Name: SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin siRNA aracılı susturma ve immünofloresans analizi ile fare oositlerinde mayoz iğ oluşumunu değerlendirmeyi. Bu yöntem kromozom ayrışması mekanizmalarını ve anöploidi nedenlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma kısmen Georgia Üniversitesi tarafından desteklenmiş ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden MMV'ye hibe (HD071330) verilmiştir.

Bu protokol Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Hazırlıklar <ol><li> Taze oosit kültür, satın alma ya da için minimum temel ortam (MEM) hazırlanması ve Tablo 1 &#39;de tarif edilen 3 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile tamamlar. (Sıfıra dara), bir yükleme dengesine bir polistiren şişe yerleştirin. Amacıyla, BSA hariç tüm reaktif maddelerin ilave edin ve 250 g&#39;lık bir toplam ağırlık ile MQ su ile son hacim getir. Ardından, BSA eklemek çözülür ve filtre sterilize izin verir. Not: Açıklanan MEM ortamı,% 5 CO2,% 5 O2 ve% 90 N2 medikal gaz karışımı ile dengeye ve hücre inkübasyon gerektirmektedir. Bununla birlikte, diğer bir araç (örneğin, CZB) atmosferik şartlar altında% 5 CO2 hücre inkübasyon için izin veren kullanılabilir. </li><li> Oosit mikroenjeksiyon için, satın almak ya da M2 orta hazırlayın. </li><li> P hazırlayın5 IU / 100 ul bir konsantrasyona kadar regnant kısrak serum gonadotropini (PMSG). </li><li> Satınalma ve 1 mcM bir çalışma konsantrasyonu siRNA stoklarını sulandırmak. </li></ol> 2. Fare Oosit Toplama <ol><li> 1. GÜN: over folikül gelişimini teşvik ve ön ovulatuar folikül sayısını artırmak, periton oosit toplama 48 saat önce dişi farelere PMSG 5 IU yönetmek için. </li><li> GÜN 3: Yumurta toplama ve kültür için 1 mcg / ml milrinon ile desteklenmiş MEM / BSA 3 ml 35 mm kültür kaplarına kurdu. Bu fosfodiesteraz inhibitörü olarak oosit tutar profaz-ı tutuklamak ve germinal vezikül dökümü (GVBD) engeller. En az 15 dakika boyunca tıbbi gaz karışımı içinde kültür kaplarına dengelenmesi. Not: Milrinon desteklenmiş ortam oosit toplama ve oosit mikro enjeksiyon ve 24 saatlik kültür tutma sonrası dönem boyunca siRNA gereklidir. </li><li> 15 uygulamaları kurulan laboratuvar ile dişi farelerin yumurtalıkları almak ve önceden ısıtılmış olan yeni bir kültür çanak transfer ve MEM / BSA / milrinon dengelenmiş. </li><li> Oosit toplanması için bir stereomikroskopta aşamasında kültür çanak yerleştirin. Yayın cumulus-oosit kompleksleri (COC) &#39;ın elle 27 G iğne ile antral folikülleri delinmesiyle. 1 ml şırınga bağlı 27 G iğne ile, kültür çanak tabanına bir yumurtalık saptamak ve tüm büyük folikül delinme için ikinci bir iğne kullanımı. Her yumurtalığın için tekrarlayın. </li><li> Kompakt kümülüs hücrelerinin 2 veya daha fazla kat çevrili tüm oosit toplamak, standart ağız pipet prosedürleri veya oosit aspirasyonu diğer araçları kullanma. Yeni bir çanak COC en aktarın ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Dikkatle 750 ul&#39;lik bir aspirasyon hacmi ayarlanmış bir 1 ml&#39;lik pipet ile tekrar yumuşak pipetleme çevreleyen kümülüs hücreleri çıkarmak. Pipet adım yaklaşık 12 kez tekrarlayınve oositler 5 dakika süre kurtarmak için izin verir. Tamamını veya kümülüs hücrelerinin çoğu ortadan kadar bu şekilde devam edin. Başka bir kültür tabağına soyulmuş oositler aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de dengelenmeye bırakın. </li><li> Hesaba ilgili hedef karşı spesifik siRNA&#39;lar (i), mikroenjeksiyon, spesifik olmayan (kontrol) siRNA&#39;lar, (ii) mikroenjeksiyon, ve (iii) olmayan bir enjekte edilmiş kontrol grubu üç deneysel gruba soyulmuş oositler tahsis için kullanılacak Kültür koşulları. </li></ol> 3. Oosit Mikroenjeksiyon <ol><li> Oosit Mikroenjeksiyon için milrinon (1 ug / ml) ile takviye edilmiş 3 mi M2 medya ile kültür kaplarına ayarlayın. Yıkama ve enjekte edilen oositlerin daha sonra kültür için MEM / BSA / milrinon ihtiva eden kültür kaplarına hazırlayın. Not: M2 ortamı HEPES tamponu içerir ve atmosferik koşullar altında, 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ön ısıtmaya gerektirir. MEM tarif tıbbi gaz kullanılarak ön ısınma ve dengeleme gerektirirYukarıda d. </li><li> Mikroenjeksiyon sistemi hazırlayın. 