolonilerin Görüntüler, Talens ve CRISPR / Cas9 gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4. Genotipleme stratejileri doğru hedefleme onaylayın. (A) Üç SSN platformlarda, hedefsiz heterozigot ve homozigot hedeflenen klonlar gösteren Temsilcisi PCR genotipleme sonuçları. WT CTL yabani tip kontrolü =. (B) Repreheterozigot hedeflenen klon ve 3 &#39;dış prob ile tespit edilen bir homozigot hedeflenen klon gösteren silci Southern blot sonuçları. Fragment boyutları: WT-6.5 kb, Düzenlendi-6.9 kb. (C), uygun şekilde düzenlenmiş bir klon ve rastlantısal olmayan çift entegrasyonu ile heterozigot klon gösteren Örnek Southern blot sonuçları. Fragment boyutları:. Düzgün düzenlenmiş-6.9 kb, anormal ek entegrasyon-5 kb <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Çalışma </td><td> Gen hedefli </td><td> Platform </td><td> Onarım şablon türü </td><td> Klonların # aldı </td><td> Hedefleme verimliliği </td></tr><tr><td> Sexton ve diğ., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td&gt; <td> bildirilmemiş </td><td> bildirilmemiş </td></tr><tr><td> Sexton ve diğ., 2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td> Higromisin </td><td> bildirilmemiş </td><td> bildirilmemiş </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39.0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> % 14,9 </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> % 91.0 </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2011 </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> % 13,0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 139 </td><td> % 94.0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ. &lt;/ em&gt;, 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 30 </td><td> % 93.0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ., 2015 </td><td> Hcrt </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 154 </td><td> % 92.0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 11 </td><td> % 45.0 </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> bildirilmemiş </td><td> % 30.0 </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> bildirilmemiş </td><td> % 14.0 </td></tr><tr><td> Soldner ve diğ., 2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> % 1.0 </td></tr></tbody></table> Tablo diğer genlerin 1. Tanım Corre olan bu yöntem kullanılarak hedeflenensponding daha önce yayınlanmış çalışmalar alınan verim hedefleme. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Locus </td><td> Sekans </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> AAVS1-F astar </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> PCR koşulları: Tm = 57 ° C, 35 döngü </td></tr><tr><td> AAVS1-WT-R primer </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> WT bandı: 1273 bp </td></tr><tr><td> AAVS1 Hedefli-R astar </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> Hedeflenen bant: 992 bp </td></tr><tr><td> T2-Cas9-rehber </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> Mali ve diğ., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN Sağ </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-Sol </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN Sağ </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2011 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-Sol </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2011 </td></tr></tbody></table> Astar ve SSN hedef dizilerin Tablo 2. listesi. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Konstrukt Hedefleme </td><td> EGFP + Kolonileri sayısı </td><td> Hedeflenen aldı klonlar (PCR doğrulanmadı) </td><td> (Güney blot) Önceki Bildiren Doğru Hedefleme Verimliliği </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> % 86.9 (% 73.9 het /% 13,0 homo) </td><td> % 56 (% 50 het /% 6 homo) </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> % 91.3 (% 47.8 het /% 39,1 homo) </td><td> % 47 (% 37.5 het /% 9,3 homo) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> % 95.7 (% 69.5 het / 2% 6,3 homo) </td><td> bildirilmemiş </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Karşılaştırmalı EGFP-pozitif sayılar ve Talen, ZFN hedeflenmiş ve CRISPR / Cas9 insan kök hücre kolonileri. PCR önceki deneylerde 4,5 uygun tek entegrasyonlar doğrulanmış Güney lekesi ile karşılaştırıldığında bu deney için AAVS1 loküsündeki entegrasyonlar doğrulandı.

