Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

Bu ex vivo eksplant prosedürünün genel amacı, kuş embriyolarının besin kullanımında rol oynayan enzimlerin ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek amacıyla, kuş endodermal epitel hücrelerinin toplanmasını iyileştirmek ve uygulama alanını genişletmektir. Bu yöntem, kuş embriyogenezi sırasında lipid kullanımıyla ilgili, örneğin gelişimin geç evrelerinde yumurta lipidlerinin nasıl paketlendiği ve yumurtadan embriyoya nasıl taşındığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kuş embriyonik gelişimini incelemek için bir model olarak kullanılabilecek Japon bıldırcını vitellus kesesi membranından fonksiyonel endodermal epitel hücrelerini başarıyla eksplant edebilmemizdir.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde 10x PBS çözeltisi hazırlayarak başlayın. Endoderm diseksiyonu sırasında vitellus kesesi membranını yıkamak için kullanılacak olan 1x PBS'yi hazırlamak için bu stok çözeltiyi on kat seyreltin. Endodermal epitel hücreleri veya EEC'ler için büyüme ortamı hazırlamak için, öncelikle DMEM/F-12'ye %10 yeni doğan dana serumu ve %1 penisilin streptomisin amfoterisin çözeltisi ekleyin.

Ardından, bir pH metrenin probunu önceden hazırlanmış DMEM içerisine yerleştirin. Ortamın pH değeri 7.2'ye ayarlanana kadar besiyerine damla damla normal HCl ekleyin. Yaklaşık iki düzine döllenmiş bıldırcın yumurtası topladıktan sonra, hava hücrelerinin bulunduğu geniş ve sivri olmayan uçları yukarı bakacak şekilde yumurtaları yumurta kaplarına dikey olarak yerleştirin.

Ardından, yumurtaları 37 °C'ye ayarlanmış, iyi havalandırılan bir inkübatöre aktarın. Beş günlük inkübasyonun ardından, yumurtaları bir yumurta ışıklandırma cihazı ile inceleyin. Embriyolar normal şekilde gelişmişse, hava hücresinin altında kılcal damarlardan oluşan dairesel bir yapı görmeyi bekleyin.

Normal kılcal damar gelişimi gösteren bir yumurta seçin ve kabuğunu taze su ve %75 etanol ile temizleyin. Ardından, yumurta kabuğunu hava hücresi konumundan makas kullanarak açın. Yumurtanın içeriğini boş bir 10 cm'lik kültür kabına nazikçe dökmeye yardımcı olmak için pens kullanın.

Ardından, embriyoyu, vitellusu ve herhangi bir albumini, YSM olarak kısaltılan vitellüs kesesi membranından ayırmak için makas kullanın. İzole edildikten sonra YSM'yi 1x PBS ile üç kez yıkayın ve ardından PBS içeren yeni bir 10 cm'lik kaba aktarın. Sonrasında, kabı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Ardından, makas yardımıyla YSM'nin dış ektoderm tabakasına bitişik olan tüm kalıntı yumurta akını temizleyin. Pens kullanarak, vitellus kesesi membranındaki mezoderm kenarından şeffaf ektodermi ve kırmızı kapiler yapısal mezodermi kaldırarak devam edin. Daha sonra, alttaki endoderm hücre tabakasını izole etmek için ektoderm ve mezodermi birlikte nazikçe soyarak ayırın.

Ardından, bir pens yardımıyla membranın sarı endodermal hücre tabakasını sıkıca tutun. Diğer pensle kapiller mezodermi kavrayın ve mezodermi, mezoderm ile endodermin birleşim kenarından uzaklaştıracak şekilde çekin. Bir makas kullanarak geri kalan sarı endoderm tabakasını kesin ve bunu büyüme ortamı ile doldurulmuş altı santimetrelik kültür kabına aktarın.

YSM toplama işleminden sonra, damlalık kullanarak altı santimetrelik kültür kabındaki açık sarı endodermü 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve üzerine önceden hazırlanmış 15 mL büyüme medyumu ekleyin. Tüm doku toplama işlemleri tamamlanana kadar konik tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin. 6,5 ünite Tip IV kollajenazı 10 mL DMEM içinde çözerek işleme başlayın.

Ardından, endoderm içeren tüpleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 130 ×g hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından besiyerini aspire edin ve tüm endoderm örneklerini bir damlalık yardımıyla altı santimetrelik bir kültür kabına aktarın. Daha sonra, kaba bir mililitre kolajen çözeltisi ekleyin.

Kavisli makas kullanarak, dört sülün embriyosundan toplanan endodermu yaklaşık iki ila üç milimetre boyutunda dilimler halinde kesin. Ardından, dilimleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve tüpün içinde halihazırda bulunan dokuz mililitre taze kollajenaz çözeltisi ile birleştirin. Eksplant aşamasında hücre proliferasyonunu artırmak için tüpü 37 °C'ye ayarlanmış çalkalamalı bir su banyosuna yerleştirin.