1 mcM belirli siRNA çözeltisi 5 ul enjeksiyon iğnesi yükleyin. Mikroenjeksiyon sistemi mikromanipülatörler tutma pipet ve enjeksiyon iğnesi Güvenli ve kalibre hacmi ve basınç Enjeksiyon Ünitesi kurmak. </li><li> 3 cm kültür çanak kapağın iç tarafında M2 medya 200 ul mikro damla yerleştirin ve kurmak ve mikroenjeksiyon sistemi uyumu için bir oosit ekleyin. </li><li> Bir kılavuz olarak oosit kullanarak, holding ve enjeksiyon iğneleri konumlarını ayarlayın. Nazikçe oosit güvenliğini sağlamak ve hücrenin en geniş çaplı enjeksiyon iğnesi konumunu ayarlamak için tutma pipet negatif basınç uygulayın. Her yerde oosit sitoplazmaya siRNA çözeltisi yaklaşık 10 ul mikroenjeksiyon izin ayarları yapın. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Şekil 1. Oosit mikroenjeksiyon kurdu. ( <strong&gt; sırasıyla sol ve sağ, konumlandırılmış tutma pipet ve enjeksiyon iğnesi ile 3 cm kültür çanak kapağın üzerine yerleştirilmiş M2 medya 200 ul mikro-damla, A) Temsilcisi görüntü. (B) Grubu profaz-ı mikroenjeksiyon öncesinde oosit (GV-evresi) gözaltına aldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </li><li> Stereomikroskopta sahneye kapağı dönün ve taze M2 medya 200 ul mikro damla ekleyin. Ağız pipetle veya alternatif yöntemlerle mikro damlasına kadar oosit bir grup (~ 10) ekleyin, daha sonra mikroenjeksiyon aşamasına mikro damla ile kapağı dönün. <ol><li> Bireysel oosit Microinject geçin. Yavaş yavaş sitoplazmaya enjeksiyon iğne ucu yerleştirin tutan pipet ile tek oosit Güvenli ve siRNA çözümünün enjeksiyon hacmi sınırdışı. Dikkatle iğne ve mo gerimikro-damla altındaki bir pozisyonda enjekte oosit ziyaretinde. Mikro-damla üstünde bir konuma başarısız enjekte oosit taşıyın. </li><li> Her oosit ile mikroenjeksiyon işlemi tekrarlayın. Her seferinde uygun oosit canlılığı, oosit Microinject az sayıda korumak için. Bu süreç mikro damla sıcaklık ve pH değişiklikleri önlemek için birkaç dakikadan fazla sürmüyor emin olun. </li></ol></li><li> Aspire başarıyla oosit enjekte veya dikkatlice stereomicroscope enjekte oosit mikro damla ile kapağı hareket ettirin. Yıkama ve 37 ° C&#39;de dengelenmeye / BSA / milrinon orta MEM, ağız pipetleme ve alternatif metodlar ile enjekte uygulanabilir oosit aktarın. </li><li> Oosit başka bir grup kullanarak, kontrol grubu için non-spesifik siRNA&#39;lar yüklü yeni bir enjeksiyon iğnesi ile mikroenjeksiyon işlemi tekrarlayın. Ayrı bir kültür çanak MEM / BSA / milrinon ve transfer oosit yıkayın. </li><li> Kültür tüm gruplarınTıbbi bir gaz atmosferi altında, 37 ° C&#39;de MEM / BSA / milrinon 24 saat oocytes. Not: &#39;milrinon blok&#39; kültür dönemi verimli hedef mRNA / protein tükenmesi için gereklidir. </li></ol> Mayotik Matürasyon 4. Oosit Kültürü <ol><li> GÜN 4: oosit oluşturduğu her bir deney grubu için 3 ml MEM / BSA ile kurulumu 4 kültür kaplarına (35 mm). Oosit olgunlaşması için kullanımı,% 10 (yüksek kalitede) cenin sığır serumu (FBS) ile birlikte grup başına bir ortam çanak Supplement. Tüm kültür tabakları tıbbi gaz karışımı ile 37 ° C &#39;de dengelenmeye bırakın. </li><li> Sırayla, &#39;milrinon bloğu&#39; dan oosit serbest MEM / BSA içeren yemekler oosit üç defa yıkamak ve daha sonra% 10 FBS ile