Name: Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Öğrenin fare antral oositlerini nükleoler kromatin organizasyonuna göre karakterize etme yöntemini. SN ve NSN oositlerini ayırt ederek embriyonik gelişim potansiyelini değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.M. ve C.A.R., Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia'nın (I) Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009'un mali desteğini kabul eder. M.M ve C.A.R., görüntülerin hazırlanmasına yardımcı olduğu için Marianna Longo'ya teşekkür eder.

Bu protokol Avrupa rehber ilkeler (AB 63/2010) ve bilimsel araştırmalar için kullanılan hayvanların korunması İtalyan (26/2014) yasalara uygun olarak yapılmaktadır. Servikal dislokasyon ötenazi yumurtalıkların izolasyonu için kullanılır ve bu çalışmayı kapsayan onaylanan protokole listelenen kişilerin uzman tarafından gerçekleştirilen ve eğitimli. 1. Hayvanlar <ol><li> Kontrollü sıcaklık ve nem ile bir odada 6 haftalık dişi farelere yetişkin 3- Bakım (12L evreleri ile: 12D ve beslenmiş ad libitum). </li><li> Folikül uyarıcı hormon (FSH) etkisini taklit ederek foliküler büyümesini teşvik etmek için Gebe kısrak serum gonadotropini 2.5 IU (PMSG) intraperitoneal olarak farelere enjekte ile. Daha sonra antral oosit toplama 48 saat için yumurtalıklar izole edin. Senin kurumsal kurallarına göre, daha önce PMSG enjekte dişi fare Euthanize. </li><li> Hızla vücut boşluğundan yumurtalıkların kaldırmak ve petri cont içine yerleştirinsonraki oosit izolasyonu için M2 orta Aining (Bölüm 3). <ol><li> Steril diseksiyon makas kullanarak periton bir kesi ardından karın duvarı kaplayan deride bir kesi yapmak. Mesane başlayarak V-şekli oluşturan, karın ortaya çıkarmak için kesik açıldı steril cımbız kullanarak bir tarafında cesaret taşımak ve uterin tüpleri lokalize. </li><li> Böbrekler altında bulunan yumurtalıklar uyun. Steril cımbız ile her tüp tutun ve onları serbest bırakmak için yumurtalıkların dibinde küçük bir kesi yapmak. Önceden dengelenmiş ortamını içeren bir petri kabı altındaki iki yumurtalık aktarın. </li></ol></li></ol> 2. Hormon Hazırlık <ol><li> Uygun bir enjeksiyon hacmi için 0.1 ml başına 2,5 IU hormonu çalışma konsantrasyonu elde etmek üzere, steril izotonik tuzlu su çözeltisi ile (başka bir stok çözeltilerinden mevcuttur) PMSG seyreltilir. Not: Hormon çözeltiler 0.5 ml tüpler içinde alikotlandı ve saklanmalı -2Kullanım güne kadar 0 ° C. -20 ° C&#39;de üç aydan uzun seyreltilmiş alikotları tutmayın. Çözülmüş kez seri enjeksiyonlar yapılır, eğer 4 ° C&#39;de hormon çözümleri hacimde depolamak ve 4 gün içinde bunları kullanmak. </li></ol> 3. Antral oositler İzolasyonu Doğru oosit izolasyonu için: <ol><li> Oositler izolasyon prosedürü başlamadan önce en az 1 saat boyunca% 5 CO2 ve 37 ° C M2 ortamı 13 (M2) dengelenmesi. İki petri kaplarına (35 mm x 10 mm), yumurtalık delme ve ayrıştırıldıktan sonra, oosit transferi için, mineral yağ (yaklaşık 1.5 mi) ile kaplanmış M2 küçük damla ikinci bir (20 ul) için M2 1 ml ile bir hazırlama yumurtalık (3.4-3.6 bakınız). Kullanılmaya hazır kadar% 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de inkübatör içinde iki petri kaplarına tutun. </li><li> Oosit izolasyon işlemleri sırasında Stereomikroskopta kullanın. </li><li> Stretç tarafından oosit toplamak için ince ağız cam pipetler hazırlayınhing cam Pasteur pipetler Bunsen beki gelen dikey bir alev (Şekil 1) üzerinden, (iki elinizle pipet uçlarını tutarak) yatay tuttu. <ol><li> Cam erimeye başladığında, alev dışarı pipetlemeyin almak ve istenen pipet elde etmek için hızlı bir çekme hareketi gerçekleştirin. Sıkıca uzunluğu ve iç kılcal çapını ayarlamak için tırnaklarıyla pipet dar noktasına yakın aşırı cam kesti. İnce kılcal oositin çapından biraz daha büyük ~ 100 um bir iç çapa sahip olduğundan emin olun (~ 80 mm). </li><li> Ağız pipet, uygun ucu kullanılarak çekilen pipet aspiratör tüpün bir ucunu ve diş ile güvence, ağızda diğer ucunu yerleştirin. </li></ol></li><li> Steril cımbız kullanarak yumurtalıkların toplamak ve bir hücre kültürü petri kabı (35 mm x 10 mm) altında bırakılması. M2 1 mi, daha önce 37 ° C &#39;de dengelenmiş