Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Bu görüntüleme protokolünün genel amacı, iltihaplanmış deride CD4 pozitif T hücresi dinamiklerini görselleştirmektir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki temel soruların, örneğin iltihaplanmış dokularda immün hücre hareketliliğinin ve işlevinin temelinde yatan mekanizmaların neler olduğu gibi soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, CD4 T hücresi dinamik davranışlarını In Situ olarak incelemek için minimal invaziv bir yol sunmasıdır.

Kulağı görüntülemeye hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu ve yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için kulağın doğru şekilde konumlandırılması gerektiği için, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Ben lisansüstü öğrencisi Alison Gaylo ve bu protokolün gösterimini gerçekleştireceğim. Fare başına 300 µL floresan işaretli efektör T hücresi süspansiyonunu, 27,5 gauge iğne takılmış bir şırıngaya çekerek başlayın.

Ardından şırınga iğnesi yukarı bakacak şekilde tutun ve hava kabarcıklarını gidermek için gerekirse pistonu yukarı aşağı hareket ettirerek şırınganın gövdesine nazikçe vurun. Hücreler hazır olduğunda, fareleri temiz bir kafese aktarın ve kuyruk venleri genişleyene kadar bir ısı lambasının altına yerleştirin. Daha sonra ilk fareyi sabitleyiciye aktarın ve kuyruğu alkollü bir pamukla silin.

Lateral kauda veni belirledikten sonra, ven içine yavaşça 200 µL hücre enjekte edin. Tüm hücreler aktarıldığında, 28,5 gauge bir insülin şırıngasına 50 µL komplet floresan emülsiyon çekin ve büyük hava kabarcıklarını gidermek için pistonu sıkıca bastırın. Ardından sol işaret parmağına bir parmak uçluğu takın ve farenin kulağını, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sol başparmak ve parmak uçluğu arasında dikkatlice tutun.

Ardından iğneyi, eğimli tarafı yukarı gelecek şekilde, pinna'nın dış üçte birlik kısmındaki dermise, merkezden hafifçe uzağa kaydırın ve doku içine yavaşça on µL emülsiyon enjekte edin. Tüm hayvanlara enjeksiyon yapıldıktan sonra, fareleri tamamen iyileşene kadar gözlemleyin. İmmünizasyondan üç gün sonra, enjekte edilen hayvanların kuyruk venlerini az önce gösterildiği gibi vazodilate edin.

Anestezi uyguladıktan sonra, ilk farenin kuyruğunu bir penset yardımıyla sabitleyin. Kuyruğu alkollü bir pamukla silin, ardından 30,5 gauge ölçüsünde bir iğne kateterini dikkatlice lateral kuyruk venine yerleştirin ve şırınga pistonuna hafifçe bastırarak açıklığı kontrol edin. Kateter yerleştiğinde, enjeksiyon bölgesine bir ila iki damla siyanoakrilat doku yapıştırıcısı uygulayın ve yapıştırıcının yaklaşık 30 saniye boyunca kurumasını bekleyin.

Ardından, bıyıkları ve kulağın arka ile yan kısımlarındaki tüyleri bir makas yardımıyla dikkatlice kırpatın. Sonra, kulağın iç yüzeyini PBS ile nemlendirmek için bir pamuklu çubuk kullanın. Ardından fareyi döndürün ve enjekte edilen kulağı, camla tamamen temas edene kadar 24 by 50 milimetre boyutundaki 1,5 numaralı bir cam lamel üzerine düzleştirerek yerleştirin.

Fazla PBS'yi kurulayın. Ardından, iki çift kavisli pens kullanarak yaklaşık 20 milimetre uzunluğundaki kumaş bandı üst köşelerinden boylamasına tutun ve bandın alt kısmını farenin kulağının üstündeki lam üzerine yerleştirin. Bandı kulağın geri kalanı boyunca yuvarlayın, gerektiğinde pens ile fazla tüyleri kenara itin ve bandın kulağı sıkıca sardığından emin olmak için kuru bir pamuklu çubukla kulağın çevresine nazikçe bastırın; bu sırada kulağın kendisine baskı yapmamaya dikkat edin.