ortamı içeren olgunlaşma çanak oosit aktarmak için. Kültür, 37 ° C&#39;de 17 saat boyunca tüm oosit gruplan, yeniden başlamasını ve mayoz ilerlemesini sağlarlar. </li><li> 5. GÜN: oosit çapraz ba¤ hazırlanın çözümlertion, aşağıdakileri içeren: (i) PEM tampon maddesi içinde% 4 paraformaldehid (PFA) (100 mM PIPES [pH 6.9], 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA)% 0.5 Triton-X 100, ve (ii) PBS 5 ile takviye edilmiş olan yıkama ve oosit engellemek için kullanılacak% FBS. Not: Bu çözümler öncesinde oosit tespitin 37 ° C-ısınma ön gerektirir. </li><li> (17 saat kültürden sonra) oositi tespit için, hızlı bir şekilde 750 ul ihtiva eden ağız pipetleme ya da (4-iyi bir çanak) bireysel çukurlar halinde alternatif yöntemler ile oosit oluşturduğu her bir deney grubu transferi% 4 PFA çözüm, önceden ısıtılmış ve 37 ° C&#39;de inkübe 1 saat ° C. Daha sonra,% 5 FBS içeren önceden ısıtılmış PBS 750 ul, 3 kez (her biri 15 dakika) oositler, her grup yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 200 ul PBS /% 5 FBS O / N Blok oositler bağlama spesifik antikor en aza indirir. </li></ol> 5. İmmünofloresan Analizi <ol><li> GÜN 6: Not: Bağışıklık boyaması bir çok-çukurlu plaka ve solüsyonu ° yapılırytes seri ilgili antikor ve yıkama çözümleri içeren sıralı yuvalara aktarılmıştır. Ya 48 ya da 96 oyuklu plakalar kullanılabilir sadece iyi boyutuna göre çözelti hacmini ayarlar. 96 oyuklu plakalar, oyuk başına 200 için ul kullanın. - 3 yıkanmaktadır - İkincil antikor çözeltisi - 3 yıkanmaktadır primer antikor çözeltisi: Oositler aşağıdaki sırayla farklı çözümler aktarılır. Plaka folyo ile kaplı olabilir ışık maruz kalma sınırı. Taze PBS /% 5 FBS hazırlayın ve antikor çözeltiler elde etmek için, bu çözelti (örneğin, tavşan anti-pericentrin (1/1000), fare anti-tubulin (1/1000)). </li><li> Primer antikor solüsyonu (daha az hacim arzu edildiği takdirde veya 100 ul) 200 ul ihtiva eden tek tek oyuklara her bir deney grubu sabit oosit aktarın ve de parafilm ile kaplayın. Uygun antikor özel koşullara göre inkübe (örneğin 1 saat veya 4 ° CO / N 37 ° C). Not: Primer antikor dilution yanı sıra, özel bir inkübasyon süresi ve sıcaklık, kullanılan farklı antikorlar için uygun koşulları belirlemek için test gerektirir. </li><li> Primer antikor ile inkübe edildikten sonra, PBS /% 5 FBS (10-15 dk) oosit üç kez yıkayın. </li><li> Floresan-konjuge sekonder antikor ihtiva eden çözelti içine oosit aktarın (örneğin, farklı dalga boylarında florokromlar ile konjuge edilmiş anti-tavşan ve anti-fare antikorlarının 1/1000 seyrelti). 37 ° C &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> (- 15 dakika her biri 10) PBS /% 5 FBS oosit üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkama adımından sonra, temiz bir cam slayt üzerine oosit transferi ve hafifçe herhangi bir fazla yıkama solüsyonu aspire. Bu cam yüzey üzerinde oosit hareketsiz olacaktır. Medya (DAPI içeren) Montaj 8 ul ekleyin ve dikkatli bir 22 mm x 22 mm kapak kayma montaj ortamı kaplaması. Oosit, hava kabarcığı ve / veya zarar vermemek için yavaş yavaş lamel indirin. Not: Alternatif olarak, konfokal mikroskopi analizi için oositin 3 boyutlu özelliklerini korumak önceki slaytta montajı için kapak kayma köşelerine 100 mikron cam boncuklar (vazelin ile karışık) küçük hacim eklemek için. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın saydam ya öz değişmesine ait ilerlemesi değerlendirilmesi olarak kullanılan sekonder antikor eşleştirmek için gerekli olan filtreler ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu kullanılarak ifade seviyeleri ve subsellüler protein lokalizasyonu analizine devam edin. </li></ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li>
<li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li>
<li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li>
<li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li>
<li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li>
<li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome%3A+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li>
<li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1%2FEg2+in+maturing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li>
<li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+%28GV%29+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li>
<li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li>
<li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li>
<li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Örneğin elektroporasyon transfeksiyon ve somatik hücreler, ekzojen nükleik asit aktarımı için çok sayıda yöntem vardır birlikte, mikro-enjeksiyon, transkripsiyonel olarak hareketsiz bir fare oositlerine RNA moleküllerinin verilmesi için uygun bir yöntemdir. Mevcut protokol farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel test sağlayan spesifik mRNA in vitro tükenmesi için etkili bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşım, verimli transkript tükenmesi ile sonuçlanır ve son derece uyarlanabilir. SiRNA&#...

Mayoz gametlerin (oosit ve sperm) oluşur ve mayoz-I ve mayoz-II, sırasıyla 1 sırasında homolog kromozom ve kardeş kromatidler ayırmak için DNA sentezini müdahale olmadan iki ardışık bölümler içeren benzersiz bir bölünme sürecidir. Oositlerde öz değişmesine ait bölünme sırasında kromozomların dağılması hatalar fertilizasyon esnasında embriyo tarafından devralınır anoploidi, neden olabilir. Özellikle, gelişmekte olan embriyolarda anöploidi sıklığı anne yaşı ilerledikçe artar ve kadınlarda 1,2 gebelik kaybı yanı sıra konjenital doğum kusurları önemli bir nedenidir, bu nedenle, mayoz bölünme sırasında anöploidinin moleküler temelini anlamak için önemli bir ihtiyacı vurgulayan . Hücre bölünmesi sırasında, kromozom ayrımı ters göbeğine doğru eki için mikrotübül mili aparatı ve istikrarlı kromozom-mikrotübül etkileşimlerin kurulması montajı ile ilgili hayati bağlıdırkutuplar. Önemli olarak, memeli oositlerinde öz değişmesine ait iğ formasyonu somatik hücrelerde mitoz farklıdır ve benzersiz mikrotübül organize merkezleri sentriyoller 3,4 eksikliği (MTOCs) tarafından düzenlenir. Mikrotübül çekirdeklenme ve organizasyon için gerekli esansiyel proteinler mikrotübül düzeneğini katalize γ-tubulin dahil oosit MTOCs, lokalize. Buna ek olarak, MTOCs 5 de bağlanan bir esas iskele proteini olarak işlev görür ve ankraj γ-tubulin gibi diğer faktörler pericentrin. Özellikle, çalışmalarımız önemli MTOC ilişkili proteinlerin tükenmesi mayoz iğ organizasyon bozar ve tam mili montaj kontrol noktasında (SAC) 6,7 tarafından çözüldü olmayan oosit kromozom ayrımı hataları neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, mayoz tutuklanmasını tetiklemez iğ istikrar kusurları, anöploidi katkıda önemli bir risk oluşturmaktadır. Mili montaj ve organizasyon, oosit MTOC prot önemli rolleri rağmenein kompozisyon ve fonksiyon pek iyi anlaşılamamıştır. Hücreler kısa mayoz 8,9 yeniden başlaması öncesinde transkripsiyonel sakin olmak gibi memeli oositlerinde belirli hedef proteinlerin fonksiyonlarını test zordur. Bu nedenle, ön-ovulatuar oosit mayoz devam etmek için anne mRNA mağazaları güveniyor ve mayoz bölünme yanı sıra gübreleme 10,11 sonra ilk bölünme bölünmeleri destekler. Memeli oositlerinde mRNA transkriptlerinin RNA interferans (RNAi) aracılı degradasyon etkinliği iyi bilinmektedir ve mayoz olgunlaşma sırasında çeviri için işe anne RNA&#39;lar siRNA 12-14 hedefleme için özellikle uygundurlar. Bu nedenle, oosit içine kısa müdahale RNA&#39;lar mikroenjeksiyon (siRNA) fonksiyonel test için hedef mRNA&#39;ları tüketmek için değerli bir yaklaşım sağlar. Burada, fare oositleri ve spesifik Transcri siRNA aracılı tükenmesi izolasyonu için yöntemleri tarif ederPTS pericentrin temel bir MTOC ilişkili proteinin fonksiyonunu test etmek. Buna ek olarak, oositlerde öz değişmesine ait iğ formasyonunun değerlendirmek için immünofloresan analiz koşulları açıklar.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hamile Kısrak Serumu Gonadotropin (PMSG)</td> <td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Tablo 1'de özetlenen tarif</td></tr><tr><td>Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pirüvik Asit, sodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G, potasyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin Sülfat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodyum tuzu dihidrat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Amino Asitler (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Karışımı (100x)</td> <td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Ortamı Hepes ile</td><td>Pericentrin Qiagen</td> GS18541 Negatif kontrol siRNA'larını hedefleyen EMD Millipore <td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>siRNA'lar</td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (% 16 çözelti)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Hidroksin</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (tavşan)</td> <td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-asetillenmiş a-tubulin (fare)</td> <td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Büyük Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Stereomikroskop (SMZ 800)</td> <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dik Floresan Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Mikro Enjeksiyon Sistemi</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro Manipülatörler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro enjeksiyon iğneleri (femtotipler)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Tutma pipetleri (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Plastikler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm kültür kapları</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu plakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm CA Filtre Sistemi</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

sirna aracılı susturma mouse oositlerinin içinde mayoz mili değerlendirmesi

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Gametlerde mayotik bölünme sırasında kromozom ayrışmasındaki hatalar, daha sonra döllenme üzerine embriyoya iletilen anöploidiye yol açabilir. Gelişmekte olan embriyolarda ortaya çıkan anöploidi, gebelik kaybının ve Down sendromu gibi doğuştan doğum kusurlarının önemli bir nedeni olarak kabul edilmektedir. Doğru kromozom ayrımı, mikrotübül iğ aparatının oluşumuna kritik bir şekilde bağlıdır, ancak bu süreç memeli oositlerinde tam olarak anlaşılamamıştır. Şaşırtıcı bir şekilde, mayotik iğ düzeneği mitozdan farklıdır ve en azından kısmen, benzersiz mikrotübül düzenleme merkezleri (MTOC'ler) tarafından düzenlenir. MTOC ile ilişkili proteinlerin değerlendirilmesi, mayotik iğ oluşumunu ve organizasyonunu yöneten düzenleyici mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Burada, test fonksiyonu için siRNA aracılı bir yaklaşım kullanarak fare oositlerini izole etmek ve MTOC ile ilişkili proteinleri tüketmek için yöntemleri açıklıyoruz. Ek olarak, mayotik iğ oluşumunu ve organizasyonunu değerlendirmek için oosit fiksasyonu ve immünofloresan analiz koşullarını tanımladık.