ile örtünve% 5 CO2 (Şekil 2). </li><li> Yavaşça M2 (Şekil 3) antral oosit serbest bırakmak için steril bir insülin şırınga iğnesi ile yumurtalıkların antral folikül delinme. </li><li> Yavaşça ağız folikül hücreleri ve diğer olası doku artıkları (Şekil 4A) kaldırmak ve daha sonra, daha önce (embriyo kültürü için uygun mineral yağ ile kaplanmış M2 küçük damla (20 ul) altındaki yerleştirilmeleri için dar bir Pasteur pipeti ile oosit Pipeti hazırlanmıştır; Şekil 4B). NOT: M2 çeşitli ve farklı damla ile sürekli pipetleme oosit zona pellucida bağlı tüm kümülüs hücreleri çıkarmak için önemlidir. Ortamın pH değişiklikleri önlemek için mümkün olduğunca çabuk bu adımı gerçekleştirin. </li></ol> Hoechst33342 4. antral Oositler Boyama NOT: Antral oositler SN (çevrili Nukleolus), NSN (Çekirdekçik çevrili değil) ya da ayırt edilebilirBaşka ara form olarak, Hoechst33342 ve supravital konsantrasyonu (veya bazlar için özel herhangi bir başka belirteçler AT) 14 boyandıktan sonra kendi kromatin organizasyonu dayalı. NSN dolayısıyla değil, adını yaparken aslında, SN oositlerin nucleolus etrafında Hoechst-pozitif halka göstermek. Doğru oosit boyama için: <ol><li> Karanlıkta 10 dakika boyunca 50 ng / ul supravital konsantrasyonda Hoechst33342 (20 ul) M2 seyreltildi damla bir ağız pipet kullanarak oosit aktarın. </li><li> Hoechst33342 ile inkübasyondan sonra, kromatin organizasyonu (SN ya SDİ) göre ayrılması için, mineral yağ ile kaplanmış M2 küçük damla (5 ul), alt kısmında bir ağız pipetle her bir oositin aktarın. Oosit kromatin yapılandırmasını görselleştirmek için Hoechst33342 filtresi (emisyon dalga boyu 486 nm) ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskop kullanın. Not: kullanılan floresan mikroskop türüne bağlı olarak, it görüntü elde etmek için cam alt petri kullanmak zorunlu hale gelebilir. 35 mm çanak için numune tutucu ile donatılmış konfokal mikroskopi Olympus Fluoview Fv10i bir 0.17 mm standart kalınlıkta ve kabul edilebilir 0.13 0.21 mm aralığında olan görüntü elde etmek için tek cam alt-yemekler gerektirir. </li><li> Olasılıkla, daha uzun 5-10 saniye varlığı veya çekirdekçik etrafında bir halka yokluğu (Şekil 5) görselleştirmek için yeterli zaman oosit Heyecanlandırırmı. </li><li> In vitro olgunlaşmayı teşvik veya moleküler veya hücresel analizler için uygun tamponlar tutmak için% 5 CO 2 ve 37 ° C&#39;de M2, kültür antral SN ve NSN oosit sıralama sonra. </li></ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
<li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis%3A+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li>
<li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li>
<li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining%3A+a+study+using+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li>
<li>Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+%28BCB%29+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+%28IVP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biol%22%5BJournal%5D)">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li>
<li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li>
<li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li>
<li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li>
<li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes%3A+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li>
<li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li>
<li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+%28Hoechst+33342+and+3%2C3%E2%80%B2-dihexyloxacarbocyanine+iodide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Bu protokol yalıtmak ve fare antral GV oosit sınıflandırmak için kullanılan yöntem açıklanır. Birkaç istisna dışında, altını çizmek için özel bir kritik adımlar vardır. A) oosit canlılığını korumak ve b) kullanılan ortamda pH değişiklikleri önlemek: Birincisi: Bu prosedür mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. İkincisi: oosit IVM ve IVF Aşağıdaki adımlar, özellikle kromatin hasar ve oosit sonraki ölümünü önlemek için Hoechst33342 (5-10 sn) kısaca heyecanlı olmalıdır. Bugüne kadar, bu SN ve NSN fare antral oosit sıralamak ...