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Bu prosedürün genel amacı, modern genom düzenleme teknolojisini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini genetik olarak modifiye etmektir. Bu prosedür kök hücre biyolojisine dair içgörü sağlayabildiği gibi, genetik olarak tanımlanmış bir ortamda insan hastalıklarının modellenmesini kolaylaştırmak için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişilerin, uzmanlaşmadan önce koloni izolasyonu konusunda pratik yapmaları gerekecektir.Kolonilerin tanımlanması ve seçilmesi zor olabildiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi esastır. İşleme, insan pluripotent kök hücrelerini, mitomisin C ile inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları veya jelatin üzerinde büyütülmüş MEF feeder hücreleri içeren altı kuyucuklu bir plakada, hESC medyumu içerisinde kültüre ederek başlayın. Ekimi takip eden her gün, hPSC'ler %50 konfluense ulaşana kadar, medyumun tüm hacmini uzaklaştırmak için bir cam pipet ve vakum kullanın.Kuyu başına üç mililitre ılık hESC medyumu ile değiştirin. Hedeflemeden bir gün önce, hESC medyumunu uzaklaştırın ve 10 micromolar Y-27632 ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış taze hESC medyumu ekleyin. Ayrıca, DR4 farelerinden elde edilmiş bir ila iki adet altı kuyucuklu plak şeklinde ilaç dirençli MEF feeder hücreleri hazırlayın.Hedefleme gününde, beş mikrogram Zinc finger nuclease ekspresyon plazmidi 1 ve 2, TALON 1 ve 2 ekspresyon plazmidi veya 15 mikrogram CRISPR cas9 px330 kodlayan plazmidi 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyerek transveksiyon çözeltilerini hazırlayın. 30 mikrogram onarıcı donör plazmidi ekleyin ve ardından hacmi 300 mikrolitreye tamamlayacak kadar 1x fosfat tamponlu salin ekleyin. %50 konfluens sağlandığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin.Ardından, hPFC'lerin bulunduğu plakadan medyumu uzaklaştırmak için cam pipet ve vakum kullanın, ardından hücreleri 2 milliliters ılık 1x PBS ile yıkayın. PBS'i aspire ettikten sonra, hücrelerin üzerine doğrudan 0,5 milliters 0.25% Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Besleyici tabaka plakadan ayrılmaya başlayana kadar veya yaklaşık 10 dakika boyunca doku kültürü inkübatöründe bekletin.İnkübasyonun ardından, Trypsin reaksiyonunu durdurmak için her kuyucuğa iki mililitre ılık ES yıkama medyası ekleyin. Besleyici hücrelerin bir tabaka halinde ayrıldığından emin olarak, her kuyucuktaki hücreleri toplayın. Her kuyucuğun içeriğini tek bir 50 mililitrelik konik tüpe pipetleyerek tüm kuyucukları birleştirin ve hücreleri 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak tritüre edin.Hücre süspansiyonunu 40 mililitreye tamamlamak için ES yıkama medyası ekleyin. Büyük feeder parçalarının tüpün dibine çökmesi için bir ila iki dakika bekleyin, ardından süpernatantı serolojik bir pipet kullanarak alın ve taze bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 190 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.Hücreleri 500 µL 1x PBS içinde yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen hücreleri, daha önce hazırlanan plazmid transfeksiyon solüsyonu ile birleştirin. Hücreleri ve transfeksiyon karışımını dört mm'lik bir elektroporasyon küvetine pipetleyin ve üç ila beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Elektroporasyon sistemindeki eksponansiyel program parametrelerini 250 volt, 500 microfarad, sonsuz direnç ve dört milimetre küvet boyutu olarak ayarlayın. Hücreleri elektropore edin ve ardından küveti üç dakika boyunca tekrar buz üzerine yerleştirin. Elektropore edilen hücreleri, 10 micromolar Y-27632 ile desteklenmiş 18 mililitre ılık hESC besiyerinde yeniden süspande edin.DR4 MEF'lerini mikroskop altında inceleyin. Tek hücre süspansiyonunun üç mililitresini, DR4 feeder hücreleri içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin ve inkübatöre geri yerleştirin. Ekimden sonraki üçüncü günde, hücrelerin üzerindeki besiyerini Y-27632 içermeyen hESC besiyeri ile değiştirin.Dördüncü günde, takviye edilmemiş besiyeri, uygun seleksiyon antibiyotiği içeren besiyeri ile değiştirilir. Burada Puromycin kullanılmıştır. Koloni seçiminden bir gün önce, seçilecek her koloni için bir adet 12 kuyucuklu MEF feeder hücresi plakası hazırlanır.Ekimden 12 gün sonra, plakayı bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Toplanmaya hazır olan 800 ila 1.200 