Her iki tarafın iyi mühürlenmesi ve hava kabarcıklarının minimum düzeyde olması için kulağın lamıla düzgün şekilde bantlanması esastır, çünkü bu durum elde edilebilecek görüntülerin kalitesini etkileyecektir. Şimdi bir floresan mikroskop görüntüleme platformunu 37 derece Celsius ısıtma bloğuna bantlayın ve platformun kulak bölgesinin her iki tarafına vakum gresi uygulayın. Kulağı keçenin merkezine hizalamaya dikkat ederek, lamı platformun üzerine yerleştirmek için fareyi döndürün.

Kulak yerleştirildikten sonra, izofluran burun konisini platformdaki tutucuya, koninin sabitlendiğinden ve farenin burnunu tamamen kapattığından emin olarak oturtun. Ardından bir pamuklu çubuk kullanarak, vakum gresini lamelin altında yayacak şekilde, lameli görüntüleme platformuna sıkıca ancak dikkatlice bastırın. Lameli platforma sabitlemek için platformun üst kısmına iki adet 20 milimetrelik ve iki adet daha uzun bant parçası sarın.

Ardından, fareyi mikroskop tablasına yerleştirin. Platformu daha fazla bantla sabitleyin ve kulağın etrafındaki lamın üzerine çift kat vakum gresi sürün. Daha sonra, farenin etrafını su dolu bir ısıtma battaniyesi ile sarın ve vakum gresi rezervuarını 37 °C distile su ile doldurun.

In Vivo zamanraflu görüntüleme için, öncelikle objektifi kulağın merkezine konumlandırın ve objektifi, rezervuardaki suyun yüzeyine temas edene kadar indirin. Ardından, harici bir ışık kaynağı kullanarak, kulağın yüzeyi odaklanana kadar objektifi yavaşça indirin. Sonrasında, mikroskop tablası etrafındaki iç ve dış perdeleri indirin; MP lazer kontrol penceresinde lazer dalga boyunu 900 nanometreye, veri toplama ayarları lazer penceresinde lazer gücünü ve görüntü toplama kontrol penceresinde PMT voltajlarını ayarlayın.

Kazanım ayarlarındaki boyut ve mod pencerelerinde, mikroskobu 512 x 512 piksel çözünürlüğe ve piksel başına 2 µs bekleme süresine ayarlayın; doku boyunca tarama yapmak için canlı görüntüleme modunu etkinleştirmek üzere XY tekrarını seçin. Uygun bir görüntüleme alanı bulunduğunda, dermisteki en üstteki hücreyi belirleyin ve Z konumunu sıfırlamak için sıfırı ayarla düğmesine tıklayın. Hücre derinliğinin boyutunu ölçmek için Z yönünde aşağıya doğru kaydırın.

Ardından, görüntüleme ayarları mikroskop penceresinde başlangıç ve bitiş konumlarını belirleyin ve görüntüleme alanının derinliği boyunca hücrelerin görselleştirmesini optimize etmek için parlak Z penceresindeki cihaz PMT voltajlarını ve lazer gücünü ayarlayın. Derinlik ve zaman düğmelerini kontrol edin ve görüntüleme kontrol filtre modu penceresinde, görüntü her satırda üç kez taranacak şekilde ortak bir filtre belirleyin. Görüntüleme mikroskobu penceresinde, zaman görüntüleme penceresinde belirtildiği üzere, tam bir yığının yakalanması yaklaşık bir dakika sürecek şekilde Z kesit derinliğini ayarlayın.

