Name: Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Keşfedin Japon bıldırcını embriyo endoderm epitel hücreleriyle lipit metabolizmasını ve besin taşınımını inceleyen birincil hücre kültürü yöntemini. Bu teknik, kuş embriyolojisi araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mevcut protokolün geliştirilmesi için finansman özellikle Ulusal Tayvan Üniversitesi, Tayvan (hibe ID-104R350144) yanı sıra, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (hibe kimliği &quot;Top Üniversitesi Planı Amaç&quot; tarafından desteklenmektedir: EN 104 -2313-B-002-039-My3). Biz özellikle mevcut çalışma için bir hayvan odası ve laboratuar alanı sağlamak için Ulusal Tayvan Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi teşekkür ederiz.

Not:.. Bu prosedür ve Bauer ve ark, 2013 ve Nakazawa ve arkadaşları, 2011 tarafından geliştirilen 2,9 tavuk modeli Kültür Protokolü bir modifikasyonudur 1. Sağlıklı Embriyonik Gün 5 embriyolar Japon Bıldırcınlarında gelen hazırlayın <ol><li> Aynı kafeste birlikte 1 erkek ve 3 kadın cinsel olgun Japon bıldırcın yerleştirin. Besleme yem ve su ad libitum verilmiştir. Işığın 14 saat ve karanlığın 10 saat hayvan odasında ışık ayarlayabilirsiniz. </li><li> öğleden sonra her gün plastik torbalarda döllenmiş yumurta toplamak ve embriyoların büyüme hızını yavaşlatmak için bir 16 ° C buzdolabında saklayın. </li><li> İki haftalık bir süre içinde yumurta yeterli sayıda topladıktan sonra, beş gün boyunca iyi bir havalandırma ile 37 ° C inkübatör döllenmiş yumurta kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 2. Bazal Orta ve Yıkama Çözümleri hazırlayın <ol><li> Büyüme ortamı olarak (pH 7.2 a ayarlanmıştır), DMEM / F-12 ortamı kullanın, ve ek% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NBCs) ve% 1 Pen-Strep Ampho ile. Çözelti (PSA, penisilin, 10 5 birim / L streptomisin, 100 mg / l; amfoterisin B, 0.25 mg / L). </li><li> depolama için 10x konsantrasyonda fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın; yıkamak için (pH 7.2 ayarlamak, KCI, 2,667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM;; Na 2 HPO 4 -7 2 O, 8.06 mM NaCl, 137,93 mM içeren) ve yolk kesesi membran süre nemlendirin 1x PBS çözümü kullanın yumurta sarısı ve albümin gelen endoderm ayıran. </li><li> endoderm pelet yeniden askıya (pH 7.2 a ayarlanmıştır) DMEM ortamı kullanın. </li></ol> Japon Bıldırcın YSMs Primary EECS 3. Koleksiyonu <ol><li> 5 gün (adım 1.3) için toplanan yumurta kuluçkaya yatmaktadır. normal embriyonik gelişmeyi teyit etmek için bir yumurta Candler tarafından yumurta inceleyin. NOT: embriyonik 5. günde, YSM mezodermin sınır çok net ve 3 embriyonik tabakalar daha az birbirine sıkıca bağlı olan, bu nedenle ob kolaydırtain Endoderm. Sadece YSM koleksiyonları normal kapiller dolaşımı gelişim gösteren yumurta kullanın. </li><li> dikkatle taze su ve% 75 etanol kullanarak kabuğu temizleyin. nazikçe, bir makas ile hava hücre konumundan yumurta kabuğu açın dışarı soyun ve 37 ° C 1x PBS ile dolu bir 10 cm kültür çanak forseps ve yerine göre bütün YSM toplamak. </li><li> bir makas embriyo, yumurta sarısı ve yumurta beyazı kaldırmak ve nazikçe 1x PBS ile YSM yıkayın üç kez ve 10 cm kültür çanak PBS çözüm YSM yerleştirin kullanma. </li><li> YSM gelen ektoderm kaldırmak için forseps ve bir makas kullanın. 2 forseps kullanabilir, bir sıkıca endodermal hücre tabakası tutmak için, ve diğer kılcal mezoderm tutun. </li><li> bir mikroskop altında ayrı çekin ve embriyo doğru yönde mezodermin kenarından endoderm ayırın. 37 ° C wat büyüme ortamına, 15 ml bir damlalık ve yer kullanarak 50 ml santrifüj tüplerine açık sarı endoderm toplamaker banyosu tüm doku koleksiyonları tamamlanana kadar. </li></ol> Kollajenaz Sindirim tarafından Endoderm Dilimleri 4. Sindirim <ol><li> Taze DMEM, 10 ml tip IV kollajenaz 6.5 birim çözülür. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g&#39;de 50 ml tüpler (3.4) santrifüjleyin. orta aspire ve bir pipet kullanarak 6 cm kültür çanak tüm endoderm yerleştirin. Bu kültür kabı 1 ml kolajenaz çözeltisi ekleyin. </li><li> Her dilimin büyüklüğüne kadar kavisli bir makasla 2 bıldırcın embriyolardan alınan endoderm dilimleyin yaklaşık 2 ila 3 mm. Bir damlalık kullanarak taze kolajenaz çözeltisi 9 ml ile birlikte bir 50 ml santrifüj tüpüne tüm dilimleri toplar. </li><li> 175 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de ve çalkalama su banyosunda 30 dakika boyunca kolajenaz ile doku Digest. kollajenaz ile Bu kısmi sindirim eksplant hücre çoğalmasını iyileştirmek için kullanılır. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g&#39;de santrifüj ve yavaşça bir pipet kullanılarak süpernatan fraksiyonu kaldırma. 20 ml DMEM içinde süspansiyon pelet yıkayın ve 3 dakika boyunca 130 x g santrifüj sonra süpernatan fraksiyonu çıkarın. </li><li> Yeniden askıya büyüme ortamında (% 10 NBCs ve% 1 PSA DMEM / F12) 12 ml pelet ve 24 oyuklu bir plakaya yavaşça ve eşit (her bir 500 ul hücre çözelti) tohum. </li><li> Hücreler doku üzerinden çoğalmaya izin 2 gün boyunca havada% 5, 37 ° C&#39;de CO2 doku eksplantlarında inkübe edin. </li><li> Başka bir 2 gün boyunca inkübe hücreleri ve hücre canlılığı tahlil protokolü tarafından hücre canlılığı için karakterize eder. 15 NOT: Yaşayan hücreler sitoplazmada içinde bir indirgeyici bir ortam sağlamak. Resazurin, aktif terkip maddesi, mavi renkte ve hemen hemen floresan olmayan bir toksik-olmayan, hücre geçirgen bir bileşiktir. hücre kültürlerine eklendiğinde, resazurin mitokondriyal enzimlerin sitosolde resorufine azaltılır. Resorufm kırmızı renkte ve oldukça floresan olduğunu. Canlı hücreler sürekli resazurin Resorufm dönüştürmek, artışlarlahücreleri çevreleyen kültür ortamının genel floresans ve renk asing. </li><li> Açıklandığı gibi transkripsiyon ve PCR marker geni mRNA kantitatif gerçek zamanlı ters endoderm epitel hücresi total RNA izolasyonu gerçekleştirin. 16,17 <ol><li> SOAT1 mRNA tespit etmek için ters transkriptaz PCR kullanarak (sens: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisens: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39; PCR ürünü = 168 bp) EEC hücreleri için bir özgün bir işaret olarak. Bir temizlik geni ve iç kontrol olarak β-Aktin mRNA (PCR ürünü = 151 bp: &#39;;; 5&#39;-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 anlamsız&#39; 5&#39;TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 duygusu) kullanın. </li><li> RT-qPCR ürün boyutunu tespit etmek için jel elektroforezi kullanın. % 1 agaroz jeli hazırlayın ve 2 ul yükleme boyası 10 ul qPCR karıştırın. Yük 10 ul de% 1 agaroz jeli içinde her birine Karışım 30 dakika süre ile 100V ile jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

