Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme
5 Şubat 2016
GFP transgenik arka planlarında in vivo hücre takibi için güçlü, basit ve uygun maliyetli bir araç olarak fotoconvertible PSmOrange sistemini kurduk. Bu protokol, zebra balığı model sistemindeki uygulamasını açıklar.
PSmOrange Fotoğraf Dönüştürme Teknolojisinin genel amacı, embriyonik gelişim ve hastalık sırasında canlı hayvandaki hücreleri izlemektir. Bu yöntem, doku ve organlara dönüşen hücrelerin kökenini ortaya çıkarmak gibi gelişim biyolojisindeki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, GFP transgenik arka planlarında uygulanabilmesidir.
Bu yöntem aynı zamanda rejenerasyon, tümör ilerlemesi ve invazyonu gibi farklı araştırma alanlarında da uygulanabilir. Metin protokolüne göre PSmOrange ve GFP eksprese eden embriyoları oluşturup gömdükten sonra, embriyoyu konfokal mikroskobun altına yerleştirin ve fotokonvertör için bir alanı belirlemek üzere numuneyi taramak için 20x hava objektifi ve 488 ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Fotokonversiyondan önce PSmOrange proteinini tespit etmek için, objektifin üzerindeki odak düzleminde ölçülen 0,74 miliwatt güçte 561 nanometre lazeri kullanın ve lazer gücünü gerektiği gibi ayarlayın.
İlgilenilen alanı vurgulamak ve görüntü elde etme süresini ve fotoğraf toksisitesini azaltmak için yakınlaştırma faktörlerini ayarlayın. 488 ve 561 nanometre lazerleri sıralı modda ve 1.0 ile 2.0 mikrometre arasında bir Z adımını kullanarak, ilgilenilen yapıları kapsayan bir Z yığını elde edin. Görüntü kalitesini optimize etmek için çizgi ortalamasını ve tarama frekansını ayarlayın.
Ardından numuneyi tarayın ve ROI'yi stimülasyon alanı olarak sabitlemeden önce fotodönüştürülecek alanı vurgulamak için ilgilenilen bölgeyi veya ROI aracını seçin. Fotoaktivasyon ağartma modülünü seçin, 488 nanometre lazeri etkinleştirmek için kutuyu işaretleyin, ardından 488 nanometre lazeri %80'e ve tarama hızını kare başına 0,5 saniyeye ayarlayın. Ardından, fotoğraf dönüştürme yardımcı programını açın ve fotoğraf dönüştürme protokolünü belirtmek için Ekle'ye tıklayın.
Edinme stimülasyonu menüsünde, Birinci Aşama'yı edinim olarak ayarlayın ve döngüler menüsünde, fotodönüştürmeden önce alınacak görüntü sayısını belirtin. İkinci Aşamayı stimülasyona ayarlayın ve gerçekleştirilecek stimülasyon olaylarının sayısını girin. Üçüncü Aşamayı, Birinci Aşama için açıklandığı gibi ayarlayın.
İsteğe bağlı olarak, görüntü alımının son turundan önce beklenecek süreyi girerek İkinci Aşamadan sonra bir Bekleme Aşaması ekleyin. Parametreler ayarlandıktan sonra, stimülasyon ayarını uygulayın ve fotodönüşümü çalıştırın. PSmOrange foto dönüştürme için yanlış çözünürlüklü ayarlar çok önemlidir.
Başarılı bir fotodönüşüm sağlamak için, fotokonvertif PSmOrange proteinini tespit etmek için embriyo deneyden hemen sonra görüntülenir. Dönüştürme başarılı olmazsa, prosedür tekrarlanır. 488, 561 ve 640 nanometre lazerleri kullanarak ve 640 nanometre lazeri 4,5 miliwatt'a kadar yüksek güce ayarlayarak, az önce açıklanan ayarlarla son bir z yığını elde edin.
Embriyoyu sökmek için, odayı mikroskoptan çıkarın ve embriyoyu agarozdan çıkarmak için forseps kullanın. Embriyoyu E3'te 0.2 milimolar PTU içeren yeni bir sterilize plastik petri kabına veya sterilize edilmiş 6 oyuklu plakaya aktarın. İstenilen gelişim aşamasına kadar embriyoyu 28 santigrat derecede inkübe edin. Fotodönüştürülmüş PSmOrange proteini eksprese eden hücrelerin kaderini analiz etmek için, embriyoyu metin protokolüne göre yeniden gömün.
Konfokal miskroskop altında, ilgilenilen GFP transgenik yapısındaki fotokonvertif hücreleri tanımlamak için numuneyi tarayın. 488, 561 ve 640 nanometre lazerleri, yapıları kaplayan sıralı modda 1 ila 2 mikrometrelik sabit bir yığına sahip bir z yığını elde etmek için kullanın. Image J Fiji yazılımını kullanarak, GFP'yi ve fotokonvertize proteini birlikte eksprese eden hücreleri tanımlayın.