Yumurtalık antral bölümünden izole antral tam olarak büyümüş oositler (GV, germinal vesicle) rutin gibi farklı amaçlar için kullanılabilir, örneğin, Metafaz II aşamaya kadar in vitro olgunlaşması arkasına moleküler ve hücresel mekanizmalar çalışma. Onların güzel bir görünüm en antral oosit rağmen ama hepsi değil, mayoz tamamlamak ve blastosist aşamasına ulaşabiliyorlar; döllenme 3-5 oluşursa aslında, insanlar 1,2 dahil olmak üzere birçok memeli türlerinde, içinde, bunların yaklaşık% 30, 2-hücreli aşamada kendi gelişimini tutuklama. Bugüne kadar, birkaç parametre bunu yapamaz olanlardan embriyo gelişimini sürdürmek mümkün oosit ayırt etmek için kullanılır. Örneğin, kresil mavi boyama (BCB) BCB + veya BCB- boyama ile ilgili olan bu sıralama yöntemi programı olmasına rağmen glikoz-6-fosfat dehidrojenaz aktivitesi göre oosit sıralamak için geçerli bir yöntemdirHala 6-8 bağımlı laboratuvar. Başka köklü yöntem kendi kromatin organizasyonu bulunur: (Hoechst33342 gibi) herhangi bir DNA interkalasyon boyalarla boyanmış ise, antral oosit% 70 çekirdekçik etrafında bir boya pozitif halka göstermek ve Nukleolus (SN) çevrili denir olan% 30 kalarak Bir daha benekli olumlu sinyaller ve (NSN) 3-5 değil çevrili Nukleolus denir. Son zamanlarda biz gösterdi sitoplazmik örgülerde 9 (CPLS, memeli oosit ve embriyoların hem maternal mRNA ve ribozomlar için önemli depolama siteleri) olmaması 10. ve varlığı ile birlikte (CPLS oluşumu 11 için gerekli) MATER aşağı-regülasyonu, Onların sitoplazmalarında 9,12 lipid damlacıkları, 2-hücre aşamasına ötesine devam etmek NSN oosit yetersizlik ile ilgili diğer nedenler olabilir. Ne yazık ki, bazı teknikler antral SN ve SDİ oosit ve sıralamak için uygulanabilir,Bu nedenle, (nükleer boyanma, tespit prosedürleri ya da ağız pipetler ile manipülasyon olmadan) daha az invazif yöntem geliştirilmesi hem insan ve hayvan embriyo gelişimi oranlarını artırmak için çok önemli hale gelebilir. Bu yazıda, detay, basit ve hızlı bir protokol reklam sıralama SN ve dişi farelerden alınan NSN antral oosit izole etmek için kullanılan ve kadın gametogenez, oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimi çalışmasında ilgilenen tüm bilim adamlarına hitap etmektedir.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Kırlangıç</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Dish 35mm, yüksek cam tabanlı</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Pasteur Borosilikat</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş mikropiller pipetler için aspiratör borusu tertibatları</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

nucleolar kromatin teşkilatı dayanarak fare antral oosİt İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Bu protokol, fare antral GV (Germinal Vezikül) oositlerini in vitro olgunlaşma (IVM) ve in vitro fertilizasyondan (IVF) sonra blastosist aşamasına gelişebilecek (SN, Etrafı Sarılmış Nükleol) veya gelişemeyen (NSN, Etrafı Sarılmamış Nukleol) olarak izole etmek ve karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntemi tanımlar. NSN oositlerinde olduğu gibi, SN oositlerinde bir halka gösteren veya göstermeyen nükleolusun heterokromatinine bağlanabilen Hoeschst33342 (veya başka herhangi bir DNA birleştirici boya) kullanır. Bu, sonunda IVM veya IVF prosedürleri için kullanılabilecek her iki antral oositi sıralamanın en kolay ve en hızlı yolunu temsil eder. 
