Name: Bir humanize oluşturuluyor Drosophila S2 Hücre Hattı Duyarlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin, Drosophila S2 hücre hattında kinesin-5 inhibitörlerine duyarlı hücreler oluşturarak hücre bölünmesi sırasında hata düzeltme mekanizmalarını canlı görüntüleme yöntemiyle nasıl çalışılacağını.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kinesin-5 yapının hediye için Patricia Wadsworth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Charles H. Hood Vakfı, ınc TJM ve Araştırma Bursu sayılı TJM için Dimes Vakfı Mart ayından itibaren 5 FY13-205 yanı sıra desteğiyle bir NIH hibe (5 R01 GM107026) tarafından desteklenmiştir Boston, MA. TJM için

1. transfekte S2 hücreleri <ol><li> Önceden kültürlenmiş 25 cm2 şişeye kaynaktan, onları% 100 konfluansa 2 ml&#39;lik bir nihai hacme GFP-α-tübülin-ifade eden S2 hücreleri 10 ekleyin ve izin 35 mm doku kültürü çanağı içinde alt için yarı bağlı Yaklaşık 1 saat. </li><li> Çanak ortamı çıkarın. Eg5-mCherry Transfect 2 ug,% 10 FBS ile takviye edilmiş Schneider ortamı 11 1 ml yapı üreticinin protokolü takip edilerek, (Schneider ortamı diye değinilmektedir) ve Transfeksiyon ReaktifMaddesi. Parafilm ile çanak Seal ve 16-18 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Schneider medya 1 ml ekleyin. 25 ° C inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 3. gün post-transfeksiyon üzerine bir test indüksiyonu için Schneider ortamı 1,5 ml içeren, yeni bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde transfekte edilmiş hücrelerin 500 ul transfer. CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ekspresyonunu indüklemek </sub&gt; 500 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek. Parafilm çanak mühür ve 25 ° CO / N inkübe. </li><li> Konkanavalin A ile kaplı lamelleri, kaplamak için bir çözeltisi (0.5 mg / mL kadar H2O içinde çözülmüş) Concanavalin pipet yeterli hacmi oluşturmak için bir asit yıkandı lamel aşırı kaldırmak ve hava ile kurumaya lamel sağlar. </li><li> Daha sonra lamel üzerine uyarılan hücrelerin% 100 konfluansa 500 ul, tohum temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde 22 mm x 22 mm konkanavalin A ile kaplı lamel yerleştirin ve hücreler oda sıcaklığında 1 saat yapışmaya izin verir. </li><li> , Eg5 mCherry ifade edin bir floresan mikroskop oda sıcaklığında görüntüleme medya ile bir gül haznesine lamel (ya da uygun görüntüleme gemi) bir araya getirmek için. Hücreleri görselleştirmek için uygun ışık kaynakları ve filtre setleri kullanın. Örneğin, bu çalışmada kullanılan mikroskop bir LED beyaz ışık kaynağı ve EGFP (FITC / Cy2) ve DsRed (TRITC / Cy3) filtre küpler vardır. Eg5-MCherry mikrotübüllere lokalize ve nea zenginleştirilmiştirr mili direkleri. </li><li> Olduktan sonra hücreler, Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade edilen, Schneider ortamı 4 ml ihtiva eden bir 25 cm&#39;lik 2 doku kültürü şişesine transfekte indüklenmemiş hücrelerin geri kalanı aktarın. </li><li> Transfekte edilmiş hücrelerin şişeye 25 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda Blastisidin S HCL eklenir ve hücre ölümü periyodik Eg5-mCherry ekspresyonu kontrol etmek için emin olarak sona erene kadar 25 ug / ml Blasticidin S, HCI varlığında, bölme devam etmektedir. 25 ° C inkübatör hücre hatları inkübe edin. NOT: Zamanla Eg5 mCherry artışları ifade hücrelerin yüzdesi. </li><li> Hücreler stabil olarak transfekte edildikten sonra, ilacın yokluğunda bölünmüş ve gelecekte kullanılmak üzere 12 hücreleri dondurma devam etmektedir. </li></ol> 2. RNA Girişim <ol><li> PCR olduğu (Malzeme Listesi verilen sekans) ilave T7 promotör sekansı ile primer kullanılarak cDNA&#39;nın (LD15641) için Klp61F bir ~ 500 bp&#39;lik bir bölge amplifiyedsRNA sentezi için bir şablon olarak kullanıldı. <ol><li> Şablon DNA 100 ng, her bir primer, uygun bir tampon ve polimeraz 25 uM içeren dört PCR reaksiyonları, 50 ul, her biri ayarlayın. Polimerazın üreticinin protokolüne göre PCR PCR protokolünü ayarlayın. </li><li> Havuz ve PCR üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak temiz dört PCR reaksiyonları. -20 ° C de, temiz bir şablon saklayın. </li></ol></li><li> Bir T7 RNA transkripsiyon kiti kullanılarak üreticinin talimatlarına şablon çift sarmallı RNA (dsRNA) hazırlayın. DsRNA&#39;nın ~ 5-15 mg / ml konsantrasyon bekliyoruz. -20 ° C&#39;de dsRNA saklayın. </li><li> DsRNA ile Klp61F demonte etmek için,% 25 birbirine karıştığında Eg5-mCherry ifade eden S2 hücreleri 1 saat boyunca 35 mm doku kültürü çanağı alt yarı uygun sağlar. </li><li> Yemekler ortamı çıkarın ve Klp61F karşı dsRNA&#39;nın 5 ug ekleyin (Drosophila kinesin-5) serum serbest Schneider 1 ml seyreltilmiş &#39;s medya. </li><li> Daha sonra% 10 FBS ile Schneider ortamı 1 ml ilave 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 24 saat dsRNA tedaviden sonra 500 uM nihai konsantrasyona kadar CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ifadesini teşvik eder. Başka bir 24 saat daha 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> 3. Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> Temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde bir kaplanmış lamel konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin. </li><li> Tohum dsRNA ile muamele edilmiş ve uyarılan O / N konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine ve bunları, yaklaşık 1 saat yapışmaya izin olan hücrelerin 500 ul. </li><li> Görüntüleme için bir gül odasına lamel (veya uygun damarı) birleştirin. </li><li> Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade mitotik hücrelerin bulun. NOT: mili iki kutupluluğun için gerekli olan Klp61F beri monopolar iğ olmalıdır sadece GFP-α-tubulin ifade Mitotik hücreleri, 10,13 düşürülürse. </li><li> Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem ifade eden hücrelerde bipolar miller (dakika başına, örneğin, 1 kare) zaman atlamalı görüntüleri toplayın. </li><li> Görüntüleme sırasında, gül odasından ortamı çıkarın ve Schneider medya mili çöküşü görselleştirmek için odasına 3 ardışık medya alışverişi (~ 5 ml toplam) üzerinde 1 mcM STLC içeren değiştirin. </li><li> Dikkatlice gül odasından STLC içeren ortamı çıkartın ve taze medya ile gül bölmesini son bir kez yeniden doldurmadan önce Schneider medya 4x (6-8 ml toplam) yıkayın, ilaç yıkanmaya ve mil çöküşü tersine çevirmek için. Görüntüleme devam edin. </li></ol> 4. Hata Düzeltme Testi <ol><li> Temiz 35 mm doku kültürü kaplarına bir kaplanmış lamelleri konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin. </li><li> Tohum konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine Klp61F dsRNA ile işlemden geçirildi ve bunları uygun izin olan hücrelerin 500 ul. </li><li> Sonra hücreler adher olaned, 2 ml kadar son hacim getirmek için her yemeğin Schneider medya 1,5 ml ekleyin. </li><li> Mitoz hücreleri yakalama tabağın her birine 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyona değin MG132 ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın için. </li><li> 1 uM STLC ekleyin ve tek kutup oluşturulması için izin vermek için 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Lamelleri taze Schneider medya 2 ml her seferinde 3x durulama STLC yıkayın. </li><li> Bir kontrol olarak herhangi bir farmakolojik ajanlar (örneğin Aurora kinaz inhibitörleri) veya DMSO ilave olarak Schneider ortamı ile lamelleri inkübe edin. Not: İnhibitör konsantrasyonları, değişebilir ve uygun son konsantrasyonları deneyi ile tespit edilmelidir. Ortama: 1,000 stok çözeltileri, tipik olarak inhibitör 1 seyreltilmiştir şekilde yapılır. Bu durumda, bir 1: DMSO (veya uygun bir çözücü) içinde 1000 seyreltme araç kontrolü olarak görev yapar. Bu 40 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda Aurora B inhibitörü Binucleine 2 kullanır. </li><li> Farklı zaman noktaları t hücreleri saptamako Bipolar iğ oluşumunun ilerlemesini gözlemek ve kinetochore eki durumlarını değerlendirmek için. Düzeltmek: <ol><li> Çabuk 1x BRB-80 2 ml lamelleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 1 x BRB-80 içinde seyreltilmiş,% 10 paraformaldehit 2 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Bir kimyasal kaputu dikkatle Pipet paraformaldehit. </li><li> 8 dakika boyunca 1 x PBS +% 1 Triton-X 2 ml hücreleri geçirgenliği. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 2 ml ile 3 kez kayar. </li><li> Aktarım hücre tarafı 150 mm Petri kabındaki (Parafilm etiketlemek için bir işaretleyici kullanmak uygun slaytlar izlemek için) Parafilm bir levha üzerine yukarı bakacak şekilde lamelleri. </li><li> 150 ul kaynatıldı eşek serumu (BDS) ile lamelleri kaplayın ve spesifik olmayan bağlanma antikorun bloke etmek 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir nem odasında saklanır. Nem odasına yapmak için, 150 mm çanak kenarını hattııslak laboratuvar ile siliniz ve Petri kabı kapağı ile kaplayın. </li><li> Sırasıyla ug / ml, 1 (üreticinin tavsiyelerine göre ya da) bloğunu ve birincil antikor 150 ul 2 ug / ml nihai konsantrasyonları kinetokorlar ile mikro için leke BDS uygun şekilde seyreltilmiş olan, oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri inkübe . Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir nem odasında saklanır. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri. </li><li> BDS içinde seyreltilmiş uygun bir florofor konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca lamelleri inkübe edin. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI nihai konsantrasyon içeren BDS 150 ul lamelleri inkübe edin. </li><li> Lameller 2x 1x PBS +% 0.1 Triton-X yıkayın ve c monteoverslips aşağı medyayı montaj 8 ul bir 3x1 &quot;slayt hücre tarafı. Slaytlarınıza lamelleri hareketsiz için oje ile köşeleri boyayın. </li></ol></li><li> Eg5-mCherry ifade bipolar iğ Görüntü hücreleri. Bir 100X objektif kullanan tüm kanallarda 0,2 mikron aralıklarla 30 uçaklarının oluşan Z serisi atın. Dikkatle eki (iki-yönlenmeli veya syntelic ekleri) durumlarını belirlemek için kinetokorlar ve mikrotübülleri analiz. </li></ol>

<ol><li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li>
<li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+a+new+kind+of+tension%3A+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li>
<li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li>
<li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li>
<li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors%3A+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li>
<li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2(2006).</li>
<li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis%3A+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li>
<li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187(2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Hata düzeltme görselleştirme bu önemli ve kompleks hücresel süreçte yer alan adımları incelemek için değerli bir tekniktir. Bunu yapmak için, hatalı ek parça döner inhibitörleri kullanılarak oluşturulur ve hata düzeltme ilacın yıkanması sırasında gözlenir. Bu deney, ilk olarak, memeli doku kültürü hücreleri 5 kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak birçok model, memeli hücre tiplerinde kinetokorlar çok sayıda varlığı, bireysel hata düzeltme olayları gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme gözlemlemek için onlara daha fazla tercih hücre hattı yapım kinetokorlar olarak az 4 olarak çift sahiptirler. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, birçok inhibitörleri, Drosophila S2 hücrelerinde etkili olmasıdır. Bu nedenle, insan kinesin-5 eksprese eden bir insanlaştırılmış Drosophila S2 hücre çizgisi oluşturma yeteneği hata düzeltme incelemek için değerli bir araç sağlar. Drosophila S2 hücreleri olabilir, ancak, birhata düzeltme incelemek için daha iyi hücre hattı, hücre hattını elde etmek ve gerekli genleri aşağı vurma katılan çok sayıda adım bu tekniğin bazı zorluklar yaratıyor. Örneğin, transfeksiyon verimi oldukça düşük olabilir. Hücrelerin% 20&#39;den az Eg5-mCherry ifade ediyorsanız seçim süreci uzun sürer olarak, transfeksiyon tekrarlanmalıdır. Ayrıca, her iki floresan proteinleri eksprese eden hücrelerin yüzdesi zamanla azalabilir. Bu, sırasıyla, Eg5-mCherry eksprese eden hücreler ve GFP-α-tubulin seçilmesi için Blastisidin S HCI ve Higromisin B varlığında hücrelerin bölünmesi ile aşılabilir. Bu Drosophila S2 hücrelerinin birçok insan proteinleri ve ortologlara sahip olduğunu not etmek de önemlidir; bu nedenle, endojen proteinler için demonte koşulları optimize etmek için kritiktir. Optimal demonte koşulları dsRNA&#39;nın miktarı ve tedavinin uzunluğu değişebilir. Ortaya çıkışı ve hızla iyileşme dikkate alındığında CRISPR-Cas9 TECHNOLOGI15-17 es, insan Eg5 yerini Klp61F geni ile bir Drosophila hücre hattı nesil transfeksiyonu ve demonte yaklaşımın sınırlamaları aşmak olacağını güçlü bir alternatif sunuyor. Çalışmalarımız gerekli reaktifler halen geliştirilmekte olan Drosophila S2 hücrelerinde bunu her ne kadar sinek-insana gen değişimi bu durumda geçerli bir seçenek olması gerektiğini göstermektedir. Bu prosedür, Eg5 ile sınırlı değildir, ancak ilgi duyulan diğer proteinlerin fonksiyonu çalışma uygulanabilir. Daha önce Drosophila S2 hücrelerinde etkisiz olduğu kurulmuştur inhibitörleri kullanıyorsanız, bu protokol dışı hedef etkileri hakkında endişeler olmadan canlı hücrelerde inhibitörlerinin direkt etkisini araştırmak için modifiye edilebilir. Bu protokol kullanılarak üretilen hücre çizgisi, aynı zamanda, yüksek verimli tarama kullanılabilecek hata düzeltme katılan proteinleri hedef potansiyel ilaçlar tespit etmek analiz eder.