Orijinal yığını çoğaltın, düzgün yığınları orijinalden çıkarmak için Gaussian Blur eklentisini ve görüntü hesaplayıcıyı kullanın. Fotodönüştürülmüş hücreleri vurgulamak için yeşil ve uzak kırmızı kanallara belirli eşikler uygulayın. Ardından, uygun bir ayarla yeşil kanaldaki eşik alanlarını tespit etmek için Parçacıkları Analiz Et aracını kullanın.
Uzak kırmızı kanal için bu adımı tekrarlayın. Birlikte yerelleştirici hücreleri algılamak için görüntü hesaplayıcı eklentisini açın. Parçacıkları Analiz Et aracını kullanarak çakışan ROI'leri yeşil veya uzak kırmızı kanalda sarı renkte görüntüleyin.
NIS-Elements yazılımını kullanarak, 3B tarih değerlendirmesi yapın ve Hacim Görünümünü Göster seçeneğini kullanarak yığını 3B olarak görüntüleyin. Ardından yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı kanalları seçmek, parlaklığı ve kontrastı ayarlamak ve fotoğrafa dönüştürülen alanı vurgulamak için 3B yığınını kırpmak için grafik arayüzünü kullanın. Burada, zebra balığı transgenik FOXD3 yüzen kafa GFP embriyolarında PSmOrange fotokoversiyon sisteminin bir örneği gösterilmektedir.
Döllenmeden 26 saat sonra, epifizin ön kısmındaki iki hücre kümesi fotokontekste dönüştürüldü ve hemen görüntülendi. Protein, 640 nanometre uzak kırmızı lazerle tespit edildi, ancak 561 nanometre lazerle tespit edilmedi. Bu hücrelerde, GFP ekspresyonu başlangıçta foto ağartma nedeniyle azalmıştır.
52 HPF'de, fototransforme edilmiş H2B PSmOrange protein eksprese eden hücrelerde GFP ve H2B PSmOrange tespit edildi. Bu hücrelerden birkaçı beynin sol tarafında parapineal formu oluşturdu. Bu sonuç, anterior pinealdeki parapineal hücre orijini ile ilgili önceki raporlarla tutarlıdır ve PSmOrange tekniğinin canlı GFP transgenik omurgalı embriyosunda uygulanabilirliğini göstermektedir.
Bu prosedürü takiben, hücrenin gelişiminin altında yatan moleküler hiyerarşilerle ilgili ek soruları yanıtlamak için genetik olarak manipüle edilmiş embriyolarda hücre izleme analizi yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
PSmOrange sistemi, özellikle zebra balığı modellerinde, GFP transgenik arka planlarda in vivo hücre izleme için maliyet etkin bir araçtır. Bu protokol, embriyonik gelişim ve hastalık sırasında hücre kökenlerinin incelenmesini kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Hücre Takibi
- Embriyonik Gelişim
Arka Plan
- PSmOrange Fotokonversiyon Teknolojisi, canlı organizmalardaki hücrelerin takibine olanak tanır.
- Bu yöntem, rejenerasyon ve tümör progresyonu dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarında uygulanabilir.
- GFP transgenik arka planlarda kullanılabilmesi, yöntemle ilgili çok yönlülüğü artırmaktadır.
- Hücrelerin görüntülenmesi ve fotokonversiyonu için konfokal mikroskopi kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik gelişim ve hastalık süreçleri boyunca hücreleri takip etmek.
- Dokulara ve organlara dönüşen hücrelerin kökenlerini ortaya çıkarmak.
- Çeşitli biyolojik bağlamlardaki hücresel davranışlar hakkında içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- PSmOrange ve GFP eksprese eden embriyoların üretimi.
- Konfokal mikroskopi analizi için embriyoların gömülmesi.
- Görüntüleme için 488 ve 561 nm lazerlerin kullanımı.
- Takip amaçlı PSmOrange proteininin fotokonversiyonu.
Ana Sonuçlar
- PSmOrange sisteminin kullanılarak zebra balığı modellerinde hücrelerin başarıyla takibi.
- Hücresel kökenlerin ve davranışların görselleştirilebildiğinin kanıtlanması.
- Yöntemin çeşitli biyolojik araştırma alanlarındaki uygulanabilirliğinin vurgulanması.
- Araştırmacıların takip edebileceği basit bir protokolün sunulması.
Sonuçlar
- PSmOrange sistemi, in vivo hücre takibi için etkili bir araçtır.
- Gelişimsel biyolojinin incelenmesinde önemli avantajlar sunar.