Rekabet eden finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları yoktur. Hiçbir özel şirketten fon alamadık.

Önceki kültürü sistemi, sadece sınırlı bir başarı olduğundan, daha iyi bir kültür sistemi gereklidir. Japon bıldırcın YSM endoderm gibi ex-vivo eksplant daha iyi bir büyüme performansı elde etmek için hücre-hücre kavşakları gevşetmek için kollajenaz gibi proteolitik enzimlerle tedavi gerektirir. Verilerimiz kısmi sindirimi tedavi hücre sayısı 2 gün sonra (Şekil 1) için tohumlama sonra sindirilmemiş doku kültüründen daha fazla olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kısmi proteolitik sindirim YSM hücre veri...

Kuş embriyo önemli beslenme kaynağı% 33 lipit,% 17 protein oluşan sarısı, ve% 1 kül. 1 embriyo gelişimi sırasında, sarısı kese zarının (YSM) embriyonik karın boşluğu içinde yetişen ve yavaş yavaş sarısı kapsar yüzey. Embriyonik gün 2 başlayarak, lipit metabolizması ve anjiyojenez ile ilişkili gen ekspresyonu kademeli YSM artar ve YSM yavaş tüy benzeri çıkıntılar geliştirir. 8,9 Bu çıkıntılar embriyo gelişimini desteklemek için sarısı besin emilimini artırır. YSM üç germ katmanları, endoderm, mezoderm ve ektoderm içeren bir extraembryonic dokudur. 14 yolk kesesi ektoderm nazikçe sarısı kesesi kapsayacak şekilde vitellin membran ile albümin ve bağlantılar ile karşı karşıyadır. Endodermal epitel hücreleri Kadm bölünebilir yumurta sarısı doğru doğrudan karşı karşıya ve besin kullanım portalları olarak hizmet vermektedir. 6 YSM genişledikçe, Endodermal epitel hücre (EECS) vardırİki grup, bölge vitelline ve alan vaskulosa içine e ve işlevsellik. 7 Konum Vitellin endodermal hücrelerden oluşan ve embriyo uzak olmaktadır; Konum vaskulosa mezodermal hücrelerden oluşan ve kan damarları ve bağ dokuları ile farklılaştırılmış EECS kapsar. embriyonik gün 5 ile, yumurta sarısı tamamen YSM ve ektoderm ve endoderm ile kaplıdır ve vasküler alan hızla büyüdü. YSM embriyonik dolaşım sistemine (sarısı türetilen çok düşük yoğunluklu lipoprotein) ve proteinler. 9, 2 Bu nedenle, lipit mekanizmaları incelemek için, birincil Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültür sistemi tesis yeniden oluşturur ve serbest bırakır lipidler, emer kuş embriyonik gelişim sırasında YSM içinde kullanımı. Böyle triaçilgliserol, lesitin, fosfolipid ve kolesterol esteri (CE) olarak lipidler kuş embriyolar için birincil enerji kaynaklarıdır. gelişiminin erken aşamalarında, yumurta sarısı lipidler c vardırsadece% 1.3 CE omposed ve kuş embriyonik gelişim 3 orta vadede% 10-15 yükselir, 11. Kolesterol ester kuş embriyo YSM sterol O-asiltransferaz 1 (SOAT1) tarafından kolesterolden sentezlenir. 4 Kolesterol depo formu CE, CE lipoproteinler taşınır ve lipoproteinler dokulara dolaşımı ile taşınmaktadır. 13 Bir hafta ambar önce kuş embriyoların hızlı bir büyüme var. Yaklaşık sarısı kalan lipit içeriğinin% 68, bu aşamada emilir. 10 lipidler bir AET araştırma modeli ile açıklık kazanabilir kullanılmaktadır sarısı hangi mekanizma. Bir tavuk EEC kültürü protokolü bu araştırma hedefe ulaşmak için kurulmuştur. 2, 9 Ancak, gelişmiş AET hücre kültürü prosedürü ile besin kullanımını aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için gerekli doku eksplant düşük başarı oranına gelişimi sırasında kuş embriyolar.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'u</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>EEC peletlerini yıkamak için</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>EEC'lerin kültürlenmesinde bazal ortam olarak</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>EEC'lerin kültürlenmesinde tedarik serumu olarak</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Solution</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Olası enfeksiyonu azaltmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip IV</td><td>Gibco by Life teknolojileri</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp; Kollajenaz, Pro-XGly-Pro dizisinde nötr bir amino asit (X) ile glisin arasındaki bağ için özgüllüğe sahip bir proteazdır. Hücrelerin birincil dokudan ayrılması için proteaz olarak.</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>FALCON&reg; </td><td>REF-353047</td> EEC'lerin 50 ml PP santrifüj <td>tüplerini takması ve uzatması için</td></tr><tr><td></td><td>Corning&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Membranların taşınması ve enzim sindirimi için</td></tr><tr><td>50 ml Konik Tabanlı Kapaklı Tüp</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Membranların taşınması ve enzim sindirimi için</td></tr><tr><td>Karşılıklı çalkalama banyosu</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Membranlarda daha iyi enzimatik sindirim için</td></tr></tbody></table>

japon bıldırcın embriyolar yolk sac membran primary endodermal epitel hücre kültürü

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Biz gelişim sırasında kuş embriyolar tarafından besin kullanımı aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir Endodermal epitel hücre kültürü modeli (AET) kuruldu. Döllenmiş Japon bıldırcın yumurta 5 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildi ve daha sonra SAC membranları (YSM) EEC kültür sistemi kurmak için toplandı sarısı edildi. Biz YSM embriyonik endoderm katman izole edilir ve 2&#39;ye membran dilimlenmiş - 3 mm parçalar kısmen 24 oyuklu kültür plakaları içinde, tohumlamadan önce kollajenaz ile sindirilir. EECS dokusu içinde çoğalan ve hücre kültür çalışmaları için hazırdır. Bu EECS, örneğin, in vivo olarak YSM tipik özelliklerini, lipid damlaları birikimine, sterol O-asiltransferaz ve lipoprotein lipaz ekspresyonunu olduğu bulundu. Kısmi sindirim tedavisi önemli ölçüde AET kültürünün başarılı oranı arttı. EECS kullanarak, biz SOAT1 sentezlenmesi cAMP d düzenlenir olduğunu göstermiştirependent protein A ile ilgili yol kinaz. Bu birincil Japon bıldırcın EEC kültür sistemi embriyonik lipid ulaşım incelemek ve kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak için bir araçtır.

tutarlı ve yararlı bir hücre modeli oluşturulması amaca ulaşmak için, biz uzanan ve çoğalma hızı ve avyan EECS performansını stabilize etmek gerekir. Bu kısmen, kolajenaz ya da kollajenaz artı dispase 0.6 U gibi proteolitik enzimler ile sindirilmiş endoderm ile bir enzimi sindirimi ile endoderm doğrudan inkübasyon karşılaştırıldı. Dispase polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize bir amino-endopeptidazdır. Proteaz sindirimi tedavileri Resim sindirim <s...

Kuş embriyonik gelişiminin geç aşamalarında yolk kesesi zarlarında lipid kullanım mekanizmasını incelemek için, birincil bir Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültürü sistemi kurduk.

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Bu ex vivo eksplant prosedürünün genel amacı, kuş embriyolarının besin kullanımında rol oynayan enzimlerin ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek amacıyla, kuş endodermal epitel hücrelerinin toplanmasını iyileştirmek ve uygulama alanını genişletmektir. Bu yöntem, kuş embriyogenezi sırasında lipid kullanımıyla ilgili, örneğin gelişimin geç evrelerinde yumurta lipidlerinin nasıl paketlendiği ve yumurtadan embriyoya nasıl taşındığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kuş embriyonik gelişimini incelemek için bir model olarak kullanılabilecek Japon bıldırcını vitellus kesesi membranından fonksiyonel endodermal epitel hücrelerini başarıyla eksplant edebilmemizdir.Metin protokolünde açıklandığı şekilde 10x PBS çözeltisi hazırlayarak başlayın. Endoderm diseksiyonu sırasında vitellus kesesi membranını yıkamak için kullanılacak olan 1x PBS'yi hazırlamak için bu stok çözeltiyi on kat seyreltin. Endodermal epitel hücreleri veya EEC'ler için büyüme ortamı hazırlamak için, öncelikle DMEM/F-12'ye %10 yeni doğan dana serumu ve %1 penisilin streptomisin amfoterisin çözeltisi ekleyin.Ardından, bir pH metrenin probunu önceden hazırlanmış DMEM içerisine yerleştirin. Ortamın pH değeri 7.2'ye ayarlanana kadar besiyerine damla damla normal HCl ekleyin. Yaklaşık iki düzine döllenmiş bıldırcın yumurtası topladıktan sonra, hava hücrelerinin bulunduğu geniş ve sivri olmayan uçları yukarı bakacak şekilde yumurtaları yumurta kaplarına dikey olarak yerleştirin.Ardından, yumurtaları 37 °C'ye ayarlanmış, iyi havalandırılan bir inkübatöre aktarın. Beş günlük inkübasyonun ardından, yumurtaları bir yumurta ışıklandırma cihazı ile inceleyin. Embriyolar normal şekilde gelişmişse, hava hücresinin altında kılcal damarlardan oluşan dairesel bir yapı görmeyi bekleyin.Normal kılcal damar gelişimi gösteren bir yumurta seçin ve kabuğunu taze su ve %75 etanol ile temizleyin. Ardından, yumurta kabuğunu hava hücresi konumundan makas kullanarak açın. Yumurtanın içeriğini boş bir 10 cm'lik kültür kabına nazikçe dökmeye yardımcı olmak için pens kullanın.Ardından, embriyoyu, vitellusu ve herhangi bir albumini, YSM olarak kısaltılan vitellüs kesesi membranından ayırmak için makas kullanın. İzole edildikten sonra YSM'yi 1x PBS ile üç kez yıkayın ve ardından PBS içeren yeni bir 10 cm'lik kaba aktarın. Sonrasında, kabı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.Ardından, makas yardımıyla YSM'nin dış ektoderm tabakasına bitişik olan tüm kalıntı yumurta akını temizleyin. Pens kullanarak, vitellus kesesi membranındaki mezoderm kenarından şeffaf ektodermi ve kırmızı kapiler yapısal mezodermi kaldırarak devam edin. Daha sonra, alttaki endoderm hücre tabakasını izole etmek için ektoderm ve mezodermi birlikte nazikçe soyarak ayırın.Ardından, bir pens yardımıyla membranın sarı endodermal hücre tabakasını sıkıca tutun. Diğer pensle kapiller mezodermi kavrayın ve mezodermi, mezoderm ile endodermin birleşim kenarından uzaklaştıracak şekilde çekin. Bir makas kullanarak geri kalan sarı endoderm tabakasını kesin ve bunu büyüme ortamı ile doldurulmuş altı santimetrelik kültür kabına aktarın.YSM toplama işleminden sonra, damlalık kullanarak altı santimetrelik kültür kabındaki açık sarı endodermü 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve üzerine önceden hazırlanmış 15 mL büyüme medyumu ekleyin. Tüm doku toplama işlemleri tamamlanana kadar konik tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin. 6,5 ünite Tip IV kollajenazı 10 mL DMEM içinde çözerek işleme başlayın.Ardından, endoderm içeren tüpleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 130 ×g hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından besiyerini aspire edin ve tüm endoderm örneklerini bir damlalık yardımıyla altı santimetrelik bir kültür kabına aktarın. Daha sonra, kaba bir mililitre kolajen çözeltisi ekleyin.Kavisli makas kullanarak, dört sülün embriyosundan toplanan endodermu yaklaşık iki ila üç milimetre boyutunda dilimler halinde kesin. Ardından, dilimleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve tüpün içinde halihazırda bulunan dokuz mililitre taze kollajenaz çözeltisi