Hedeflenen Srna faj aracılı teslim Gen İfade Knock Down için oluşturur E. E. coli

Bu prosedürün genel amacı, büyüyen bir E.coli popülasyonunda ilgilenilen genleri yıkmaktır. Gen yıkımları genellikle gen işlevinin temel sorularını araştırmak için kullanılır. Bu yöntemlerin sentetik biyolojide de uygulaması olabilir.

Örneğin, virülans faktörleri gibi istenmeyen genlerin susturulmasında. Bu tekniğin ana avantajı, önceden genetik modifikasyon yapılmadan E.coli'nin toplu kültürlerinde gerçekleştirilebilmesi ve sonuçların birkaç saat sonra gözlemlenebilmesidir. Başlamak için, metin protokolüne göre tasarlanmış bir sRNA ekspresyon kaseti içeren bir plazmit kullanarak, önce ekspresyon kasetindeki 24 baz çifti kılavuz dizisini tanımlayarak dizi üzerinde bölgeye yönelik mutajenez gerçekleştirin.

Yeni 24 baz çifti kılavuz dizisini çevreleyen, mevcut sRNA kasetine kısa homoloji bölgelerine sahip ileri ve geri primerler tasarlayın ve sentezleyin. LB'de beş mililitrelik bir E.coli kültürü ve sRNA ekspresyonu phagemid şablonunu taşıyan antibiyotikler hazırlayın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak büyütün.

Şablonun sRNA phagemid'i kültürden ekstrakte ettikten ve saflaştırdıktan sonra, sRNA phagemid ve yüksek kaliteli polimeraz için önerilen DNA şablonu miktarının 10 ila 50 katını kullanarak iki PCR reaksiyonu hazırlayın. İleri ve geri astar ile bir reaksiyon hazırlayın. Reaksiyonları çalıştırmak için standart PCR koşullarını kullandıktan sonra, iki reaksiyonu bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.

Daha sonra ürünleri kaynar su banyosunda 98 santigrat dereceye ısıtarak tavlayın. Isı kaynağını hemen kapatın ve banyonun önümüzdeki bir ila iki saat içinde yavaşça oda sıcaklığına dönmesine izin verin. Mutasyona uğramamış şablon sRNA'yı ortadan kaldırmak için, karışıma bir mikrolitre DpnI kısıtlama enzimi ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat veya tam sindirim için üretici tarafından önerilen süre boyunca inkübe edin.

Daha sonra, kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerini tavlanmış PCR ürününün bir ila beş mikrolitresi ile dönüştürün. Daha sonra antibiyotikli LB plakaları üzerine seçici kaplama yaparak tek kolonileri izole edin. Koloni PCR ile doğru kılavuz dizisinin dahil edildiğini doğrulamak için.

Tek bir dönüştürülmüş koloniden az miktarda hücre toplamak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Toplanan hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde 50 mikrolitre nükleaz içermeyen suya ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Daha sonra bir tezgah üstü termocycler veya kaynar su banyosu ile hücreleri iki dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtarak parçalayın.

DNA şablonu olarak parçalanmış hücrelerin bir mikrolitresini kullanarak, burada gösterilen koşullara göre PCR gerçekleştirin. Doğru kılavuz dizisini doğruladıktan sonra, beş mililitrelik bir kültürü doğru sRNA klonu ile aşılayın ve hücreleri gece boyunca büyütün. Ertesi gün, gece boyunca 750 mikrolitre kültürü 250 mikrolitre %60 gliserol ile vidalı kapaklı bir kriyotüpte birleştirerek bir gliserol stoğu hazırlayın.

M13 paketli fagemid stoklarını hazırlamak için, sRNA ekspresyonu phagemid'i taşıyan beş mililitrelik bir gece boyunca E.coli kültürü hazırlayın. Ayrıca, M13KO7 yardımcı plazmidini taşıyan beş mililitrelik bir gece boyunca E.coli kültürü hazırlayın. Ertesi gün, DNA'yı saflaştırdıktan sonra, kimyasal olarak yetkin E.coli'yi sRNA ekspresyonu phagemid ve yardımcı plazmidin her biri bir mikrolitre ile birlikte dönüştürün.

