Bir "humanize" oluşturuluyor Drosophila S2 Hücre Hattı Duyarlı

Bu deneyin genel amacı, Kinesin-5 motorunun küçük moleküllü inhibitörlerine duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattı oluşturmaktır, böylece hata düzeltmeyi incelemek için kullanılabilirler. Hücre bölünmesi sırasında hata düzeltme, hücreye ikinci bir şans veya uygun ekler oluşturmak için başka bir fırsat vermek için hatalı kinetokor ve mikrotübül etkileşimlerinin belirlendiği bir süreçtir, böylece genom düzgün bir şekilde ayrılabilir. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki hata düzeltme süreciyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, daha az kromozoma sahip ve bir Kinesin-5 inhibitörüne duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattı kullanabilmemizdir, her ikisi de bireysel hata düzeltme olaylarının görselleştirilmesini kolaylaştırır. S2 hücrelerini eksprese eden% 100 birleşik GFP-Alfa Tubulin'in önceden kültürlenmiş 25 santimetre karelik bir şişesi ile başlayarak, kültürün iki mililitresini 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Daha sonra, hücreleri yarı yapışması için yaklaşık bir saat oda sıcaklığında inkübe edin.

Ortamı tabaktan çıkarın ve üreticinin protokolünü izleyerek hücreleri transfekte etmek için iki mikrogram Eg5-mCherry yapısı ve transfeksiyon reaktifine FBS ile takviye edilmiş bir mililitre Schneider ortamı ekleyin. Çanağı kapatmak için Parafilm kullanın ve hücreleri 16 ila 18 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Sonra bir mililitre Schneider ortamı ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.

Transfeksiyondan sonraki üçüncü günde, 500 mikrolitre transfekte edilmiş hücreyi, bir test indüksiyonu için 1.5 mililitre Schneider besiyeri içeren yeni bir 35 milimetre doku kültürü kabına aktarın. Eg5-mCherry ekspresyonunu indüklemek için, 500 mikromolar nihai konsantrasyona bakır sülfat ekleyin. Çanağı Parafilm ile kapatın ve gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

Önceden hazırlanmış 22 milimetre x 22 milimetre Concanavalin A kaplı bir kapak fişini temiz bir 35 milimetre doku kültürü kabına yerleştirin. Daha sonra% 100 birleşik indüklenmiş hücrelerin 500 mikrolitresini kapak kızağına tohumlayın ve hücrelerin oda sıcaklığında yapışmasına izin verin. Eg5-mCherry ifadesini kontrol etmek için, metin protokolündeki yönergelere göre, kapak fişini bir floresan mikroskobu kullanarak oda sıcaklığında orta ve görüntü içeren bir gül odasına monte edin.

Hücrelerin hem Eg5-mCherry hem de GFP alfa tübülini eksprese ettiğinden emin olduktan sonra, transfekte edilmiş, indüklenmemiş hücrelerin geri kalanını, dört mililitre Schneider ortamı içeren 25 santimetre karelik bir doku kültürü şişesine aktarın. Şişeye mililitre başına 25 mikrogramlık bir son konsantrasyonda Blasticidin S HCL ekleyin ve hücre ölümü durana kadar hücreleri Blasticidin S HCL varlığında bölmeye devam edin. Metin protokolüne göre KLP61F çift sarmallı RNA'yı hazırladıktan sonra, Eg5-mCherry eksprese eden S2 hücrelerini %25 birleşmede 35 milimetrelik bir kültür kabına tohumlayın ve bir saat boyunca yapışmalarına izin verin.

Ortamı bulaşıklardan çıkarın ve bir mililitre serumsuz Schneider'in orta ila beş mikrogram çift sarmallı KLP61F RNA'sını ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe ettikten sonra,% 10 FBS içeren bir mililitre Schneider ortamı ekleyin. Hücreleri 25 santigrat derecede inkübe edin.

dsRNA işleminden 24 saat sonra, 500 mikromolar nihai konsantrasyona bakır sülfat ekleyerek Eg5-mCherry ekspresyonunu indükleyin. Hücreleri 24 saat daha 25 santigrat derecede inkübe edin. Canlı hücre görüntülemesi yapmak için, 22 milimetreye 22 milimetre Concanavalin A kaplı bir kapak fişini temiz bir 35 milimetre doku kültürü kabına yerleştirin.

Gece boyunca indüklenen dsRNA ile muamele edilmiş hücrelerin 500 mikrolitresini kapak kayması üzerine tohumlayın ve yaklaşık bir saat boyunca yapışmalarına izin verin. Metin protokolüne göre bipolar iğlerin hızlandırılmış görüntülerini topladıktan sonra, ortamı gül odasından çıkarın ve bir mikromolar STLC içeren Schneider ortamını ekleyin ve STLC ortamını iki kez daha değiştirin, her yıkamadan sonra ortamı atın iğ çöküşünü görselleştirmek için. İlacın yıkanması ve iğ çökmesinin tersine çevrilmesi için, STLC içeren ortamı gül haznesinden dikkatlice çıkarın ve bir atık kabına atın ve hücreleri dört kez yıkamak için toplam 6 ila 8 milimetre Schneider ortamı kullanın, her yıkamadan sonra ortamı atın.