Kısaca protokol şu adımlardan oluşur: foliküler büyümeyi uyarmak için hormon enjeksiyonu; yumurtalığın steril bir iğne ile delinmesiyle GV evresindeki oositlerin antral bölmeden izolasyonu; oositlerin ağızdan pipetlenmesi için ince cam pipetlerin hazırlanması; oositlerin supravital konsantrasyonda hazırlanan Hoechst33342 ile sınıflandırılması; IVM, IVF veya diğer herhangi bir moleküler / hücresel analiz.
Ne yazık ki, daha az invaziv teknikler kullanarak SN ve NSN oositlerini sıralamak için hala az sayıda kanıt var. Eğer ve bir kez tanımlanacaklarsa, değiştirilmesi gereken çeşitli yönlerle birlikte, potansiyel olarak insan destekli üreme teknolojilerine uygulanabilirler. Bugüne kadar, bu tekniğin hem nesli tükenmekte olan hem de ekonomik çıkarları olan türlerde IVM ve IVF başarılı prosedürlerini önemli ölçüde artırmak için potansiyel etkileri vardır.

Aşağıdaki resimler Hoechst33342 aracılığıyla Oositler &#39;sıralamaya pipetler hazırlanması başlayarak fare yumurtalıkların antral oosit izole etmek için kullanılan yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, oldukça basit ve bir CO2 kuluçka makinesi, bir stereomikroskop ile Hoechst33342 gözlenmesi için doğru bir filtre ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu ile donatılmış herhangi bir laboratuvar gerçekleştirilebilir Şekil 1 pipet hazırlanması oluşan bir başlangıç ​...

Burada Nükleolar organizasyon dayalı fare antral oosit karakterizasyonu için bir protokol mevcut.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Bu prosedürün genel amacı, fare antral oositlerini, potansiyel bir embriyonik gelişimi tam olarak sürdürme yeteneklerine göre kromatin organizasyonlarına dayanarak karakterize etmek için gerekli olan tüm adımları detaylandırmaktır. Bu yöntem; memeli overinin antral kompartmanında bulunan iki farklı antral oosit türü olan SN (çevrelenmiş nükleolus) ve NSN'yi (çevrelenmemiş nükleolus) nasıl ayırt edileceği ve izole edileceği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Overleri toplamak için, üç ila altı haftalık dişi farelere IP yoluyla 2.5 uluslararası ünite pregnant mare serum gonadotropin enjekte ederek başlayın.İki gün sonra, hasattan yaklaşık bir saat önce, bir steril Petri kabını M2 ortamı ile doldurun ve ikinci bir Petri kabına birkaç adet 20 µL M2 ortamı damlası ekleyip her bir damlayı 1,5 mL mineral yağ ile kaplayın. Ardından, ortamın dengelenmesini sağlamak için tüm Petri kaplarını 37 °C, %5 CO2 inkübatörüne aktarın. Daha sonra, hormon enjekte edilen ilk farenin karın duvarını örten deride ve ardından peritonda insizyon yapmak için steril diseksiyon makası kullanın.Mesaneden başlayan V şeklini oluşturan uterine tüpleri belirlemek için steril cımbız kullanarak bağırsakları kenara çekin. Böbreklerin altındaki yumurtalıkları bulduktan sonra, bir uterine tüpü kavrayın ve dokunun alt kısmında küçük bir insizyon yaparak ilgili yumurtalığı serbest bırakın. Diğer yumurtalığı toplamak için işlemi tekrarlayın ve ardından her iki yumurtalığı da önceden dengelenmiş M2 medyumu ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin.Antral oositi izole etmeden önce, cam bir Pasteur pipetinin her iki ucundan tutup pipeti bir Bunsen beki alevi üzerinde yatay olarak tutarak cam ağızlı pipetler hazırlayın. Cam erimeye başladığında, pipeti alevden çekin ve aracı hızla birbirinden ayırın. Pipetin ucunu kısaltmak ve yaklaşık 100 mikronluk bir iç kapiler çap elde etmek için, tırnağınızı kullanarak fazla camı pipetin dar noktasına yakın bir yerden sıkıca kırın.Doğru pipet çapına sahip olmak önemlidir. Eğer çok dar olursa, oositler sıkışacak, fragmente olacak ve ölecektir. Ardından, pipetin modifiye edilmemiş ucunu bir aspiratör tüpüne bağlayın.Ardından, yumurtalıkları