Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Bu görüntüleme protokolünün genel amacı, iltihaplı ciltte CD4 pozitif T Hücre dinamiklerini görselleştirmektir. Bu yöntem, immünoloji alanında, immün hücre motilitesinin altında yatan mekanizmalar ve iltihaplı dokularda işlev gören mekanizmalar gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, CD4 T hücresi dinamik davranışını In Situ incelemek için minimal invaziv bir yol sağlamasıdır.

Kulağı görüntülemeye hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve yüksek kaliteli görüntüler yakalamak için kulağın uygun şekilde konumlandırılması gerektiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir. Ben Alison Gaylo, bir yüksek lisans öğrencisiyim ve bu protokolün tanıtımını yapacağım. Fare başına 300 mikrolitre floresan etiketli efektör T hücresi süspansiyonunu 27 buçuk gauge iğne ile donatılmış bir şırıngaya aspire ederek başlayın.

Ardından şırınga iğnesi tarafı yukarı çevirin ve şırınganın şaftını hafifçe vurun, kabarcıkları gidermek için pistonu gerektiği gibi yukarı ve aşağı hareket ettirin. Hücreler hazır olduğunda, fareleri temiz bir kafese aktarın ve kuyruk damarları damar genişleyene kadar bir ısı lambasının altına yerleştirin. Ardından ilk fareyi kısıtlayıcıya aktarın ve kuyruğu alkollü bir bezle silin.

Yanal bir kuyruk damarı belirledikten sonra, damara yavaşça 200 mikrolitre hücre enjekte edin. Tüm hücreler aktarıldığında, 50 mikrolitre tam floresan emülsiyonu 28 buçuk gauge insülsin şırıngasına çekin ve büyük hava kabarcıklarını gidermek için pistona sıkıca bastırın. Ardından sol işaret parmağına bir yüksük yerleştirin ve farenin kulağını ventral kulak yukarı bakacak şekilde sol başparmak ile yüksük arasında dikkatlice kavrayın.

Daha sonra iğneyi, eğimli tarafı yukarı, kulak kepçesinin dış üçte birlik kısmındaki dermise ve merkezden hafifçe uzağa kaydırın ve dokuya yavaşça on mikrolitre emülsiyon enjekte edin. Tüm hayvanları enjekte ettikten sonra, fareleri tamamen iyileşene kadar izleyin. Aşılamadan üç gün sonra, enjekte edilen hayvanların kuyruk damarlarını az önce gösterildiği gibi vazodilate edin.

Anestezi uygulandıktan sonra, ilk farenin kuyruğunu bir çift forseps ile hareketsiz hale getirin. Kuyruğu alkollü bir çubukla silin, ardından 30 buçuk gauge iğneli bir kateteri dikkatlice yanal kuyruk damarına kaydırın ve şırınga pistonuna hafif bir baskı uygulayarak açıklığı kontrol edin. Kateter yerleştirildiğinde, enjeksiyon bölgesine bir ila iki damla siyanoakrilat doku yapıştırıcısı uygulayın ve yapıştırıcının yaklaşık 30 saniye kurumasını bekleyin.

Ardından bıyıkları ve saçları kulağın arkasından ve yanlarından dikkatlice kesmek için makas kullanın. Ardından, kulağın iç yüzeyini PBS ile nemlendirmek için pamuklu çubuk kullanın. Ardından fareyi döndürün ve enjekte edilen kulağı camla aynı hizaya gelene kadar 24 x 50 milimetre numaralı bir nokta beş cam kapak kızağı üzerine düzleştirin.

Fazla PBS'yi kurulayın. Ardından, yaklaşık 20 milimetre uzunluğundaki bir kumaş bant parçasını üst köşelerden uzunlamasına kavramak için iki çift kavisli forseps kullanın ve bandın alt kısmını farenin kulağının üst kısmındaki kapak kayışına yerleştirin. Bandı kulağın geri kalanının üzerine yuvarlayın, fazla kılı gerektiği gibi forsepslerle yoldan itin ve kulağın kendisine bastırmamaya dikkat ederek sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için bandı kulağın etrafına hafifçe bastırmak için kuru bir pamuklu çubuk kullanın.