mikron çapındaki kolonileri belirleyin. Bu kolonilerin, burada gösterilen örnekteki gibi farklılaşmaya başlayan hücreler içermediğinden emin olun.Ayrıca, hücrelerin GFP eksprese ettiğinden emin olun. Toplama gününde, MEF'lerin sağlıklı olduğundan emin olmak için onları mikroskop altında inceleyin. MEF feeder hücre plakalarındaki tüm medyumu boşaltın ve yerine bir mililitre hESC medyumu ekleyin.Ayrıca, koloni seçimi yapılacak olan altı kuyucuklu hPSC plakalarındaki hESC besiyerini değiştirin. Ardından, kolonileri seçmek için cam pipetler hazırlayın. Kolonileri seçmek için, öncelikle hPFC plakasını doku kültürü kabinindeki diseksiyon mikroskobunun tablasına yerleştirin ve cam pipetin ucunu vakum ampulüne takarak seçim düzeneğini kurun.Seçilecek koloni belirlenir ve çekilmiş cam pipetin ucu koloninin üzerine yerleştirilir. Ardından, tek bir koloniyi nazikçe çıkarmak ve 10 ila 20 eşit büyüklükte parçaya bölmek için toplama cihazının pompası sıkıştırılır. Son olarak, pompa serbest bırakılarak çıkarılan koloni parçaları pipetin içine çekilir.Transfer işlemi sırasında mümkün olduğunca az besiyeri almaya çalışın. Artık parçalanmış olan koloniyi, bir 12 kuyucuklu MEF besleyici hücre plağının tek bir kuyucuğuna doğrudan aktarmak için bulbu sıkın. Tek hücre türevli klonların benzersiz şekilde tanımlanabilmesi için her kuyucuğu etiketleyin.Cam pipeti değiştirin ve prosedürü bir sonraki koloni için tekrarlayın. Plakaları inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin kuyucuk içinde dağılması için plakaları nazikçe sallayın. Ertesi gün, medyanın tamamını boşaltın ve yerine 1,5 mL ılık hESC medyası ekleyin.Hücreler %50 konfluens düzeyine ulaşana kadar bu işlemi 10 ila 12 gün boyunca tekrarlayın. 10 ila 12 gün sonra, hESC'leri mikroskop altında inceleyin. Her kuyucuktan bir veya iki koloni seçin ve replika plaka oluşturmak için yeni 12 kuyucuklu MEF feeder hücre plakalarına aktarın.PCR veya southern blot ile genotipleme yapmak için orijinal plakaların her kuyusunda kalan kolonilerden DNA ekstrakte edin. Weber Üç insan embriyonik kök hücresi, bir EFFP raporlayıcısı ve bir puromisin direnç kaseti yerleştirmek amacıyla bölgeye özgü nükleazlar ve bir onarım şablonu kullanılarak AAVS1 lokusunda hedeflenmiştir. Bu temsili görüntüler; çinko parmak nükleazları, TALEN'ler ve CRISPR/Cas9 ile düzenlenen kolonileri göstermektedir.Bu temsili PCR genotipleme sonuçları; çinko parmak nükleazları, TALEN'ler ve CRISPR/Cas9 kullanılarak elde edilen hedeflenmemiş, heterozigot ve homozigot hedeflenmiş klonları, yaban tip kontrolü ile birlikte göstermektedir. Bu tablo, bu deneydeki her bir bölgeye özgü nükleaz için AAVS1 lokusundaki PCR ile doğrulanmış entegrasyonları, önceki deneylerde Southern Blot ile doğrulanmış uygun tekli entegrasyonlarla karşılaştırmalı olarak sunmaktadır. En fazla doğru hedeflenmiş klonu CRISPR-Cas9 sağlarken, TALEN platformu en fazla homozigot hedeflenmiş klona sahip olmuştur.Bu teknik uzmanlaşıldığında, yaklaşık üç ila beş saatlik bir aktif çalışma süresi gerektirir ve deneylere başladıktan sonra yaklaşık üç hafta içinde düzenlenmiş hücreler elde edebilirsiniz. Bu teknikte güvenli çalışmak ve her zaman steril teknikler kullanmak gerçekten önemlidir. Genetik manipülasyonun ardından, kök hücrelerin nöronlar gibi diğer hücre tiplerine farklılaştırılmasını kullanarak, işlemin diğer hücre türlerini nasıl etkilediğini gözlemleyebilirsiniz.Bu protokolün geliştirilmesi, araştırmacıların in vitro hastalık modelleri kurmak amacıyla insan pluripotent kök hücrelerinde genom düzenleme yöntemini kullanmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinde genom düzenlemenin nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil<em&gt; AAVS1</em&gt; Odağı

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Burada açıklanan endogenously etiketleme için bir protokol proteinler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler CRISPR/Cas9 kullanarak floresan etiketleri ile ifade olmasıdır. Putatively düzenlenen hücreleri hücre aktif floresans sıralayarak zenginleştirilmiş ve klonal hücre satırları oluşturulur.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinde genom düzenleme yöntemini. Elektroporasyon ve koloni izolasyonu ile AAVS1 lokusunu hedefleyerek EGFP ekspresyonu ve antibiyotik direnci kazandırma tekniğini öğrenin.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Daha fazla video keşfet