bir mililitre önceden dengelenmiş M2 ortamı içeren Petri kabına aktarın ve steril bir insülin şırınga iğnesi kullanarak yumurtalıkların antral foliküllerini nazikçe delin. Oositler salındıkça, folikül hücrelerini veya diğer doku kalıntılarını aspire etmemeye dikkat ederek onları ağız pipetiyle nazikçe toplayın. Daha sonra, oositlerin zona pellucida'sına yapışmış tüm cumulus hücrelerini temizlemek için her bir oositi önceden dengelenmiş çok sayıda M2 ortamı damlası arasından hızla pipetleyin.Oositler denüde edildikten sonra, oositleri taze dengelenmiş M2 ortamının tekil damlalarının dibine dikkatlice yerleştirin. Oositleri boyamak için, hücreleri M2 ortamında seyreltilmiş 20 µL'lik Hoechst 33342 damlalarına aktarmak üzere bir ağız pipeti kullanın. Ardından oositleri, mineral yağı ile kaplanmış beş µL'lik M2 ortamı damlaları içeren yeni bir Petri kabına, oositlerin her damlanın dibine tek tek yerleşmesine dikkat ederek aktarın.Tüm oositler transfer edildiğinde, kabı floresan mikroskobun altına yerleştirin ve nukleolus çevresinde bir halkanın varlığını veya yokluğunu görselleştirecek kadar kısa bir süre boyunca hücreleri uyarın. Kromatin zarar görebileceği ve hücreler çok uzun süre maruz kaldığında oositler ölebileceği için oositleri aşırı ışığa maruz bırakmamaya dikkat edin. SN ve NSN oositler tanımlandıktan sonra, hücreleri kromatin organizasyonlarına göre, istenen ileri analizler için ilgili reajen içeren uygun Petri kabına ayırın.Kromatin organizasyonu için Hoechst 33342 boyaması, prosedürün muhtemelen en kritik adımıdır. 5 ila 10 saniyelik eksitasyon, oositlerin her birinin nukleolünü çevreleyen kromatinin varlığına veya yokluğuna göre sınıflandırılması için yeterli olmalıdır. Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde üç saatten kısa sürede tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken oda sıcaklığında çalışmak ve hem yumurtalıklara hem de oositlere nazik davranmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından oositler, in vitro maturasyon ve in vitro fertilizasyon için kullanılabilir. Gelişimiyle birlikte bu teknik, gelişimsel biyoloji alanındaki araştırmacıların hâlâ yanıtlanmamış bir soruyu, yani memeli yumurtalıklarında bulunan iki tür antral oositi nasıl tanıyacakları ve birbirinden nasıl ayırt edecekleri sorusunu yanıtlamalarının önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, kendi ağız pipetinizi nasıl yapacağınız ve kullanacağınız ile Hoechst 33342 boyaması aracılığıyla antral oositlerin nasıl izole edileceği ve ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olacaksınız. Hayvanlar ve hücrelerle çalışmanın, kişisel koruyucu donanım giymek ve sterilize edilmiş aletler kullanmak gibi özel önlemler gerektirdiğini unutmayın.

isolation-characterization-mouse-antral-oocytes-based-on-nucleolar

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Bu videoda, yeni hasat edilmiş fare yumurtalıklarından antral oositlerin izolasyonu anlatılmaktadır. Bu antral oositler daha ileri karakterizasyon ve gelişimsel çalışmalar için kullanılabilir.

Fare Antral Oosit İzolasyonu: Taze Hasat Edilmiş Fare Yumurtalıklarından Antral Oositleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül--dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Yumurtalık dokusu kültürler folikül gelişim, yumurtlama ve folikül atrezi modelleri olarak kullanılabilir ve düzenleyici mekanizmaları dinamik yumurtalık işlemleri gösterir.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Öğrenin fare antral oositlerini nükleoler kromatin organizasyonuna göre karakterize etme yöntemini. SN ve NSN oositlerini ayırt ederek embriyonik gelişim potansiyelini değerlendirin.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet