Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, fare antral oositlerini, ileriye dönük bir embriyonik gelişimi tam olarak sürdürme yeteneklerine göre, kromatin organizasyonlarına dayalı olarak karakterize etmek için gerekli tüm adımları detaylandırmaktır. Bu yöntem, memeli yumurtalığının antral bölmesinde bulunan iki farklı antral ooyctes türünün, SN, etrafı çevrili nükleol ve NSN, etrafı çevrilmemiş nükleolün nasıl ayırt edileceği ve izole edileceği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yumurtalıkları toplamak için, üç ila altı haftalık dişi farelere 2.5 uluslararası birim hamile kısrak serumu gonadotropin enjekte ederek başlayın.

İki gün sonra, hasattan yaklaşık bir saat önce, bir steril Petri kabını M2 ortamı ile doldurun ve her damlayı 1,5 mililitre mineral yağ ile kaplayan ikinci bir Petri kabına birkaç 20 mikrilitre damla M2 ortamı ekleyin. Ardından, ortamın dengelenmesini sağlamak için tüm Petri kaplarını 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın. Daha sonra, karın duvarını kaplayan deride bir kesi yapmak için steril diseksiyon makası kullanın, ardından ilk hormon enjekte edilen farenin peritonunda bir kesi yapın.

Mesaneden başlayarak V şeklinde bir form oluşturan uterus tüplerini lokalize etmek için bağırsakları bir kenara çekmek için steril cımbız kullanın. Yumurtalıkları böbreklerin altına yerleştirdikten sonra, bir rahim tüpünü kavrayın ve dokunun dibinde küçük bir kesi ile karşılık gelen yumurtalığı serbest bırakın. Diğer yumurtalığı toplamak için işlemi tekrarlayın ve ardından her iki yumurtalığı da önceden dengelenmiş M2 ortamı ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin.

Antral oositi izole etmeden önce, bir cam Pasteur pipetinin her iki ucunu kavrayarak ve pipeti bir Bunsen brülör alevi üzerinde yatay olarak tutarak cam ağızlı pipetler yapın. Cam erimeye başladığında, pipeti alevden çıkarın ve cihazı hızlı bir şekilde ayırın. Ucu kısaltmak ve yaklaşık 100 mikronluk bir iç kılcal çap elde etmek için bir tırnak kullanarak pipetin dar noktasına yakın fazla camı sıkıca kesin.

Doğru pipet çapına sahip olmak önemlidir. Çok darsa, ooyctes sıkışır, parçalanır ve ölür. Ardından pipetin değiştirilmemiş ucunu bir aspiratör borusuna bağlayın.

Daha sonra, yumurtalıkları bir mililitre önceden dengelenmiş M2 ortamı içeren Petri kabına aktarın ve yumurtalıkların antral foliküllerini nazikçe delmek için steril bir insülin şırınga iğnesi kullanın. Oositler serbest bırakılırken, herhangi bir folikül hücresi veya diğer doku kalıntılarını aspire etmemeye dikkat ederek bunları ağız pipetiyle nazikçe toplayın. Daha sonra, oositlerin zona pellucida'sına bağlı tüm kümülüs hücrelerini çıkarmak için her bir oositi önceden dengelenmiş birden fazla M2 orta damlasından hızlı bir şekilde pipetleyin.

Oositler soyulduktan sonra, oositleri taze dengelenmiş M2 ortamının tek tek damlalarının dibine dikkatlice yerleştirin. Oositleri boyamak için, hücreleri M2 ortamında seyreltilmiş 20 mikrolitrelik Hoechst 33342 damlasına aktarmak için bir ağız pipeti kullanın. Daha sonra oositleri, mineral yağ ile kaplı beş mikrolitrelik damla M2 ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve oositleri her damlanın dibine ayrı ayrı yerleştirmeye özen gösterin.

Tüm oositler transfer edildiğinde, çanağı floresan mikroskobun altına yerleştirin ve hücreleri, nükleolün etrafındaki bir halkanın varlığını veya yokluğunu görselleştirmek için yeterince uzun süre uyarın. Oositleri aşırı pozlamamaya dikkat edin, çünkü kromatin zarar görebilir ve oositler çok uzun süre maruz kalırsa ölebilir. SN ve NSN oositleri tanımlandıktan sonra, hücreleri, kromatin organizasyonlarına göre istenen aşağı akış analizi için ilgili reaktifte uygun karşılık gelen Petri kabına sıralayın.

Kromatin organizasyonu için Hoechst 33342 boyama, muhtemelen prosedürün en kritik adımıdır. Beş ila 10 saniyelik uyarma, oositleri her bir oositin çekirdeğini çevreleyen kromatinin varlığına veya yokluğuna göre sıralamak için yeterince uzun olmalıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa üç saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, oda sıcaklığında çalışmak ve hem yumurtalıkları hem de yumurtalıkları nazikçe tedavi etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, oositler daha sonra in vitro olgunlaşma ve in vitro fertilizasyon için kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, memeli yumurtalıklarında bulunan iki tür antral oositin nasıl tanınacağı ve ayırt edileceği sorusuna hala açık olan bir soruya cevap vermelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, Hoechst 33342 boyama ile kendi ağız pipetinizi nasıl yapacağınızı ve kullanacağınızı, antral oositleri nasıl izole edeceğinizi ve sıralayacağınızı iyi bir şekilde anlayacaksınız. Hayvan ve hücrelerle çalışmanın, kişisel koruyucu ekipmanınızı giymek ve sterilize edilmiş aletler kullanmak gibi özel önlemler gerektirdiğini unutmayın.