DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli dizileme ile hayvan hücrelerinde ilgilenilen proteinlerle ilişkili genomik DNA dizilerini tespit etmektir. Bu teknik, nükleer amiloid veya spesifik transkripsiyon faktörleri ile ilişkili genomik bölgelerin tanımlanması gibi, memeli hücrelerinde nükleer organizasyon ve transkripsiyon veya düzenleme çalışmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, yüksek verimli dizilemenin, DNA mikrodizileri kullanarak orijinal DamID varlığından daha yüksek bir çözünürlük sağlaması ve bu tekniğin, yüksek verimli dizileme verilerimizle çapraz analize olanak sağlamasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Brennan Olson olacaktır. Başlamak için, ilgilenilen geni DamID vektörüne klonlamak için metin protokolünü izleyin. Ardından, bir lentiviral ekspresyon sistemi kullanarak DamV5 POY ve V5-Dam'ı eksprese eden lentiviral stoklar oluşturun.

Üreticinin protokolüne göre ileri transfeksiyon prosedürünü takiben DamID vektörünü lentiviral ambalaj plazmitleri ile birlikte geçirin. Sıfır noktası dört beş mikron PVDF filtresi kullanan bir filtreleme adımı eklediğinizden emin olun. Şimdi, hücreleri lentivirüs ile enfekte etmeye hazırlanın.

Bir gün önce, yapışık hücreleri altı oyuklu plakalara geçirin. Antibiyotik kullanmaya devam edin. Amaç, enfeksiyon için ertesi gün% 50 izdiham sağlamaktır.

Ertesi gün, donmuş DamV5 POY ve V5-Dam lentiviral süpernatantlarını dondurucudan çıkarın ve çözülmesi için 37 santigrat derecelik bir su banyosuna koyun. Kültür plakalarında, büyüme ortamını çıkarın ve antibiyotik içermeyen yarım mililitre taze büyüme ortamı ile değiştirin. Ardından, kuyucukları bir mililitre çözülmüş lentivirüs ile doldurun.

Negatif kontrol olarak V5-Dam ile iki kuyu, DamV5 POY ile iki kuyu ve lentivirüs içermeyen iki kuyu yükleyin. Çözeltiyi hücreler üzerinde döndürün ve plakayı inkübatöre geri koyun. 24 saat sonra, hücreler üzerindeki viral süspansiyonları antibiyotiksiz iki mililitre büyüme ortamı ile değiştirin.

Daha sonra inkübasyona 48 saat daha devam edin. İki gün sonra, yaklaşık bir saat sürmesi gereken genomik DNA'yı izole etmek için metin protokolünü izleyerek bu işlemi tamamlayın. Daha sonra, genomik DNA'dan adenin metillenmiş DNA parçalarını çoğaltın.

Bu işlem yaklaşık iki ila üç gün sürer ve ayrıntılar metin protokolünde ele alınır. Bu prosedür için, önce amplifiye edilmiş adenin metillenmiş DNA'yı parçalayın. DNA Fragmentaz'ı kullanmadan önce, uygun sindirim süresini belirlemek için önce gücünü ölçmek önemlidir.

Bu tanı testi için mevcut herhangi bir saflaştırılmış metil PCR ürününü kullanın. Altı mikrogram DNA, 12 mikrolitre 10X Fragmentaz tamponundan oluşan bir ana karışım oluşturarak başlayın ve 114 mikrolitreye kadar suyla doldurun. Ardından, Fragmentaz stoğunu üç saniye boyunca vorteksleyin ve toplam 120 mikrolitre için ana karışıma altı mikrolitre ekleyin.

Ardından, ana karışımı üç saniye boyunca girdaplayın. Şimdi, beş reaksiyon tüpünü 20 mikrolitrelik ana karışım alikotu ile doldurun ve altı tüpün tümünü 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakika sonra bir tüpü çıkarın ve reaksiyonu durdurmak için beş mikrolitre EDTA ekleyin.

Tüm reaksiyon tüpleri toplanana kadar bunu her 10 dakikada bir yapın. Şimdi, her tüpten 12 nokta beş mikrolitreyi analiz edin, bu da yaklaşık yarım mikrogram DNA'ya karşılık gelir ve aynı miktarda sindirilmemiş DNA'yı bir agoroz jeli üzerinde analiz eder. Jelden, smear'ın çoğunu sıfır noktası iki kilobaz civarına kadar sindirmek için gereken minimum süreyi belirleyin.

Bunu maksimum sindirim süresi olarak kullanın. Şimdi, ön test gibi gerçek parçalanmayı ayarlayın ve beş dakika da dahil olmak üzere altı eşit aralıklı zaman noktasında sindirimi durdurun ve maksimum süreyi hesaplayın. Sindirimi takiben, altı sindirimi çekin ve bir PCR saflaştırma kiti veya katı faz geri dönüşümlü immobilizasyon boncukları kullanarak saflaştırın.

Saflaştırılmış DNA'yı yaklaşık 15 mikrolitre EB tamponunda seyreltin. Sonraki adımlar, parçalanmış DNA'nın uçlarını onarmak, adenin çıkıntıları eklemek, dizileme adaptörleri üzerine ligad eklemek ve Y şeklindeki adaptörleri çift sarmallı DNA'ya dönüştürmektir. Bu adımların tümü metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve tamamlanması iki günden fazla sürmemelidir.

Dizileme adaptörlerini parçalanmış DNA'ya bağladıktan ve Y şeklindeki adaptörleri çift sarmallı DNA'ya dönüştürdükten sonra, istenen boyutta parçalar seçin. TAE'de yüzde iki agoroz jeli hazırlamakla başlayın ve önlem alarak, mililitre başına 500 nanogramlık bir nihai konsantrasyona etidyum bromür ekleyin. Tüm numuneler için yeterli şerit ve boş şeritlerle sınırlanacak iki merdiven yapın.

Şimdi, her bir DNA elüatının 10 mikrolitresine sekiz mikrolitre yükleme boyası ekleyin ve 1 Kb Plus merdivenini 6X yükleme boyası ve su ile bir ila bir ila dört oranında hazırlayın. Ardından, jel şeritlerini aşağıdaki sırayla yükleyin: DNA merdiveni, DNA elüatları ve başka bir DNA merdiveni. Yüklendikten sonra jeli 60 dakikada 120 voltta çalıştırın.

Daha sonra, jeli UV ışığıyla kısaca görüntülemek için koruyucu gözlük ve yüz siperi takın. 300 ila 400 baz çifti arasında üç jel diliminin eksize edilebilmesi için jelin yeterince tükenip tükenmediğini görmek için DNA merdivenlerini kontrol edin. Ardından, her şeritten 300 ila 400 baz çifti arasındaki bantları kesin ve her şerit için her zaman yeni bir bıçak kullanın.

Her bir jel dilimini ideal olarak 100 mikrolitrenin altında yapmak için mümkün olduğunca az jeli çıkarın ve her birini kendi mikrofüj tüpüne aktarın. Daha sonra, metin protokolüne göre jel dilimlerinden DNA'yı çıkarın. Ekstrakte edilen DNA'dan dizileme bağdaştırıcısı değiştirilmiş parçalarının nasıl zenginleştirileceğine ilişkin metin protokolünü takip etmeye devam edin.

Ardından, saflaştırılmış DNA'nın bir Biyoanalizör tarafından yüksek kaliteli bir analizini alın ve beklentileri karşılıyorsa, dizileme için gönderin. Lentivirüsler, amino floresan boyama ile endojen lamin B1 proteini ile kolokalize olduğu doğrulanan bir Dam-V5-lamin B1 füzyon proteinini eksprese etmek üzere tasarlandı. Bu lentivirüs ve Dam-V5 füzyon proteinini eksprese eden bir kontrol lentivirüsü, fare C2C12 miyoblastlarını enfekte etmek için kullanıldı.

DNA, tarif edildiği gibi adenin metillenmiş fragmanlar için toplandı ve çoğaltıldı ve daha sonra dizilendi. Daha sonra kromozom için genom NL etkileşim haritaları oluşturuldu. Bir parça log2 RPKM oranlarını gösterir.

Diğer parça, lamina ile ilişkili alanları siyah olarak gösterir. Bunlar, Baraj lamin B1 ile kontrol Barajı'ndan önemli ölçüde daha fazla ilişkili olan alanlardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki hafta içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, DamID'ye bağlı yüksek verimli dizileme ile ilgilenilen proteinlerle ilişkili DNA dizilerinin nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Etidyum bromür ve UV ışıkları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve etidyum bromür eklemeden önce jelin soğumasını beklemek ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman göz koruması ve yüz siperi takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.