Name: DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin DamID-seq yöntemiyle hayvan hücrelerinde protein-DNA etkileşimlerini yüksek çözünürlüklü haritalama. Bu gelişmiş teknik, genomik analiz ve transkripsiyon düzenlemesi araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DamID memeli ifade vektörlerini sağladığı için Dr. Bas van Steensel'e teşekkür ederiz. Yale Genom Analizi Merkezi'ne ve Yale Kök Hücre Merkezi'ndeki Genomik Çekirdek'e NGS kütüphanelerinin hazırlanması ve yüksek verimli DNA dizilemesinin uygulanması konusunda tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Yale Tıp Fakültesi'nden başlangıç fonu, Amerikan Kalp Derneği'nden Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi (12SDG11630031) ve Connecticut Innovations, Inc.'den (13-SCA-YALE-15) Tohum Hibesi ile desteklenmiştir.

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
<li>Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID%3A+mapping+of+in+vivo+protein-genome+interactions+using+tethered+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase.</a> Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).</li>
<li>de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+HP1+binding+in+Drosophila%3A+developmental+plasticity+and+genomic+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals.</a> Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).</li>
<li>DamID mammalian vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm">http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm</a> (2015).</li>
<li>Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/">https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/</a> (2015).</li>
<li>Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/">https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/</a> (2015).</li>
<li>Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).</li>
<li>Encode Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS Biol. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Dam etiketli proteinlerin endojen proteinlerin işlevlerini koruyup korumadığı, bir DamID-seq deneyinden önce incelenmelidir. Baraj etiketli nükleer zarf proteinlerinin hücre altı lokalizasyonu her zaman belirlenmeli ve endojen proteinlerinkiyle karşılaştırılmalıdır. Transkripsiyon faktörlerini incelemek için, Dam-füzyon proteininin, gen ekspresyonunu düzenlemede endojen proteinin işlevlerini kurtarıp kurtaramayacağının incelenmesi önerilmektedir. Bu fonksiyonel test, endojen DNA bağlayıcı proteinlerin nakavt mutantlarını...

DNA adenin metiltransferaz tanımlaması (DamID) 1,2 in vivo protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için bir yöntem olup, kromatin, immüno-çökeltme (chip) 3 için alternatif bir yöntemdir. Hücrelerin nispeten düşük bir miktarda kullanılır ve DNA ya da yüksek ölçüde spesifik bir antikor, proteinin kimyasal olarak çapraz-bağlanmasını gerektirmez. Hedef protein gevşek veya dolaylı olarak DNA ile ilişkili olduğunda ikincisi özellikle yararlıdır. DamID başarılı bir şekilde çekirdek zarı proteinlerinin 4-10, kromatin ilişkili proteinler 11-13, kromatin değiştirici enzimler 14, transkripsiyon faktörleri ve 15-18 ko-faktörler ve RNAi makine 19 de dahil olmak üzere bir çok protein bağlanma sitesi eşlemek için kullanılmıştır. Yöntem S. dahil olmak üzere birden organizmalarda uygulanabilir cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. 21,22 yanı sıra, fare ve insan hücre hatları 6,8,10,23,24 thaliana. DamID deneyinin geliştirilmesi endojen adenin metilasyonu 2 eksikliği ökaryotik hücrelerde adenin-metillenmiş DNA fragmanlarının spesifik olarak saptanması dayanıyordu. Ilgi ve E, DNA bağlama proteini aşağıdakilerden oluşan bir füzyon proteini, coli DNA adenin metiltransferaz (Baraj), mekansal yakınlık (en önemlisi 1 kb içinde ve yukarı yaklaşık 5 kb) olan genom 2 protein bağlanma sitelerine GAİK dizileri adenin baz metillenmesi olabilir. Tadil edilmiş DNA fragmanları, özellikle ilgi 1,25,26 proteinin genomik bağlanma bölgelerini tespit etmek için microarrays yükseltilir ve hibridize edilebilir. Bu orijinal DamID yöntemi mikrodizilerinin kullanılabilirliği ve önceden belirlenmiş prob yoğunluğu ile sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, yüksek verimli sekanslamayı entegre etmişDamID 10 ve DamID-SEQ olarak yöntem belirlenmiş. Kısacası çok sayıda DamID-seq oluşturulan okur genom protein-DNA etkileşimleri hassas yerelleştirme sağlar. Biz DamID seq genom nükleer lamina (NL) dernekleri 10 çalışmak için mikrodizi tarafından DamID daha yüksek çözünürlük ve daha geniş bir dinamik aralık sağlanan bulundu. Bu geliştirilmiş bir yöntem gen yapıları 10 içinde NL dernek sondalama izin verir ve bu ChIP-seq ve RNA-seq gibi diğer yüksek verim sıralama verileri ile karşılaştırmalar kolaylaştırır. Burada anlatılan DamID seq protokol başlangıçta haritalama genom NL dernekler 10 için geliştirilmiştir. Bu E. fare ya da insan Lamin B1 hayvan zinciri ile bir füzyon proteini oluşturulur coli DNA adenin metiltransferaz ve C2C12 fare (veri yayınlanmadı) 10 ve IMR90 insan fetal akciğer fibroblastlar miyoblastların, 3T3 fare embriyonik fibroblast protokolü test. Bu protokol, biz c ile başlayanvektörleri onstructing ve memeli hücrelerinde 24 lentiviral enfeksiyon Barajı-gergin füzyon proteinleri ifade. Sonra, adenin-metillenmiş DNA fragmanları amplifiye ve diğer organizmalarda uygulanabilir olmalı dizileme kitaplıkları hazırlama ayrıntılı protokolleri açıklar.