Ardından, dokuyu kollajenaz ile kısmen sindirmek için konik tüpü 30 dakika boyunca inkübe edin. Kısmi proteolitik sindirim, vitellus kesesi membran endodermi toplama işleminden elde edilen hücre verimini artırmak için en önemli adımdır. Verilerimiz, kollajenaz sindirme prosedürünün hücre kültürü başarı oranını ve hücre proliferasyonunu önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.

Kollagenaz sindiriminin ardından, dokuyu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 130 ×g hızında santrifüjleyin ve ardından süpernatan kısmını bir pipet yardımıyla alın. Peleti 20 mL DMEM içinde yeniden süspande ederek yıkama işlemini gerçekleştirin. Tüpü daha önce açıklandığı şekilde santrifüjleyin, ardından süpernatanı uzaklaştırın ve peleti 12 mL büyüme besiyerinde yeniden süspande edin.

Ardından, süspansiyonun 500 µL'sini 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna nazikçe ekleyin. Endoderm eksplantlarını iki gün boyunca 37 °C'de %5 CO2 içeren ortamda inkübe edin. Bu süre zarfında, hücrelerin dokulardan dışarıya doğru çoğalması beklenir.

Ardından, hücreleri iki gün daha inkübe edin. Sonrasında, hücrelere bir hücre canlılığı analizi uygulayın ve sonuçları bir plaka okuyucu kullanarak görselleştirin. Daha sonra, EEC'lerdeki ilgili belirteçlerin ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için RT-qPCR gerçekleştirin ve metin protokolünde açıklandığı şekilde gel elektroforezi ile RT-qPCR ürün boyutunu kontrol edin.

Bu grafiklerde gösterildiği ve eşleştirilmiş t-testi ile belirlendiği üzere, kollajenaz ile kısmen sindirilmiş eksplantlar, işlem görmemiş olanlara kıyasla anlamlı derecede artmış hücre proliferasyonu sergileyerek kültür sisteminin başarısını kanıtlamıştır. Diğer enzimlerin etkilerini değerlendirmek amacıyla, kollajenaz ve dispaz ile veya sadece kollajenaz ile işlem görmüş dokular için hücre canlılığı analizleri gerçekleştirilmiştir. İnkübasyonun ilk beş günü boyunca, her iki koşulda da hücre büyümesi benzerlik göstermiştir.

Buna karşın, altıncı günden dokuzuncu güne kadar sadece kollagenaz ile işlem görmüş EEC'ler istikrarlı bir şekilde çoğalmıştır; bu durum, bu enzimle yapılan kısmi sindirimin büyümeyi iyileştirdiğini ve öncelikli olarak kullanılması gerektiğini göstermektedir. Kültürlenen EEC'ler görselleştirildiğinde, burada gösterildiği gibi büyük dairesel lipid damlacıkları şeklinde adiposit benzeri özellikler sergilemişlerdir. Bu hücreler ayrıca, tipik olarak adipositleri tanımlamak için kullanılan Oil Red O boyaması için de pozitif sonuç vermiştir.

Bu morfolojik verileri destekleyen gerçek zamanlı kantitatif PCR, kültürlenmiş EEC'lerin, kolesterolden kolesterol ester sentezleyen bir protein olan SOAT1'in yüksek seviyelerini sergilediğini ortaya koymuştur. Bu durum, kültürlenmiş EEC'lerin adipositlerin doğru fizyolojik özelliklerini gösterdiğini daha da desteklemektedir. Önemli bir nokta olarak, EEC'ler siklik adenozin monofosfat veya cAMP seviyelerini artıran faktörler olan IBMX ve Forskolin'e maruz bırakılıp 24 saat boyunca kültürlendiğinde, her iki işlemin de SOAT1 ekspresyonunu stimüle ettiği görülmüştür; bu da YSM'de SOAT1 regülasyonu ve lipid kullanımının olası mekanizmaları hakkında ipuçları vermektedir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir ve bu süre zarfında en az üç örnek toplanabilir. Bu prosedürü takiben, SOAT1 gibi yöntemler veya diğer enzimatik aktivite analizlerinin yanı sıra benzer görsel doğrulamalar gerçekleştirilebilir. Bu tür analizler, belirli proteinlerin ve makro besinlerin embriyonik gelişimin ilerleyen aşamalarına nasıl dahil olduğu gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, embriyonik besin kullanımı alanındaki araştırmacıların, bir kanatlı embriyo modelinde besinlerin nasıl kullanıldığı ve taşındığına dair olası mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kanatlı embriyolardan endoderm dokularının nasıl toplanacağını öğrenebilecek ve ayrıca kanatlı modelini kullanarak embriyonik besin taşınımı ve kullanımını incelemek için EEC'lerin nasıl kültüre edileceğini bileceksiniz.