ile birleştirin. Eksplant aşamasında hücre proliferasyonunu artırmak için tüpü 37 °C'ye ayarlanmış çalkalamalı bir su banyosuna yerleştirin.Ardından, dokuyu kollajenaz ile kısmen sindirmek için konik tüpü 30 dakika boyunca inkübe edin. Kısmi proteolitik sindirim, vitellus kesesi membran endodermi toplama işleminden elde edilen hücre verimini artırmak için en önemli adımdır. Verilerimiz, kollajenaz sindirme prosedürünün hücre kültürü başarı oranını ve hücre proliferasyonunu önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.Kollagenaz sindiriminin ardından, dokuyu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 130 ×g hızında santrifüjleyin ve ardından süpernatan kısmını bir pipet yardımıyla alın. Peleti 20 mL DMEM içinde yeniden süspande ederek yıkama işlemini gerçekleştirin. Tüpü daha önce açıklandığı şekilde santrifüjleyin, ardından süpernatanı uzaklaştırın ve peleti 12 mL büyüme besiyerinde yeniden süspande edin.Ardından, süspansiyonun 500 µL'sini 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna nazikçe ekleyin. Endoderm eksplantlarını iki gün boyunca 37 °C'de %5 CO2 içeren ortamda inkübe edin. Bu süre zarfında, hücrelerin dokulardan dışarıya doğru çoğalması beklenir.Ardından, hücreleri iki gün daha inkübe edin. Sonrasında, hücrelere bir hücre canlılığı analizi uygulayın ve sonuçları bir plaka okuyucu kullanarak görselleştirin. Daha sonra, EEC'lerdeki ilgili belirteçlerin ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için RT-qPCR gerçekleştirin ve metin protokolünde açıklandığı şekilde gel elektroforezi ile RT-qPCR ürün boyutunu kontrol edin.Bu grafiklerde gösterildiği ve eşleştirilmiş t-testi ile belirlendiği üzere, kollajenaz ile kısmen sindirilmiş eksplantlar, işlem görmemiş olanlara kıyasla anlamlı derecede artmış hücre proliferasyonu sergileyerek kültür sisteminin başarısını kanıtlamıştır. Diğer enzimlerin etkilerini değerlendirmek amacıyla, kollajenaz ve dispaz ile veya sadece kollajenaz ile işlem görmüş dokular için hücre canlılığı analizleri gerçekleştirilmiştir. İnkübasyonun ilk beş günü boyunca, her iki koşulda da hücre büyümesi benzerlik göstermiştir.Buna karşın, altıncı günden dokuzuncu güne kadar sadece kollagenaz ile işlem görmüş EEC'ler istikrarlı bir şekilde çoğalmıştır; bu durum, bu enzimle yapılan kısmi sindirimin büyümeyi iyileştirdiğini ve öncelikli olarak kullanılması gerektiğini göstermektedir. Kültürlenen EEC'ler görselleştirildiğinde, burada gösterildiği gibi büyük dairesel lipid damlacıkları şeklinde adiposit benzeri özellikler sergilemişlerdir. Bu hücreler ayrıca, tipik olarak adipositleri tanımlamak için kullanılan Oil Red O boyaması için de pozitif sonuç vermiştir.Bu morfolojik verileri destekleyen gerçek zamanlı kantitatif PCR, kültürlenmiş EEC'lerin, kolesterolden kolesterol ester sentezleyen bir protein olan SOAT1'in yüksek seviyelerini sergilediğini ortaya koymuştur. Bu durum, kültürlenmiş EEC'lerin adipositlerin doğru fizyolojik özelliklerini gösterdiğini daha da desteklemektedir. Önemli bir nokta olarak, EEC'ler siklik adenozin monofosfat veya cAMP seviyelerini artıran faktörler olan IBMX ve Forskolin'e maruz bırakılıp 24 saat boyunca kültürlendiğinde, her iki işlemin de SOAT1 ekspresyonunu stimüle ettiği görülmüştür; bu da YSM'de SOAT1 regülasyonu ve lipid kullanımının olası mekanizmaları hakkında ipuçları vermektedir.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir ve bu süre zarfında en az üç örnek toplanabilir. Bu prosedürü takiben, SOAT1 gibi yöntemler veya diğer enzimatik aktivite analizlerinin yanı sıra benzer görsel doğrulamalar gerçekleştirilebilir. Bu tür analizler, belirli proteinlerin ve makro besinlerin embriyonik gelişimin ilerleyen aşamalarına nasıl dahil olduğu gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, embriyonik besin kullanımı alanındaki araştırmacıların, bir kanatlı embriyo modelinde besinlerin nasıl kullanıldığı ve taşındığına dair olası mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kanatlı embriyolardan endoderm dokularının nasıl toplanacağını öğrenebilecek ve ayrıca kanatlı modelini kullanarak embriyonik besin taşınımı ve kullanımını incelemek için EEC'lerin nasıl kültüre edileceğini bileceksiniz.