Her iki yapı için de seçilecek antibiyotikli LB-agar plakası. Phagemid ekspresyonu, hücreler için büyük bir uygunluk yüküdür ve dönüşüm verimliliğinin düşmesine neden olabilir. Plazmidi iki ardışık dönüşüm adımında tanıtmak gerekebilir.

Dönüştürülmüş hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, birlikte dönüştürülmüş suşun tek bir kolonisinden 10 mililitrelik bir kültür hazırlayın. Ertesi sabah, kültürü 10 dakika boyunca 3300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve 0,2 mikronluk bir filtreden süzün.

Paketlenmiş phagemid filtratını dört santigrat derecede saklayın. F + hedef hücreleri hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, tek bir koloniyi antibiyotiklerle beş mililitrelik bir LB ortamı kültürüne aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalama ile büyütün. Ertesi gün, F + hedef hücreleri bir ila yüz oranında seyreltmek için beş mililitre seçici LB ortamı kullanın ve inkübe etmeye devam edin.

0.3'lük bir OD600 elde edilene kadar hücreleri yaklaşık iki saat kültürleyin, bu da log fazı büyümesini gösterir. Susturma için hedeflenen hücreler, etkili fagemid enfeksiyonu için F pilus sessizliğinin ekspresyonu olduğunda üstel fazda olmalıdır. Hedef popülasyonun yaklaşık% 99'unu elde etmek için hedef hücrelere bir ila yüz oranında M13 paketlenmiş fagemidler ekleyin.

Enfeksiyonun 30 ila 60 dakika çalkalayarak 37 santigrat derecede ilerlemesine izin verin. Daha sonra sRNA susturma fenotipini istediğiniz gibi test edin. Bu videoda gösterilen protokolü takiben, plazmid pAB'nin sRNA susturma kaseti.

001, mKate2 hedefine göre değiştirildi. Bu şekil, anti-mKate2 phagemid ile enfekte olmuş E.coli suşunun arka plan üzerinde saptanabilir bir mKate2 floresan göstermediğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu suş, phagemid'in başarılı bir şekilde alındığını gösteren GFP'yi ifade etti.

Bu deneyde, kromozomal olarak entegre edilmiş bir kloramfenikol asetiltransferaz veya CAT genine sahip bir E.coli suşu, CAT'yi hedefleyen bir phagemid ile enfekte edildi ve kloramfenikol direncinin sRNA susturulması test edildi. Fagemidin CAT'i hedeflediği hücreler, düşük kloramfenikol konsantrasyonlarında daha az sağkalım gösterdi ve daha yüksek konsantrasyonlarda yaklaşık% 99 öldürme gösterdi. Öte yandan, enfekte olmamış hücreler veya mKate2'yi susturan sRNA ile enfekte olmuş hücreler, test edilen tüm konsantrasyonlarda kloramfenikol'e dirençliydi.

Burada gösterildiği gibi, sadece phagemid taşıyan bakterileri seçmek için kullanılan ampisilin ilavesi, kloramfenikol sağkalımını tespit edilemeyen seviyelere düşürdü. sRNA hedef geninin değiştirilmesi ve enfekte fagemid üretilmesi beş gün içinde yapılabilir. Fajlarla çalışmanın laboratuvardaki diğer deneyler için son derece tehlikeli olabileceğini ve istenmeyen kontaminasyonu önlemek için bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman özel laboratuvar gereçleri kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, aktif olarak büyüyen bir E.coli popülasyonunda ilgilenilen herhangi bir geni yıkmak için bir sRNA taşıyan enfekte fagemidlerin nasıl tasarlanacağı, klonlanacağı ve üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.