<table><tbody><tr><td>ViraPower Lentiviral Ekspresyon Sistemleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 ve K371-20</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi BP Klonaz II Enzim Karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim Karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Kan & Doku Kiti (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 veya 69504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi pDONR 201</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T hücre</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">Tripsin-EDTA (%0.05), fenol kırmızısı</a></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>200 Kanıt EtOH</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td>, tampon <td></td></tr><tr><td>DamID adaptörleri ile birlikte verilir "AdRt" ve "AdRb"</td> Entegre <td>DNA Teknolojileri</td><td></td><td>dizileri ref. 24'te mevcuttur; kendi kendine ligasyonu önlemek için 5 'veya 3' ucunda fosforilasyon yok.</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Roche Life Science</td><td>10481220001</td> tampon DpnII <td>ile birlikte verilir</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R0543</td> tampon <td></td></tr><tr><td>DamID PCR primer "AdR_PCR"</td> ile birlikte verilir <td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>dizileri ref. 24</td></tr><tr><td>Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti Seti</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446</td><td>dATP, dCTP, dGTP ve dTTP'nin her biri 100 mM</td></tr><tr><td>Avantaj 2&nbsp; Polimeraz Karışımı</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>tampon</td></tr><tr><td>1Kb Plus DNA Ladder Life</td><td>Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 & ile birlikte verilir; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28104 veya 28106</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Saflaştırma Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28004 veya 28006</td><td>, 30 & mikrodan daha az bir elüsyon hacmi için; l</td></tr><tr><td>SPRI boncukları / Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td>, <td>40 & mikrodan az ise ekstra karıştırma ve daha fazla elüsyon süresi uygulayın; l elüsyon tamponu kullanılır</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td>, <td>tampon T4</td></tr><tr><td>DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu</td> ile birlikte verilir <td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimeraz I, Büyük (Klenow) Parça</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinüleotid Kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragmanı (3' &#8594; 5' ekzo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td>, tampon <td></td></tr><tr><td>dizileme adaptörleri</td> ile birlikte verilir <td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>dizileri ref. 28'de mevcuttur</td></tr><tr><td>Hızlı Ligasyon Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>3.4.3'te kullanılan; Hızlı Ligasyon Reaksiyon Tamponu ve Hızlı T4 DNA Ligaz</td></tr><tr><td>dizileme primeri ile birlikte verilir 1 ve 2</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>dizileri ref. 28'de mevcuttur</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kiti</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2101 veya KK2102</td><td>, KAPA HiFi DNA Polimeraz, 5x KAPA HiFi Sadakat Tamponu ve 10 mM dNTP karışımı</td></tr><tr><td>agaroz</td> ile birlikte verilir <td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>etidyum bromür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704 veya 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 veya 1725122</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>0.45 &# 956; m PVDF Filtre</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>25 ml Seringe</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>10 cm Doku Kültürü Plakaları</td><td></td><td></td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>6 oyuklu Doku Kültürü Plakaları</td><td></td><td></td><td>marka kritik değil</td></tr><tr><td>S1000 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td></td><td>qPCR için</td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>Kuru Blok Isıtıcı veya Thermomixer</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr>Güç kaynağı <td></td><td></td> markalı<td>jel elektroforez sistemi</td><td>kritik değil</td></tr><tr><td>Mıknatıs standı</td><td></td><td></td><td>DNA'nın SPRI boncukları ile saflaştırılması için; 1.5-2 ml tüpler tutmalıdır; marka kritik değil</td></tr><tr><td>UV transilluminatör</td><td></td><td></td><td>markası kritik değil</td></tr><tr><td>E-jel elektroforez sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>G6400, G6500, G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

damid seq: adenin-metillenmiş dna fragments yüksek verimli dizileme tarafından protein-dna etkileşimleri genom haritalama