Kulağın, elde edilebilecek görüntülerin kalitesini etkileyeceğinden, her iki tarafta iyi bir sızdırmazlık ve minimum hava kabarcığı ile kapak kızağına düzgün bir şekilde bantlanması önemlidir. Şimdi bir floresan mikroskop görüntüleme platformunu 37 santigrat derecelik bir ısıtma bloğuna bantlayın ve platformun kulak bölgesinin her iki tarafına vakumlu gres sürün. Kapak kızağını platforma yerleştirmek için fareyi döndürün ve kulağı keçenin ortasına hizalamaya dikkat edin.

Kulak yerindeyken, izofluran burun konisini platformdaki tutucuya oturtun, koninin sağlam olduğundan ve farenin burnunu tamamen kapladığından emin olun. Ardından, kapak kızağını sıkıca ama dikkatli bir şekilde görüntüleme platformuna bastırmak için bir pamuklu çubuk kullanın ve vakum yağını kapak mendilinin altına yayın. Kapak fişini platforma sabitlemek için platformun üst kısmının etrafına iki adet 20 milimetrelik parça ve iki adet daha uzun bant sarın.

Ardından, fareyi mikroskop aşamasına getirin. Platformu daha fazla bantla sabitleyin ve kulağın etrafındaki kapak kızağına çift kat vakumlu gres sıkın. Ardından farenin etrafına su dolu bir ısıtma battaniyesi sarın ve vakumlu yağ haznesini 37 santigrat derece damıtılmış su ile doldurun.

In Vivo zaman atlamalı görüntüleme için, objektifi kulağın merkezinin üzerine yerleştirerek başlayın ve objektifi rezervuardaki suyun yüzeyine temas edene kadar indirin. Ardından, harici bir ışık kaynağı kullanarak, kulağın yüzeyi netleşene kadar hedefi yavaşça indirin. Ardından, mikroskop aşamasının etrafındaki iç ve dış perdeleri indirin ve lazer dalga uzunluğunu MP lazer denetleyici penceresinde 900 nanometreye, edinme ayarı lazer penceresindeki lazer gücüne ve görüntü elde etme kontrol penceresindeki PMT voltajlarına ayarlayın.

Çekim ayarı boyutu ve modu pencerelerinde, mikroskobu piksel başına iki mikrosaniye bekleme süresi ile beş on iki x beş on iki piksel çözünürlüğe ayarlayın ve dokuyu taramak için canlı bir görüntüleme modunu etkinleştirmek için XY tekrarını seçin. Uygun bir görüntüleme alanı bulunduktan sonra, dermisteki en yüksek hücreyi bulun ve Z konumunu sıfıra ayarlamak için sıfır ayarla düğmesine tıklayın. Hücre derinliğinin kapsamını ölçmek için Z yönünde aşağı kaydırın.

Ardından, çekim ayarı mikroskobu penceresinde başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın ve görüntüleme alanının derinliği boyunca hücrelerin görselleştirilmesini optimize etmek için parlak Z penceresinde cihaz PMT voltajlarını ve lazer gücünü ayarlayın. Derinlik ve zaman düğmelerini kontrol edin ve görüntü edinme denetimi filtre modu penceresinde görüntüyü satır başına üç kez taramak için ortak bir filtre ayarlayın. Görüntü alma mikroskobu penceresindeki Z dilim derinliğini, zaman görünümü penceresinde belirtildiği gibi tam bir yığını yakalamak yaklaşık bir dakika sürecek şekilde ayarlayın.

Ardından, dokunun stabilitesini değerlendirmek için, edinme ayarı zaman tarama penceresinde tekrar sayısını beşe ayarlayın ve alanın beş dakikalık hızlandırılmış görüntüsünü yakalamak için tarama düğmesine tıklayın. Doku beş dakika sonra stabilse, çekim ayarı zaman tarama penceresinde tekrar sayısını 30 ile 45 arasında ayarlayın ve görüntü toplanırken herhangi bir küçük doku kaymasını izleyerek 30 ila 45 dakikalık hızlandırılmış bir görüntü toplayın. Ön antikor görüntüsünü uygun formatta kaydedin ve ardından antikor karışımını bir mililitrelik tüberkülin şırıngasına çekin ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmaya dikkat edin.

Antikor çözeltisi iğnenin ucunda bir damlacık oluşturacak şekilde pistonu hafifçe bastırın ve kateteri bulmak için sahnenin etrafındaki perdeleri kaldırın. PBS şırıngasını antikor şırıngası ile değiştirin ve ardından antikorları yavaşça katetere enjekte edin. Antikorlar başarılı bir şekilde enjekte edildiğinde, perdeleri tekrar indirin ve enjeksiyon zamanını not edin.

Ardından, aynı yerde, ön antikor görüntüsüyle aynı cihaz ayarlarını kullanarak hemen 20 ila 40 dakikalık yeni bir görüntüleme dizisi toplamaya başlayın. Son olarak, antikor sonrası görüntü dosyasını uygun formatta kaydedin ve fareyi mikroskop aşamasından dikkatlice çıkarın, hayvanı tamamen iyileşene kadar izleyin. Bu protokol ile sağlam kulak dermisinin görüntülenmesi, iltihaplı dermiste efektör T hücre dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ve hızlandırılmış görüntülerinin elde edilmesini kolaylaştırır.

Bu filmde, yeşil evlat edinerek transfer edilen efektör T hücrelerinin dermal doku boyunca hareket ettiği gözlemlenebilir. Bununla birlikte, antibeta bir ve antibeta üç entogrin bloke edici antikorların kateter yoluyla uygulanmasından sonra, daha önce hareketli olan hücreler dermis içinde durur. Hücreler, antikor uygulamasından sonra azalmış bir ortalama hızın yanı sıra kıvrımlı indekslerinde önemli bir azalma sergiler.

Yani, toplam yer değiştirmenin toplam yol uzunluğuna oranı. Saç foliküllerinden elde edilen otofloresanlar, üstteki saçlardan gelen gölgeleme ve otofloresanlar ve kulak yüzeyi ile kapak kayması arasında sıkışan hava kabarcıkları, T hücrelerinin görselleştirilmesini engelleyen ve otomatik görüntü analiz yazılımına müdahale eden görüntüleme artefaktlarına yol açabilir. Ek olarak, birden fazla ısı kaynağının kullanılması doku stabilitesi sorunlarına neden olabilir ve bu da görüntüleme sırasında sonuçların yorumlanmasını zorlaştıran büyük salınımlara yol açabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, prosedür doğru bir şekilde gerçekleştirilmişse, dermisteki CD4 T hücrelerinin görüntülenmesi iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, farelerle çalışmak için uygun hayvan bakımı ve kullanım yönergelerini takip etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedür, farklı enfekte modelleri veya iltihabı indüklemek için farklı yöntemler kullanarak kulaktaki diğer T hücresi alt kümelerini veya bağışıklık hücresi tiplerini görselleştirmek için uyarlanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, intravital görüntüleme, immünoloji alanındaki araştırmacıların, canlı hayvanlarda devam eden bağışıklık tepkilerinin dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Çoklu fosforlu lazerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun koruma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare kulağı dermisinde iltihaplanmanın nasıl indükleneceğini, antikor uygulamasından önce ve sonra CD4 T hücre aktivitesinin hızlandırılmış görüntülerini yakalamak için intravital görüntülemenin nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.