Ardından, dokunun stabilitesini değerlendirmek için görüntüleme ayarları zaman tarama penceresinde tekrar sayısını beş olarak belirleyin ve bölgenin beş dakikalık hızlandırılmış görüntüsünü yakalamak için tarama düğmesine tıklayın. Beş dakika sonra doku stabilse, görüntüleme ayarları zaman tarama penceresinde tekrar sayısını 30 ile 45 arasında ayarlayın ve görüntü toplanurken herhangi bir küçük doku kayması olup olmadığını izleyerek 30 ila 45 dakikalık bir hızlandırılmış görüntü toplayın. Antikor öncesi görüntüyü uygun formatta kaydedin ve ardından tüm hava kabarcıklarını temizlemeye dikkat ederek antikor karışımını bir mililitrelik bir tüberkülin şırıngasına çekin.

Antikor solüsyonunun iğnenin ucunda bir damlacık oluşturması için pistonu nazikçe bastırın ve kateteri konumlandırmak için sahne etrafındaki perdeleri kaldırın. PBS şırıngasını antikor şırıngasıyla değiştirin ve ardından antikorları yavaşça kateterin içine enjekte edin. Antikorlar başarıyla enjekte edildiğinde, perdeleri tekrar indirin ve enjeksiyon saatini kaydedin.

Ardından, antikor öncesi görüntüleme ile aynı cihaz ayarlarını kullanarak, aynı konumda hemen yeni bir 20 ila 40 dakikalık görüntüleme dizisi toplamaya başlayın. Son olarak, antikor sonrası görüntüleme dosyasını uygun formatta kaydedin ve hayvan tamamen iyileşene kadar izleyerek fareyi mikroskop tablasından dikkatlice çıkarın. Bu protokol ile sağlam kulak dermisinin görüntülenmesi, iltihaplı dermisteki efektör T hücresi dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ve zaman ayarlı görüntülerinin elde edilmesini kolaylaştırır.

Bu videoda, adoptif olarak transfer edilen yeşil efektör T hücrelerinin dermal doku boyunca hareket ettikleri gözlemlenebilir. Ancak, kateter yoluyla antibeta one ve antibeta three entogrin bloklayıcı antikorların uygulanmasının ardından, daha önce hareketli olan hücreler dermis içinde durur. Hücreler, antikor uygulamasından sonra ortalama hızda bir azalmanın yanı sıra kıvrılma indekslerinde (meandering index) belirgin bir düşüş sergiler.

Yani, toplam yer değiştirmenin toplam iz uzunluğuna oranıdır. Kıl foliküllerinden kaynaklanan otofloresanslar, üstteki kılların oluşturduğu gölgelenmeler ve otofloresanslar ile kulak yüzeyi ve lam arasında hapsolan hava kabarcıklarının tamamı, T hücrelerinin görüntülenmesini engelleyen ve otomatik görüntü analiz yazılımını etkileyen görüntüleme artefaktlarına yol açabilir. Ayrıca, birden fazla ısı kaynağının kullanılması doku stabilitesi sorunlarına neden olarak, görüntüleme sırasında sonuçların yorumlanmasını zorlaştıran büyük salınımlara yol açabilir.

Prosedür doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, dermis içindeki CD4 T hücrelerinin görüntülenmesi, yöntem üzerinde uzmanlaşıldıktan sonra iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, farelerle çalışma konusunda uygun hayvan bakımı ve kullanım kılavuzlarına uymayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedür, farklı enfeksiyon modelleri veya farklı inflamasyon indükleme yöntemleri kullanılarak, kulaktaki diğer T hücresi alt kümelerinin veya bağışıklık hücresi türlerinin görselleştirilmesi için adapte edilebilir.

Geliştirilmesinin ardından intravital görüntüleme, immünoloji alanındaki araştırmacıların canlı hayvanlarda devam eden immün yanıtların dinamiklerini keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Çok fosforlu bir lazerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun koruma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare kulak dermisinde inflamasyonun nasıl indükleneceği ve antikor uygulaması öncesi ve sonrasında CD4 T hücresi aktivitesinin zaman ayarlı görüntülerini yakalamak için intravital görüntülemenin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.