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DNA adenin metiltransferaz tanımlama (DamID) testi, hem lokal hem de genom çapında protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için güçlü bir yöntemdir. Kromatin immünopresipitasyonuna (ChIP) alternatif bir yaklaşımdır. İlgilenilen protein ve E. coli DNA adenin metiltransferazdan oluşan eksprese edilmiş bir füzyon proteini, protein-DNA etkileşimlerinin bulunduğu bölgelerin yakınındaki GATC motiflerindeki adenin bazını metilleyebilir. Adenin ile metillenmiş DNA fragmanları daha sonra spesifik olarak çoğaltılabilir ve tespit edilebilir. Orijinal DamID testi, metillenmiş DNA fragmanlarının genomik konumlarını, mikrodizilerin mevcudiyeti ve önceden belirlenmiş probların yoğunluğu ile sınırlı olan DNA mikrodizilerine hibridizasyon yoluyla tespit eder. Bu yazıda, yüksek verimli DNA diziliminin DamID'ye (DamID-seq) entegre edilmesinin ayrıntılı protokolünü rapor ediyoruz. DamID-seq'ten üretilen çok sayıda kısa okuma, protein-DNA etkileşimlerinin genom genelinde yüksek hassasiyet ve hassasiyetle tespit edilmesini ve lokalize edilmesini sağlar. Memeli hücrelerinde genom-nükleer lamina (NL) etkileşimlerini incelemek için DamID-seq testini kullandık ve DamID-seq'in genom-NL etkileşimlerini tespit etmede yüksek çözünürlük ve geniş bir dinamik aralık sağladığını fark ettik. DamID-seq yaklaşımı, gen yapıları içindeki NL ilişkilerinin araştırılmasını sağlar ve genom-NL etkileşim haritalarının ChIP-seq ve RNA-seq gibi diğer fonksiyonel genomik verilerle karşılaştırılmasına izin verir.

Baraj V5-LmnB1 füzyon proteini, immünofloresan boyama endojen lamin B proteini (Şekil 1) ile birlikte lokalize olduğu teyid edildi. Adenin-metillenmiş DNA fragmanlarının PCR amplifikasyonu, başarılı DamID-SEQ için önemli bir adımdır. No-veya açıkça daha az büyütme (Şekil 2) yol açmalıdır (ligaz olmadan ya da PCR şablon olmadan, DpnI olmadan) negatif kontrol ederken 2 kb - deney örnekleri 0.2 b...

Biz yüksek verimlilik sıralama (DamID seq) DNA adenin metiltransferaz kimlik (DamID) bağlanması burada bir tahlil açıklar. Bu geliştirilmiş bir yöntem daha yüksek çözünürlüğü ve daha geniş bir dinamik aralığı ve karşılaştırın vb ChIP-SEQ RNA-SEQ gibi diğer yüksek verimli sekanslama verileri ile birlikte DamID seq verileri analiz

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli dizileme ile hayvan hücrelerinde ilgilenilen proteinlerle ilişkili genomik DNA dizilerini tespit etmektir. Bu teknik, nükleer amiloid veya spesifik transkripsiyon faktörleri ile ilişkili genomik bölgelerin tanımlanması gibi, memeli hücrelerinde nükleer organizasyon ve transkripsiyon veya düzenleme çalışmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, yüksek verimli dizilemenin, DNA mikrodizileri kullanarak orijinal DamID varlığından daha yüksek bir çözünürlük sağlaması ve bu tekniğin, yüksek verimli dizileme verilerimizle çapraz analize olanak sağlamasıdır.Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Brennan Olson olacaktır. Başlamak için, ilgilenilen geni DamID vektörüne klonlamak için metin protokolünü izleyin. Ardından, bir lentiviral ekspresyon sistemi kullanarak DamV5 POY ve V5-Dam'ı eksprese eden lentiviral stoklar oluşturun.Üreticinin protokolüne göre ileri transfeksiyon prosedürünü takiben DamID vektörünü lentiviral ambalaj plazmitleri ile birlikte geçirin. Sıfır noktası dört beş mikron PVDF filtresi kullanan bir filtreleme adımı eklediğinizden emin olun. Şimdi, hücreleri lenti

damid-seq-genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-high

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Genom hedefleme moleküllerinin doğrudan hedefleri belirlenmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. DNA bağlama molekülleri genomu meşgul anlamak için, kromatin izole etmek için küçük moleküllerin çapraz bağlama dayanan bir yöntem (COSMIC) geliştirdi.

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Protokol, mutasyonel profilleme deneyleri için RNA'nın dimetil sülfat ile modifiye edilmesi için talimat sağlar. İki alternatif kütüphane hazırlama yöntemi ile in vitro ve in vivo problama içerir.

RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

Burada, nokta blot kullanarak küresel m⁶A seviyelerini yarı nicel olarak değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Toplam RNA çıkarılır, denatüre edilir, naylon zar üzerinde lekelenir, anti-m⁶A antikoru ile incelenir ve kemilyümüsans ile görselleştirilir. Sinyal yoğunluğu, ImageJ gri tonlama analiziyle ölçülür, göreli metil bolluğunu yansıtır ve araştırma için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.

Küresel N 6-metiladenosin RNA modifikasyon seviyelerini tespit etmek için nokta lekesi testi

Öğrenin DamID-seq yöntemiyle hayvan hücrelerinde protein-DNA etkileşimlerini yüksek çözünürlüklü haritalama. Bu gelişmiş teknik, genomik analiz ve transkripsiyon düzenlemesi araştırmalarında değerli bir araçtır.

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

Daha fazla video keşfet