Hücre bölünmesi sırasında genomun Eşit ayrımı çoğaltılmış DNA ve iğ mikrotübüller arasında doğru etkileşimi gerektirir. Mikrotübüller fiziksel kinetokor oluşumunu uyarır 1 olarak bilinen sentromer çeviren proteinlerin bir topluluk sayesinde kromozomlar ile etkileşim. Kromozomların doğru dağıtım kardeş kinetokorlar burada her kardeş zıt kutuplarda iğ kaynaklanan mikrotübül ile ilişkili, iki-yönlenmeli gerektirir. Kinetochore mikrotübül (kt-MT) iki-yönde yönlendirilmiş konformasyonunda olmayan ekler hızlı ve verimli hata düzeltme olarak bilinen bir süreç içinde iki yönde yönlendirilmesi kurmak için fırsat sunmak amacıyla istikrarsızlaştırdı edilir. Daha önce, memeli hücrelerinde kurulmuş bir hata düzeltme deney 5 (kinesin-5) Eg5 karşı döner küçük molekül inhibitörleri kullanılarak tek kutuplu iğ monte gerektirir. Ilaç tedavisi hatalı syntelic ekleri çok sayıda üretir both kardeş kinetokorlar aynı iğ kutbuna bağlayın. Uygulanacak ilacın daha sonraki yıkama hata düzeltme işleminin olarak gösterebilir. Hata düzeltme tahlil hatalı kt-MT ekleri düzelterek aday proteinlerin katkısını incelemek için küçük molekül inhibitörleri veya knockdowns varlığında yapılabilir. Canlı hücreler hata düzeltme görselleştirmek için yeteneği daha bu karmaşık süreçte yer alan moleküler mekanizmayı anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, çoğu hücre hatlarında bulunan kromozomların çok sayıda bireysel kt-MT ekleri gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Onlar kadar az 4 olarak kromozom 6, fakat küçük molekül inhibitörleri içerdiğinden Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme deneyi uygulamak için ideal olacaktır S-tritil-L-sistein (STLC) halinde kinesin 5 ve 7-9 monastrol Drosophila hücrelerinde mili grubunu ya da kinesin-5 motor fonksiyonu etkilemez. Bu nedenle, cinslerted kinesin-5 inhibitörlerine duyarlıdır bir uyarılabilir promoterin altında insan kinesin-5 eksprese eden bir Drosophila S2 hücre çizgisi. Bu protokol, endojen Drosophila kinesin-5 homologunda, Klp61F demonte ve hücre tabanlı hata düzeltme deneyde bu hücre hattını kullanmayı açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomik Kaynak Merkezi</td><td>13690</td><td>Gen Adı LD15641</td></tr><tr><td>Schneider ' s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, sertifikalı</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Isı ile Etkisizleştirilmiş, ABD menşeili</td></tr><tr><td>Bakır(II) Sülfat (CuSO4)</td> <td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp; mM stok</td></tr><tr><td>S-tritil-L-sistein</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1 &nbsp; DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001'de</td> mM stoğu <td>5&nbsp; 1x PBS</td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>İnvitrojen</td><td>10687010</td><td></td></tr> T7'de mg / ml stoğu <tr><td>Büyük ölçekli RNA Üretim Sistemi</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Her reaksiyondan yaklaşık dsRNA konsantrasyonu yaklaşık 5-15 & nbsp'dir; &mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR temizleme kiti</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&nbsp; 1x PBS'de çözülerek yapılan mg / ml çözeltisi.</td></tr><tr><td>Haşlanmış Eşek Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>1x PHEM tamponunda% 5 stok çözeltisi, çözeltiyi kaynatın. 4&nbsp'de saklanır; &deg;C.</td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td></td><td></td><td>20&nbsp; mM Tris pH 8.0,&nbsp; % 0.5 < > N -propil gallat,% 90 Gliserol. 4&nbsp'de saklanır; &deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM BORULAR pH 6.9; 1&nbsp; mM EGTA; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Beyaz Işık Kaynağı</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filtre Küpü</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filtre Küpü</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antikoru&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1 & alpha tarafından özel olarak üretilmiştir; (anti-&alfa; -tübülin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antikoru</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; drosophila</emkinesin-5 farmakolojik inhibisyonu için&gt; s2 hücre hattı duyarlı