SiRNA&#39;lar Mikroenjeksiyon in vitro farklı hedef faktörlerinin etkin ve yüksek düzeyde spesifik fonksiyonel test sağlar oositlerde mRNA bozulması ve daha sonra da protein tükenmesi için etkili bir yaklaşım sağlar. Daha sonra, belirli bir fenotip immünofloresan analizi için kullanılan olarak siRNA enjekte edilmiş oositlerde protein tükenmesi doğrulamak için. Mevcut örnekte, anti-tubulin ve anti-pericentrin antikorları ile birlikte DAPI ile ayrı oosit floresan etiketleme etkin: olarak pericentrin tükenmesi (i)...

Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Bu prosedürün genel amacı, perrin gibi temel MTOC ilişkili proteinlerin irna aracılı depleksyonunu takiben sitlerdeki miyotik iğ oluşumunu ve organizasyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, kromozom ayrılmasını düzenleyen mekanizmalar ve tüm bölgelerde aneuploidiye yol açan potansiyel aksamalar gibi üreme biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bireysel sitlerin etkili transkript susturulması ve spesifik immünofloresan analizinin sağlanmasıdır.Bu prosedür, neredeyse herhangi bir hedef proteini incelemek için de uyarlanabilir; toplama gününden 48 saat önce, oosit toplama için kullanılan dişi farelere intraperitonal olarak beş uluslararası ünite PMSG enjekte edin. Standart uygulamaları kullanarak yumurtalıkları topladıktan sonra, BSA ve mil reone ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış ve dengelenmiş MEM besiyeri içeren bir kaba aktarın ve oositleri bir diseksiyon mikroskobu altında izole etmeye hazırlanın. Bir yumurtalığı, 27 gauge bir iğne kullanarak kültür kabının tabanına sabitleyin ve antral folikülleri oosit aspirasyonu veya standart ağızla pipetleme uygulamasıyla delmek için ikinci bir iğne kullanarak kumulus oosit komplekslerini (COC'ler) serbest bırakın.İki veya daha fazla kompakt kumulus hücresi tabakasıyla çevrili oositleri toplayın. Bu COC'leri M-E-M-B-S-A mild reone içeren yeni bir kaba aktarın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, standart yöntemleri kullanarak oositlerin denüdasyon işlemini gerçekleştirin.Enjeksiyon kültür kabını, mililitrede bir mikrogram milone içeren üç mililitre M iki medyumu ile hazırlayın. Ayrıca yıkama ve kültür kaplarını M-E-M-B-S-A milone ile hazırlayın. Ardından, enjeksiyon iğnesine beş mikrolitre 1 milimolar INA çözeltisi yükleyin ve mikroenjeksiyon için kurulumunu yapın.Şimdi, üç santimetrelik bir petri kabının kapağına 100 µL M two besiyeri damlatın. Damlanın içine bir oosit yerleştirin ve tutma pipetinin konumunu ayarlamak için bu oositi kullanın. Negatif basınç kullanarak OAS bölgesini tutma pipetine sabitleyin.Ardından, enjeksiyon iğnesinin konumunu oositin en geniş çapına göre ayarlayın. Konumlandırma tamamlandıktan sonra, nukleusa dikkat ederek oosit sitoplazmasına yaklaşık 10 picoliter çözelti enjekte edin. Kapağı stereo mikroskop tablasına geri yerleştirin ve 100 microliter taze M two besiyeri ekleyin.Besiyerine yaklaşık 10 oosit yerleştirin. Ardından mikroenjeksiyon tablasında mikroenjeksiyon işlemine geçin. Her bir oositi tutucu pipetle sabitleyin ve enjeksiyon iğnesini yavaşça sitoplazmaya yerleştirin.S irna solüsyonunu enjekte edin ve enjeksiyon pipetini dikkatlice geri çekin. Başarıyla enjekte edilmiş sitleri damlanın bir ucuna, başarısız olanları ise damlanın karşı ucuna taşıyın. Hücrelerin canlılığını korumak açısından kritik olan 10 sitin enjekte edilmesi işlemi sadece birkaç dakika sürmelidir.Kapağı stereo mikroskop tablasına taşıyın ve başarıyla enjekte edilen tüm hücreleri, 37 derece Celsius'a ısıtılmış bir M-E-M-B-S-A ortamı kabına aktarın. Hücreleri, tıbbi gaz atmosferine sahip 37 derece Celsius'luk bir inkübatöre aktarın ve 24 saat boyunca inkübe edin. Hücreleri, üç kez