Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Bu prosedürün genel amacı, modern genom düzenleme teknolojisini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini genetik olarak tasarlamaktır. Bu prosedür kök hücre biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, genetik olarak tanımlanmış bir ortamda insan hastalık modellemesini kolaylaştırmak için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireylerin, yetkin hale gelmeden önce kolonileri izole etme pratiği yapmaları gerekecektir.

Kolonilerin tanımlanması ve toplanması zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir. Mitomisin C ile inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları veya jelatin üzerinde büyütülen MEF besleyici hücreleri içeren altı oyuklu bir plaka üzerinde hESC ortamında insan pluripotent kök hücrelerini kültürleyerek başlayın. Kaplamadan sonraki her gün, hPSC'ler %50 birleşime ulaşana kadar, tüm ortam hacmini çıkarmak için bir cam pipet ve vakum kullanın.

Oyuk başına üç mililitre ılık hESC ortamı ile değiştirin. Hedeflemeden bir gün önce, hESC ortamını çıkarın ve 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış yeni hESC ortamını ekleyin. Ayrıca, DR4 farelerinden bir ila iki altı oyuklu ilaca dirençli MEF besleyici hücre plakası hazırlayın.

Hedefleme gününde, beş mikrogram Çinko parmak nükleaz ekspresyon plazmidi 1 ve 2, TALON 1 ve 2 ekspresyon plazmidi veya 15 mikrogram CRISPR cas9 px330 kodlama plazmidini bir nokta beş mililitrelik bir tüpe pipetleyerek transveksiyon solüsyonlarını hazırlayın. Onarılmış donör plazmidinden 30 mikrogram ekleyin, ardından hacmi 300 mikrolitreye getirmek için yeterli miktarda 1x fosfat tamponlu salin ekleyin. % 50 birleşme sağlamak için hücreleri mikroskop altında inceleyin.

Daha sonra, ortamı hPFC plakasından çıkarmak için bir cam pipet ve vakum kullanın, ardından hücreleri 2 mililitre ılık 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, sıfır nokta beş militer% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisini doğrudan hücrelere ekleyin. Doku kültürü inkübatörüne yaklaşık 10 dakika veya besleyici tabaka plakadan kalkmaya başlayana kadar yerleştirin.

İnkübasyonun ardından, Tripsin reaksiyonunu durdurmak için her bir oyuğa iki mililitre ılık ES yıkama ortamı ekleyin. Hücreleri her kuyucuktan toplayın ve besleyici hücrelerin bir tabaka halinde çıkmasını sağlayın. Her bir oyuğun içeriğini tek bir 50 mililitrelik konik tüpe pipetleyin, tüm oyukları birleştirin ve hücreleri 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak ezin.

Hücre süspansiyonunu 40 mililitreye getirmek için ES yıkama ortamı ekleyin. Büyük besleyici parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için bir ila iki dakika bekleyin, ardından serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe bırakın. Hücre süspansiyonunu 190 kez g'de beş dakika santrifüjledikten sonra, hücre paletini bozmadan süpernatanı aspire edin.

Hücreleri 500 mikrolitre 1x pbs'de yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri daha önce hazırlanan plazma transeksiyon çözeltisi ile birleştirin. Hücreleri ve transfeksiyon karışımını dört milimetrelik bir elektroporasyon küvetine pipetleyin ve üç ila beş dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Elektroporasyon sistemindeki üstel programın parametrelerini 250 volt, 500 mikrofarad, sonsuz direnç ve dört milimetre küvet boyutuna ayarlayın. Hücreleri elektrostatik hale getirin ve ardından küveti üç dakika boyunca tekrar buzun üzerine yerleştirin. Elektroporasyonlu hücreleri, 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş 18 mililitre ılık hESC ortamında yeniden süspanse edin.

DR4 MEF'leri mikroskop altında inceleyin. Tek hücre süspansiyonunun üç mililitresini, DR4 besleyici hücreleri içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin ve inkübatöre geri dönün. Kaplamadan sonraki üçüncü günde, hücrelerdeki hESC ortamındaki ortamı Y-27632 olmadan değiştirin.

Dördüncü günde, takviye edilmemiş ortamı uygun seçim antibiyotiği içeren ortamla değiştirin. Puromycin burada kullanılır. Koloni toplamadan bir gün önce, toplanacak her koloni için 12 oyuklu bir MEF besleyici hücre plakası hazırlayın.

Kaplamadan sonraki 12. günde, plakayı diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Toplanmaya hazır 800 ila 1.200 mikron çapındaki kolonileri tanımlayın. Bu kolonilerin, burada gösterildiği gibi farklılaşmaya başlayan hücreler içermediğinden emin olun.

Ayrıca, hücrelerin GFP'yi ifade ettiğinden emin olun. Toplama gününde, sağlıklı olduklarından emin olmak için MEF'leri mikroskop altında inceleyin. MEF besleyici hücre plakalarından tüm ortamı çıkarın ve bir mililitre hESC ortamıyla değiştirin.

Ayrıca, toplanacak olan altı kuyulu hPSC plakalarındaki hESC ortamını değiştirin. Ardından, kolonileri toplamak için cam pipetleri çekin. Kolonileri koparmak için önce plaka hPFC'lerini doku kültürü başlığındaki diseksiyon mikroskobunun sahnesine yerleştirin, cam pipet ucunu emme ampulüne yerleştirerek toplama cihazını monte edin.

Toplanacak koloniyi belirleyin ve çekilen cam pipetin ucunu koloninin üzerine yerleştirin. Ardından, toplama cihazının ampulünü nazikçe eksize etmek ve tek tek koloniyi 10 ila 20 eşit büyüklükte parçaya kesmek için sıkıştırın. Ardından, ampulü serbest bırakarak eksize edilen koloni parçalarını pipete çekin.

Aktarım sırasında mümkün olduğunca az medya almaya çalışın. Şimdi kırılmış koloniyi doğrudan 12 oyuklu bir MEF besleyici hücre plakasının bir kuyusuna aktarmak için ampulü sıkıştırın. Tek hücreden türetilmiş klonların benzersiz bir şekilde tanımlanmasına izin vermek için her bir kuyuyu etiketleyin.

Cam pipeti değiştirin ve bir sonraki koloni için prosedürü tekrarlayın. Plakaları inkübatöre geri koyun ve hücreleri kuyuya dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın. Ertesi gün, ortamın tamamını çıkarın ve bir nokta beş mililitre ılık hESC ortamıyla değiştirin.

Hücreler %50 birleşene kadar 10 ila 12 gün boyunca tekrarlayın. 10 ila 12 gün sonra, kapsam altındaki hESC'leri inceleyin. Her kuyucuktan bir ila iki koloni seçin ve bir replika plaka oluşturmak için yeni 12 oyuklu MEF besleyici hücre plakalarına aktarın.

PCR veya güney blot ile genotipleme için orijinal plakaların her bir oyuğunda kalan kolonilerden DNA'yı çıkarın. Weber: Üç insan embriyonik kök hücresi, bir EFFP raportörü ve bir puromisin direnç kaseti tanıtmak için bölgeye özgü nükleazlar ve bir onarım şablonu kullanılarak AAVS1 lokusunda hedeflendi. Bu temsili görüntüler, çinko parmak nükleazları, TALEN'ler ve CRISPR/Cas9 ile düzenlenmiş kolonileri göstermektedir.

Bu temsili PCR genotipleme sonuçları, vahşi tip kontrolün yanı sıra çinko parmak nükleazları, TALEN'ler ve CRISPR/Cas9 kullanan hedeflenmemiş, heterozigot ve homozigot hedefli klonları göstermektedir. Bu tablo, önceki deneylerde Southern Blot tarafından doğrulanmış uygun tekli entegrasyonlarla karşılaştırıldığında, bu deneydeki her bir bölgeye özgü nükleaz için AAVS1 lokusundaki PCR doğrulanmış entegrasyonları göstermektedir. CRISPR-Cas9 en doğru hedeflenen klonları verirken, TALEN platformu en homojen şekilde hedeflenen klonlara sahipti.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık üç ila beş saatlik uygulamalı zaman alır ve deneylere başladıktan yaklaşık üç hafta sonra düzenlenmiş hücreler elde edebilirsiniz. Bu teknikle güvenli bir şekilde çalışmak ve her zaman steril teknik kullanmak gerçekten önemlidir. Genetik manipülasyonu takiben, nöronlar gibi diğer hücre tiplerine kök hücre farklılaşmasını kullanarak diğer hücre tiplerini nasıl etkilediğini görebilirsiniz.

Bu protokolün geliştirilmesi, araştırmacıların in vitro hastalık modelleri oluşturmak için insan pluripotent kök hücrelerinde genom düzenlemeyi kullanmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinde genom düzenlemenin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.