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetokorlar, hücre bölünmesi sırasında sentromerler üzerinde birleşen ve kromozomları iğ mikrotübüllerine bağlayan büyük protein bazlı yapılardır. Genetik materyalin uygun dağılımı, her kromozomdaki kardeş kinetokorların, anafaza ilerlemeden önce zıt iğ kutuplarından mikrotübüllere bağlanarak çift yönelimli hale gelmesini gerektirir. Bununla birlikte, hatalı, çift yönelimli olmayan bağlanma durumları yaygındır ve hücre bölünmesi sırasında bu tür bağlanmaları hem tespit etmek hem de düzeltmek için hücresel yollar mevcuttur. Uygun olmayan kinetokor-mikrotübül etkileşimlerinin kararsızlaştırıldığı süreç, hata düzeltme olarak adlandırılır. Canlı hücrelerde hata düzeltmeyi incelemek için, kinesin-5 motorunun kimyasal inhibisyonu yoluyla kasıtlı olarak yanlış ataşmanlar üretilir, bu da monopolar iğ düzeneğine yol açar ve ilacın yıkanmasını takiben yanlış oryantasyondan çift oryantasyona geçiş gözlenir. Birçok model doku kültürü hücre tipindeki çok sayıda kromozom, bireysel hata düzeltme olaylarının gözlemlenmesinde bir zorluk teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücreleri, en az 4 çift kromozoma sahip oldukları için bu tür çalışmalar için daha iyi deneklerdir. Bununla birlikte, küçük moleküllü kinesin-5 inhibitörleri Drosophila kinesin-5'e (Klp61F) karşı etkisizdir. Burada, hücreleri motorun farmakolojik inhibisyonuna duyarlı hale getiren ve hücre bazlı hata düzeltme testinde kullanıma uygun hale getiren Klp61F'yi insan kinesin-5 ile etkili bir şekilde değiştiren bir Drosophila hücre hattının nasıl oluşturulacağını açıklıyoruz.

Klp61F bipolar iğ oluşturmak için gereklidir. İnsan kinesin-5, Eg5, Drosophila S2 hücrelerinde (Şekil 1 A ve D) Klp61F işlevini kurtarmak. Kinesin-5 inhibitörünün (STLC) eklenmesi üzerine, başarılı bir RNAi üzerine endogen Klp61F olmayan hücrelere bir monopol (Şekil 1C ve F) &#39;de elde edilen, motor damla (Şekil 1B ve E) ve iğ kaymalarının mikrotübüle bağlı seviyeleri (Ek film 1). Bu kinesin-5 etkisi insana ait hücrelerde mili çift kutuplu korumak için gerekli değildir, çünkü, bipolar iğ insanlaştırılmış S2 hücrelerinde STLC ilave edilmesi üzerine çökmeye olması dikkat çekicidir. Bu ilginç bir farklılık, iki model sistemlerinde 14 interpolar mikrotübül üst üste ve / veya stabilite farklılıkların bir sonucu olabilir. Kinesin-5 inhibisyonu (Şekil 2A ve E) Reve edilebilir<html> iki kutuplu bir milin ilaç ve geri kazanım yıkanarak rsed zaman içerisinde takip edilebilir. Inhibitörünün (Şekil 2B ve F) çıkarılması üzerine, Eg5-MCherry iki kutuplu bir mili kurullarının (Şekil 2C ve G) olarak mikrotubul-ortakları tekrar ve hücreler, iki kutuplu anafaz (Şekil 2D ve H, Ek film 2 içine ilerleyebilir ). <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> 1. Toplama 1 mcM STLC Şekil Drosophila S2 hücrelerinde monopolar miller yol açar. Temsili görüntüleri Eg5-mCherry (AC) ve GFP-α-tubulin (DF) ifade eden bir Drosophila S2 hücresi time-lapse görüntüleme 1 mcM eklenmesi sırasında STLC. Eg5 önleyicisi 3 dakika ilave edildi. Ölçek çubuğu = 5 um. Zaman Damgası = dk: sn.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Şekil 2. STLC uzaklaştırılması üzerine bir bipolar mili reformları. Bir STLC yıkama deney sırasında Eg5-mCherry (AD) ve GFP-α-tubulin (EH) ifade eden bir Drosophila 2 hücre time-lapse görüntüleme Temsilcisi görüntüler. STLC 5 dakikada yıkandı. STLC kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Ölçek çubuğu = 5 um. Timestamp: dk:. Sn <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Ek Film 1. (sağ indirmek için tıklayın). Widefield floresan görüntüleme Eg5-mCherry ifade eden Drosophila S2 hücresinin bir temsilcisi örnek ( sol) ve GFP-α-tubulin (sağ) 1 uM STLC 2 dakikada ilave edildi ve mili formları inhibitörün ilave edildikten sonra 10 dakika içinde, bir tek kutuplu. Görüntüler her 1 dakika satın almış ve 10 kare bir oranda oynamıştır. saniyede. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Ek Film 2. (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Eg5-mCherry (solda) ve GFP-α-tubulin (sağda) ifade eden bir Drosophila S2 hücre temsili örnek Widefield floresan görüntüleme. 1 uM STLC ihtiva Ortam çıkarıldı ve5 dk çalkalandı. Inhibitörü kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Görüntüler her 1 dk edinilen ve saniyede 10 kare hızında çalındı. Ölçek çubuğu = 5 um.

Bu protokol, kinesin-5'in küçük moleküllü inhibitörlerine duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattının nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu hücrelerin hücre tabanlı bir hata düzeltme testinde kullanımı da ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; Drosophila</emKinesin-5 Farmakolojik inhibisyonu için&gt; S2 Hücre Hattı Duyarlı

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Bu deneyin genel amacı, hata düzeltme süreçlerinin incelenmesinde kullanılabilmeleri için Kinesin-5 motorunun küçük molekül inhibitörlerine duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattı oluşturmaktır. Hücre bölünmesi sırasında hata düzeltme, hatalı kinetokor ve mikrotübül etkileşimlerinin kararsız hale getirildiği, böylece hücreye uygun bağlantılar kurması için ikinci bir şans veya başka bir fırsat tanındığı ve genomun doğru şekilde ayrıştırılabildiği bir süreçtir. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanında hata düzeltme süreciyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, daha az kromozoma sahip olan ve Kinesin-5 inhibitörüne duyarlı olan bir Drosophila S2 hücre hattı kullanabilmemizdir; her iki durum da bireysel hata düzeltme olaylarının görselleştirilmesini kolaylaştırır. Daha önce kültüre edilmiş, %100 konfluens düzeyinde GFP-Alfa Tübülin eksprese eden S2 hücreleri içeren 25 santimetrekarelik bir flask ile başlayarak, kültürden iki mililitreyi 35 milimetrelik bir kaba aktarın. Ardından, hücrelerin yarı-adezyon sağlaması için oda sıcaklığında yaklaşık bir saat inkübe edin.Besiyerini kaptan uzaklaştırın ve üretici protokolünü izleyerek hücreleri transfekte etmek için FBS ile takviye edilmiş bir mililitre Schneider besiyerini, iki mikrogram Eg5-mCherry konstrüktü ve transfeksiyon reaktifi ile birlikte ekleyin. Kabı mühürlemek için Parafilm kullanın ve hücreleri 25 °C'de 16 ila 18 saat inkübe edin. Ardından bir mililitre Schneider besiyeri ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.Transfeksiyondan sonraki üçüncü günde, test indüksiyonu için transfected hücrelerin 500 microliters'ını, içinde 1.5 milliliters Schneider's medium bulunan yeni bir 35 millimeter doku kültürü kabına aktarın. Eg5-mCherry ekspresyonunu indüklemek için, son konsantrasyonu 500 micromolar olacak şekilde bakır sülfat ekleyin. Kabı Parafilm ile mühürleyin ve 25 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin.Önceden hazırlanmış 22 milimetre x 22 milimetre boyutlarında, Concanavalin A kaplı bir lamelini temiz bir 35 milimetrelik doku kültürü kabına yerleştirin. Ardından, %100 konfluen hale gelmiş indüklenmiş hücrelerden 500 mikrolitreyi lamelin üzerine ekin ve hücrelerin oda sıcaklığında yapışmasını sağlayın. Eg5-mCherry ekspresyonunu kontrol etmek için, lameli besiyeri ile birlikte bir rose chamber düzeneğine yerleştirin ve metin protokolündeki yönergeleri takip ederek oda sıcaklığında bir floresan mikroskop ile görüntüleyin.Hücrelerin hem Eg5-mCherry hem de GFP alfa tubulin eksprese ettiğinden emin olduktan sonra, transfekte edilmiş indüklenmemiş hücrelerin geri kalanını dört mililitre Schneider ortamı içeren 25 santimetre karelik bir doku kültürü flaskına aktarın. Flaska nihai konsantrasyonu 25 µg/mL olacak şekilde Blasticidin S HCL ekleyin ve hücre ölümü durana kadar hücreleri Blasticidin S HCL varlığında bölmeye devam edin. KLP61F çift sarmallı RNA'yı metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, Eg5-mCherry eksprese eden S2 hücrelerini %25 konfluensle 35 milimetrelik bir kültür kabına ekin ve bir saat boyunca yapışmalarını bekleyin.Besiyerini kaplardan uzaklaştırın ve beş mikrogram çift zincirli KLP61F RNA'ya bir mililitre serumsuz Schneider besiyeri ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe ettikten sonra, %10 FBS içeren bir mililitre Schneider besiyeri ekleyin. Hücreleri 25 °C'de inkübe edin.dsRNA uygulamasından 24 saat sonra, nihai konsantrasyonu 500 micromolar olacak şekilde bakır sülfat ekleyerek Eg5-mCherry ekspresyonunu indükleyin. Hücreleri 25 degrees Celsius sıcaklıkta 24 saat daha inkübe edin. Canlı hücre görüntülemesi yapmak için, 22 millimeter x 22 millimeter boyutunda Concanavalin A kaplı bir lamelini temiz bir 35 millimeter doku kültürü kabına yerleştirin.Gece boyunca indüklenmiş, dsRNA ile işlem görmüş hücrelerin 500 mikrolitresini lam üzerine ekleyin ve yaklaşık bir saat boyunca yapışmalarını bekleyin. Metin protokolüne uygun olarak bipolar iğciklerin zaman ayarlı görüntülerini topladıktan sonra, rose chamber'dan besiyerini uzaklaştırın ve bir mikromolar STLC içeren Schneider besiyeri ekleyin; iğcik çökmesini görselleştirmek için, her yıkamadan sonra besiyerini atarak STLC besiyerini iki kez daha yenileyin. İlacı yıkamak ve iğcik çökmesini geri döndürmek için, STLC içeren besiyerini rose chamber'dan dikkatlice çekip bir atık kabına boşaltın ve hücreleri dört kez yıkamak için toplam 6 ila 8 mililitre Schneider besiyeri kullanın, her yıkamadan sonra besiyerini atın.Ardından, bölmeyi doldurmak için taze besiyeri ekledikten sonra görüntüleme işlemine devam edin. İlaç yıkama ve temizleme işlemleri için besiyerine erişmek amacıyla, mikroskop üzerindeyken rose bölmesinin üst lamelini dikkatlice çıkarın. Alternatif olarak, canlı hücre görüntüleme için lamelere benzer şekilde Concanavalin A ile işlem görmüş cam tabanlı bir Petri kabı kullanılabilir.KLP61F dsRNA ile işlem görmüş 500 mikrolitre S2 hücresi Concanavalin A lameli üzerine ekilip hücrelerin yapışması beklendikten sonra, final hacmi iki mililitreye tamamlamak için 1,5 mililitre Schneider besiyeri ekleyin. Hücreler metin protokolüne uygun olarak mitozda durdurulduğunda, monopollerin oluşmasını sağlamak için bir mikromolar STLC ekleyin ve bir saat inkübe edin. Lamelleri üç kez durulamak için iki mililitre taze Schneider besiyeri kullanarak STLC'yi yıkayarak uzaklaştırın.Bipolar iğ oluşumunun farklı zaman noktalarında hücreleri sabitlemek ve kinetokor bağlanma bölgelerini değerlendirmek için, öncelikle lamelleri hızlıca durulamak amacıyla iki mililitre 1X BRB80 kullanın. Bir kimyasal çeker ocakta, 1X BRB80 içinde iki mililitre %10 PFA ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücreleri permeabilize etmek için 1X PBS içinde %1 Triton X ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, hücreleri üç kez yıkamak için 1X PBS içinde %0,1 Triton X'den iki mililitre kullanın. Sonrasında, lamelin hücre tarafı yukarı bakacak şekilde, 150 milimetrelik bir Petri kabı içindeki bir Parafilm tabakasına aktarın. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için lamel üzerine 150 mikrolitre Kaynatılmış Eşek Serumu (Boiled Donkey Serum, BDS) ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.İnkübasyonun ardından bloğu çıkarın ve metin protokolüne göre hazırlanan 150 µL primer antikor ekleyerek oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Lamel kapaklarını üç kez yıkadıktan sonra, BDS içinde seyreltilmiş Fluoro-4 konjugeli sekonder antikorlar ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. Lamel kapakları üç kez yıkandıktan sonra, bunları mililitre başına 1 µg DAPI içeren 150 µL BDS ile beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, lameller iki kez yıkandıktan sonra, örneği hücre tarafı aşağı gelecek şekilde 3x1 inçlik bir lam üzerine monte etmek için sekiz µL montaj medyumu kullanın. Köşeleri boyamak için oje kullanın. Son olarak, Eg5-mCherry eksprese eden bipolar iğciklere sahip hücreleri görüntülemek için 100X objektif kullanın.Tüm kanallarda 0,2 µm aralıklarla 30 düzlemden oluşan bir Z serisi çekin. Bağlanma durumunu belirlemek için kinetokoru ve mikrotübülleri dikkatle analiz edin. KLP61F, Drosophila S2 hücrelerinde bipolar iğlerin oluşumu için gereklidir; ancak, küçük moleküllü Kinesin-5 inhibitörleri buna karşı etkisizdir.Bu görüntüler, insan Kinesin-5 Eg5'in Drosophila S2 hücrelerinde KLP61F fonksiyonunu geri kazandırabildiğini göstermektedir. Kinesin-5 inhibitörü STLC eklendiğinde, motor proteinin mikrotübülle ilişkili seviyeleri düşer ve iğ iplikleri çöker; bu durum, başarılı RNAi sonucunda endojen KLP61F'den yoksun hücrelerde tek kutuplu bir yapı ile sonuçlanır. Bu şekil, Kinesin-5 inhibisyonunun ilacın yıkanarak uzaklaştırılmasıyla geri döndürülebileceğini ve bipolar iğ ipliklerinin yeniden oluşumunun zaman içinde takip edilebileceğini kanıtlamaktadır. İnhibitör kaldırıldığında, Eg5-mCherry mikrotübüllerle yeniden ilişkilendirilir ve hücreler bipolar anafaza ilerleyebilir.Bu videoyu izledikten sonra, Kinesin-5'in küçük moleküllü bir inhibitörüne duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken önceden planlama yapmak önemlidir, çünkü bu yöntem birkaç gün önceden hazırlık gerektirir.Küçük molekül inhibitörleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle her zaman eldiven kullanın. İnsanlaştırılmış meyve sineği hücrelerinin oluşturulduğu, Crispr-Cas 9 teknolojilerinin uygulanması ve Drosophila Kinesin-5'in insan karşılığı ile değiştirilmesi yoluyla kanıtlanabilir. İnsanlaştırılmış Drosophila hücrelerinin geliştirilmesi, gelecekte hata düzeltme ve diğer temel hücresel süreçlere dair anlayışımızı ilerletmelidir.

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila Schneider (S2) hücreleri genlerin keşfi ve fonksiyonel analiz için giderek daha popüler bir sistem. Amacımız giderek daha önemli bir deneysel sistem S2 hücrelerin mikroskobik teknikler bazı tanımlamak için.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir...

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Drosophila hayali diskleri boyanırken, genellikle disklerin açıkta kaldığı ancak vücuda bağlı kaldığı kaba bir diseksiyon yapılır. Lekelendikten sonra, ilgilenilen diskler izole edilir ve monte edilir. Örnek protokol, kanat hayali disk diseksiyonu ve montajı için bir prosedürü göstermektedir.

Drosophila Larva Hayali Disk Diseksiyonu: Gelişmekte Olan Epiteli Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu protokol, Drosophila melanogaster pupalarından elde edilen sağlam testislerin ve germ hattı kistlerinin diseksiyonunu ve kültivasyonunu tanımlar. Bu yöntem, spermatogenezin ex vivo mikroskobik olarak gözlemlenmesine izin verir. Ayrıca, inhibitörlerin pupa testislerde germ hücresi gelişiminin belirli aşamaları üzerindeki etkisinin farmakolojik bir analizini tarif ediyoruz.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disk Epiteli

Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster'deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Öğrenin, Drosophila S2 hücre hattında kinesin-5 inhibitörlerine duyarlı hücreler oluşturarak hücre bölünmesi sırasında hata düzeltme mekanizmalarını canlı görüntüleme yöntemiyle nasıl çalışılacağını.

Bir "humanize" oluşturuluyor

Daha fazla video keşfet