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

Bu makale, izole etmek için bir yöntem ve kültür bıldırcın veya tavuk HH14...

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

Burada, embriyonik tavuk organları büyümeye Protokolü kültür bir organotypic mevcut tüp bebek. Bu yöntemi kullanarak, embriyonik tavuk doku gelişimi, kültür ortamı üzerinde kontrol yüksek derecede korunarak okudu.

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

Bu protokol, klinik ve fizyopatolojik modellerde olası uygulama için heterojenliklerini ve fonksiyonel özelliklerini belirlemek için insan amniyotik zarının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır.

İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

Xenopus laevis embriyolarından izole edilmiş derin ektoderm hücrelerinden mukozisel epitel organoidleri geliştirmek için basit bir protokol uyguluyoruz. Çok güçlü atalar epitel goblet hücre öncüllerini yeniler ler ve organoidlerin yüzeyinde hücre geçişlerinin başlatılmasıve ilerlemesinicanlı olarak izlemesağlarlar.

Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Kuş embriyosunun koryoallantoik membranı (CAM), çeşitli araştırma alanları için çok yararlı ve uygulanabilir bir araçtır. Japon bıldırcın CAM'in özel bir ex ovo modeli, fotodinamik tedavi araştırması için uygundur.

Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Keşfedin Japon bıldırcını embriyo endoderm epitel hücreleriyle lipit metabolizmasını ve besin taşınımını inceleyen birincil hücre kültürü yöntemini. Bu teknik, kuş embriyolojisi araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

Daha fazla video keşfet