- Bu yöntem, karmaşık biyolojik süreçlerin anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
PSmOrange fotokonvertibl protein sistemi, mevcut transgenik hatların soy takibi için uyumlu raporörlardan yoksun olduğu gelişimsel biyoloji araştırmalarındaki temel bir kısıtlamayı gidererek, GFP transgenik zebra balığı embriyolarında hassas in vivo hücre takibini mümkün kılar. Bu yetenek, özellikle tümör progresyonu, invazyonu ve doku rejenerasyonu ile ilgili onkoloji ve rejeneratif tıp uygulamalarında, hastalıkla ilişkili sistemlerde hücresel kökenlerin ve kader kararlarının doğrudan görselleştirilmesine izin vererek hedef doğrulamadaki mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Yöntem, sağlam ve canlı organizmalar içinde hücre göçü ve farklılaşmasına dair kantitatif ve mekansal olarak çözümlenmiş veriler sağlayarak preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Dokuların ve organların hücresel kökenlerini açıklığa kavuşturmak için transgenik arka planlarda tanımlanmış hücre popülasyonlarını takip ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Mevcut GFP transgenik hatlarıyla uyumlu olup yeni promotör oluşturma ihtiyacını ortadan kaldırır ve model geliştirme süresini kısaltır.
- Öngörücü Değer: Hücre kader kararlarının doğrudan gözlemlenmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekleyerek, hedef-hastalık mekanizması ilişkilerine olan güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fotokonverte hücre göçüne dair nicelleştirilebilir mekansal ve zamansal veriler üreterek, genetik veya farmakolojik perturbasyonların objektif karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Tipik görüntüleme merkezlerinin ötesinde özel bir ekipman gerektirmeksizin, ardışık lazer uyarımı (488, 561, 640 nm) ile standart konfokal mikroskopi kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: GFP ile tekrarlanabilir ko-lokalizasyon analizi için yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme ve son işlem araçlarıyla (ImageJ Fiji, NIS-Elements) uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişki: Zebrafish xenograft veya transgenik kanser modellerinde tümör hücresi invazyonu ve metastaz modellerinin incelenmesinde doğrudan uygulanabilir.
- Translasyonel Süreklilik: Fotokonverte hücrelerin in vivo tutunmasını, migrasyonunu ve entegrasyonunu izleyerek, keşif (hücre kökeni takibi) aşamasından preklinik doğrulamaya sorunsuz bir geçiş sağlar.
- Risk Ayarlı Kararlar: Hastalıkla ilişkili bağlamlardaki hücresel davranışlara dayanarak, erken preklinik geliştirme süreçlerindeki devam/durdur kararları için görsel ve kantitatif son noktalar sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
PSmOrange sistemi, genetik manipülasyon ile canlı omurgalı modellerdeki fonksiyonel hücresel okumalar arasında köprü kuran bir fenotipik tarama ve mekanistik doğrulama aracı olarak hizmet ederek, erken keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: GFP transgenik embriyolarda genetik veya çevresel pertürbasyonlara yanıt olarak spesifik hücre popülasyonlarının kader haritalamasını sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik veya genetik supresör/enhancer taramaları için uygun, standartlaştırılmış, tekrarlanabilir kantitatif çıktılar (ko-lokalizasyon yüzdeleri, migrasyon mesafeleri) üretir.
- Analitik: Objektif fenotipleme için titiz ko-lokalizasyon ve partikül analizine olanak tanıyan çok kanallı floresan verileri (GFP, turuncu/kırmızı PSmOrange, uzak-kırmızı fotokonverte PSmOrange) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Rejenerasyon ve tümör progresyon modellerinde hücre davranışını takip ederek preklinik çalışmalarla bağ kurar ve hedeflerin mekanistik geçerliliği hakkında bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yeniden kullanılabilir bir platform kapasitesini temsil eder; mRNA enjeksiyonu, yeni stabil suşlar oluşturmaya gerek kalmadan birden fazla transgenik hat boyunca hızlı uygulamaya olanak tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bozulmamış organizmalardaki hücresel dinamiklerin doğrudan görsel kanıtlarını sunarak, hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış fotokonversiyon protokolleri ve lazer ayarlarıyla (488 nm %80 güçte, 0.5 sn/kare; tespit için 640 nm'de 4.5 mW'a kadar) laboratuvarlar arası standardizasyon sağlar.
- Stratejik Değer: Mevcut GFP transgenik kaynaklarından yararlanarak, maliyetli de novo promotör tanımlama ve hat oluşturma süreçlerini önler ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Hücre davranışı hakkında erken dönem in vivo fonksiyonel veriler sunarak, öngörülemeyen biyolojik karmaşıklık nedeniyle oluşan geç aşama başarısızlıklarını azaltır ve riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Konfokal mikroskopi, fotokonversiyon teknikleri ve floresan spektral ayrıştırma konularında uzmanlık gerektirir.
- 488, 561 ve 640 nm lazerlere ve uygun filtre setlerine sahip lazer taramalı konfokal sistemlere erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ROI seçimi, lazer gücü, tarama hızı ve z-stack parametrelerinin kullanıcılar arasında standartlaştırılması gerekir.
- Zebrafish dışındaki teleost türlerine adaptasyon, mRNA dozajının ve fotokonversiyon verimliliğinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Fotokonversiyon verimliliği, protein ekspresyon seviyelerine ve daha kalın dokularda hedef hücrelerin lazer penetrasyonuna erişilebilirliğine bağlıdır.
