Fare Lenfoma Modellerinde İzleme Tümör ilerleme ve Tedavi Etkileri Biyoparlaklık Tabanlı Tümör Niceleme Yöntemi

Bu görüntüleme prosedürünün genel amacı, farklı deneyler içinde veya arasında karşılaştırma yapmak için kantitatif veriler elde etmek amacıyla biyolüminesans elde etme prosedürlerini ve görüntü analizlerini standartlaştırmaktır. Bu yöntem, biyolüminesans görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, görüntüleme verileri tekrarlanabilir bir şekilde nasıl kantifiye edilebilir? Bu tekniğin temel avantajları, biyolüminesans görüntüleme cihazına sahip herhangi bir hayvan tesisinde kurulumunun kolay olması ve karmaşık hesaplamalar gerektirmemesidir.

Görüntüleme cihazını açın ve Görüntüleme yazılımını başlatın. Kamerayı, tablaları ve lensleri başlatmak için Başlat'a tıklayın. Bacak sıkıştırmasına yanıt verilmediği görülerek uygun sedasyon seviyesi onaylandıktan sonra, fareyi bir ısıtma pedine yerleştirin ve göz merhemi uygulayın.

Ardından, taze hazırlanmış 100 µL D-Luciferin potasyum tuzu çözeltisini intraperitonal olarak enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanın. Bu durumda tümör hücreleri ateş böceği lusiferazı eksprese eder. Bu protein, D-Luciferin'i okside ederek görüntüleme sistemiyle tespit edilebilen ışık üretir.

10 dakika sonra fareyi, sırtı kameraya bakacak şekilde, mümkün olduğunca düz bir pozisyonda prone (yüzüstü) olarak görüntüleme cihazına yerleştirin. Otomatik pozlama özelliğini seçin ve hayvanın posterior görüntüsünü elde etmek için Acquire (Kazan) butonuna tıklayın. Ardından, fareyi supine (sırtüstü) pozisyona getirin ve göğüs bölgesini kapatmamaları için ön ekstremiteleri yanlara doğru açın.

Otomatik pozlama onay kutusunun hâlâ seçili olduğundan emin olun ve hayvanın ön kısmının bir görüntüsünü edinin. Ardından, fare tamamen iyileşene kadar ısıtma pedinde tutun; bu noktada hayvan kafesine geri döndürülebilir. Biyolüminesansı nicelleştirmek için menüden View seçeneğine tıklayın ve eğer henüz görüntülenmiyorsa Tool Palette seçeneğini belirleyin.

Ardından, ilgi bölgesi (region of interest) araç sekmesine tıklayın, kontur düğmesini seçin ve Serbest Çizim'i (Free Draw) belirleyin. İlgi bölgesini işaretlemek için Serbest Çizim aracını kullanarak ön görünüm görüntüsündeki farenin tamamının veya belirli bir alanın kenarlarını takip edin ve konturu kapatmak için sağ tıklayın. Resmin sol üst kısmındaki Birimler kaydırma menüsünde Radiance seçili değilse, Radiance'ı seçin.

Ardından, foton akısını ölçmek için Total Flux photons per second kutusundaki değeri okuyun. Daha sonra View menüsüne ve region of interest measurements seçeneğine tıklayın. Analizi arka görünüm görüntüsü için tekrarladıktan sonra, lüminoskoru elde etmek için her iki görünüm için elde edilen foton akısı değerlerini toplayın.

Bu deneyde tümör, enjeksiyondan 10 dakika sonra bile tespit edilebilmiştir. Görüntüler tek başına, tümör hücrelerinin doğru konumda olduğunu doğrulamaktadır. Bununla birlikte, biyolüminesansın nicelleştirilmesi, enjeksiyon yapılan ve yapılmayan hayvanlar arasında belirgin bir fark olduğunu göstermiştir.

İlginç bir şekilde, deri altı modelinde elde edilen sinyal, enjekte edilen hücre sayısıyla tutarlı olarak, primer intraoküler lenfoma modelindekinden 100 kat daha yüksekti. Burada, kontrol ve CpG ile tedavi edilmiş primer intraoküler lenfoma farelerindeki temsili tümör büyüme görüntüleri, yeterli bir süre sonra kontrol grubunda metastazların görülmeye başladığını kanıtlamaktadır. Primer tümör tedaviye duyarlı görünmese de, CpG ile tedavi edilen grupta daha az metastaz gözlemlenmiştir.

Nitekim, her gruptaki tümör yükünün kantitatif analizi, CpG'nin tümör gelişimini yavaşlattığını ve 28 gün sonra tedavi edilen ve kontrol grupları arasındaki tümör lüminesansında istatistiksel olarak anlamlı bir fark oluşturduğunu göstermektedir. Bu subkutan modelde, farelerin her iki yanına iki tümör nakledilmiş, tedavi sıfırıncı günde tek bir tarafa in situ olarak uygulanmış ve karşı taraftaki tümör ise kontrol olarak kullanılmıştır. Ardından fare başına iki ilgi alanı çizilmiş ve tedavi edilen taraf ile kontrol tarafındaki luminoscore arasındaki oran ölçülmüştür.

Tedavi uygulamasından 13 gün sonra, luminoscore oranında belirgin bir azalma gözlemlenmiş ve bu durum, ilgili biyolüminesans görüntüleri ile de desteklendiği üzere, tedavi edilen tümörün resorbe olduğunu ortaya koymuştur. Doğru şekilde uygulandığında, bu analiz hayvan başına iki dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, tümör hücresi homing veya metastaz mekanizmaları hakkındaki ek soruları yanıtlamak için tümör bölgesinin kalitatif lokalizasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, araştırmacıların ve biyolüminesans görüntüleme alanının, preklinik küçük hayvan modellerinde tümör progresyonunu incelemesinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, tümör yükünü tekrarlanabilir bir şekilde nicelleştirmek için biyolüminesans görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Küçük hayvanlarla ve cerrahi aletlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken aletlerin uygun şekilde sterilizasyonu gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.