Ardından, hazneyi yeniden doldurmak için taze ortam ekledikten sonra görüntülemeye devam edin. İlaç yıkama ve yıkama ortamına erişmek için, mikroskopta sabitlenirken üst kapak kayışını gül haznesinden dikkatlice çıkarın. Alternatif olarak, canlı hücre görüntüleme için kapak fişlerine benzer şekilde Concanavalin A ile muamele edilmiş cam tabanlı bir Petri kabı kullanılabilir.

KLP61F dsRNA ile muamele edilmiş 500 mikrolitre S2 hücresinin bir Concanavalin A örtü fişi üzerine ekilmesinden ve hücrelerin yapışmasına izin verilmesinden sonra, son hacmi iki mililitreye getirmek için 1,5 mililitre Schneider ortamı ekleyin. Hücreler metin protokolüne göre mitozda tutuklandıktan sonra, bir mikromolar STLC ekleyin ve monopollerin oluşmasına izin vermek için bir saat inkübe edin. Kapak fişlerini üç kez durulamak için iki mililitre taze Schneider ortamı kullanarak STLC'yi yıkayın.

Hücreleri bipolar iğ oluşumunun farklı zaman noktalarında sabitlemek ve kinetokor bağlantı yerlerini değerlendirmek için, kapak fişlerini hızlı bir şekilde durulamak için iki mililitre 1X BRB80 kullanarak başlayın. Kimyasal bir davlumbazda, 1X BRB80'e iki mililitre% 10 PFA ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelere nüfuz etmek için 1X PBS'ye% 1 Triton X ekleyin ve 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra hücreleri üç kez yıkamak için 1X PBS'de iki mililitre% 0.1 Triton X kullanın. Daha sonra, kapak fişini, hücre tarafı yukarı bakacak şekilde, 150 milimetrelik bir Petri kabındaki bir Parafilm tabakasına aktarın. Kapak fişlerine 150 mikrolitre Haşlanmış Eşek Serumu veya BDS ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, bloğu çıkarın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeden önce metin protokolüne göre hazırlanmış 150 mikrolitre primer antikor ekleyin. Kapak fişlerini üç kez yıkadıktan sonra, BDS içinde seyreltilmiş Floro-4 konjuge ikincil antikorları ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. Kapak fişleri üç kez yıkandıktan sonra, beş dakika boyunca mililitre DAPI başına bir mikrogram içeren 150 mikrolitre BDS ile inkübe edin.

Daha sonra, kapak kızakları iki kez yıkandıktan sonra, numuneyi hücre tarafı aşağı bakacak şekilde üçe bir inçlik bir slayta monte etmek için sekiz mikrolitre montaj ortamı kullanın. Köşeleri boyamak için oje kullanın. Son olarak, Eg5-mCherry ifade eden bipolar iğlere sahip hücreleri görüntülemek için 100X'lik bir objektif kullanın.

Tüm kanallarda 0,2 mikrometre aralıklarla 30 düzlemden oluşan bir Z serisini ele alalım. Bağlanma durumunu belirlemek için kinetokor ve mikrotübülleri dikkatlice analiz edin. KLP61F, Drosophila S2 hücrelerinde bipolar iğler oluşturmak için gereklidir; bununla birlikte, küçük moleküllü Kinesin-5 inhibitörleri buna karşı etkisizdir.

Bu görüntüler, insan Kinesin-5 Eg5'in Drosophila S2 hücrelerinde KLP61F'nin işlevini kurtarabildiğini göstermektedir. Kinesin-5 inhibitörü, STLC eklendiğinde, motorun mikrotübül ile ilişkili seviyeleri düşer ve iğ çöker, bu da başarılı RNA I'in bir sonucu olarak endojen KLP61F'den yoksun hücrelerde bir monopol ile sonuçlanır. İnhibitörün çıkarılmasından sonra, Eg5-mCherry mikrotübüllerle yeniden birleşir ve hücreler bipolar bir anafaza ilerleyebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, küçük moleküllü bir Kinesin-5 inhibitörüne duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık altı saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, önceden plan yapmak önemlidir, çünkü bu yöntem birkaç gün önceden hazırlık gerektirir.

Küçük molekül inhibitörleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle her zaman eldiven giyin. İnsanlaştırılmış meyve sineği hücrelerinin oluşturulması, Crispr-Cas 9 teknolojilerinin uygulanması ve Drosophila Kinesin-5'in insan muadili ile değiştirilmesiyle kanıtlanabilir. İnsanlaştırılmış Drosophila hücrelerinin geliştirilmesi, gelecekte hata düzeltme ve diğer temel hücresel süreçler hakkındaki anlayışımızı ilerletmelidir.