M-E-M-B-S-A ile yıkayarak ortam bloğundan serbest bırakarak işleme başlayın.Ardından sitleri, %10 FBS içeren maturasyon besiyerine aktarın. Hücreleri 37 °C'de 17 saat boyunca kültüre edin. Böylece mayoz bölünme ertesi gün yeniden başlayacaktır.Hücreleri fikse edin. Farklı deneysel grupları, 750 µL önceden ısıtılmış %4 PFA içeren dört kuyucuklu plaka kuyucuklarına hızlıca aktarmak için hücre aspirasyonu veya ağızla pipetleme yöntemini kullanın. Hücreleri bir saat boyunca inkübe edin.Her grubu, %5 FBS içeren ısıtılmış PBS'nin 750 microliters ile üç kez yıkayın. Her yıkama işlemi inkübatörde 15 dakika sürmelidir; yıkamanın ardından, her O bölgesi grubunu BS içindeki %5 FBS ile bloke edin. İmmünboyama için bloklamanın dört degrees Celsius'ta gece boyunca sürmesine izin verin. Çok kuyucuklu plaka üzerinde, her bir sit grubu deney grubu için sekiz kuyucuktan oluşan bir sıra kullanın.4 adet 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 200 µL çözelti yükleyin. Boyama işlemine taze hazırlanmış primer antikor çözeltisi ile başlayın. Ardından kuyucukları parafilm ile kapatın ve primer antikor uygulamasını takiben hücreleri antikor spesifikasyonuna uygun olarak inkübe edin.Hücreleri, yıkama başına 10 ila 15 dakika boyunca PBS içinde %5 FBS ile üç kez yıkayın. Üç yıkamanın ardından hücreleri sekonder antikor çözeltisi bulunan bir kuyuya aktarın. Bu kuyuları parafilm ile kapatın.Hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin ve ardından daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, oositleri temiz cam lamlara aktarın. Bir deney grubundaki tüm oositler tek bir lama aktarılır.Hücreleri immobilize etmek için fazla solüsyonu aspire edin ve derhal sekiz µL dappy içeren montaj medyumu ekleyin. Ardından, hava kabarcıklarını veya oositlere zarar vermeyi önlemek için üzerlerini dikkatlice lamel ile kapatın. Spesifik olmayan bir kontrol veya perrin irna ile mikroenjeksiyon yapılan oositler, 17 saatlik kültürden sonra, kontrollerin çoğu metafaz II aşamasına ulaşmış ve dizilmiş kromozomlar içeren organize miyotik iğciklere sahip olmuştur. Kırmızı ile gösterilen perrin boyaması, iğcik kutuplarında parlak ve odaklanmış şekilde görülmüştür.irna enjekte edilen hücrelerde perrin boyaması tespit edilmediğinden, transkriptlerin başarıyla baskılandığı görülmüştür. Bu oositlerin çoğu metafaz I evresinde kalmış ve hizalanmamış kromozomlar ile düzensiz iğ iplik yapıları sergilemiştir. Az bir kısmı metafaz II evresine ilerlemiş, ancak bunlar da bozulmuş iğ iplikleri göstermiştir.Artık fare oositlerini nasıl toplayacağınız, spesifik siRNA'lar ile mikroenjeksiyon yapacağınız ve ardından spin oluşumu ile organizasyonunun floresan analizi için bu oositleri nasıl immün boyayacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Oosit canlılığını ve kalitesini korumak için hızlı ve büyük bir dikkatle çalışmayı hatırlamak önemlidir.

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Polarize ışık mikroskobu kullanarak insan yumurtası olgunluğunun non-invaziv değerlendirilmesi için klinik protokolün ana hatlarını salıyoruz.

İnsan Yumurtası Olgunluk Değerlendirmesi ve Klinik Uygulaması

Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Oosit genom bütünlüğünün korunması, elde edilen embriyoda genetik sadakati sağlamak için gereklidir. Burada, memeli dişi üreme hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılmaları tespit etmek için doğru bir protokol sunuyoruz.

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Öğrenin siRNA aracılı susturma ve immünofloresans analizi ile fare oositlerinde mayoz iğ oluşumunu değerlendirmeyi. Bu yöntem kromozom ayrışması mekanizmalarını ve anöploidi nedenlerini anlamaya yardımcı olur.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet