Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Bu metodolojinin genel amacı, floresan mikroskobu kullanarak Kinesin-1 kargolarını tanımlamaktır. Bu yöntem, kinesinler ve miyozinler tarafından hangi kargoların taşındığı gibi moleküler motorlar alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, baskın negatif KIF5B mutantlarının, floresan mikroskobu kullanarak bu kargoyu görsel olarak tanımlamamıza yardımcı olabilmesidir.

Başlamak için, 40X veya altında canlı hücre veya dolaylı floresan görüntüleme için, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda bir mililitre tam ortamda 0,2 ila 0,3 milyon HeLa hücresi besleyin. Hücreleri yüzde beş karbondioksit ile 37 santigrat derecede büyütün. 40X'in üzerinde büyütme oranlarına sahip dolaylı immünofloresan çalışmaları için, kontaminasyonu önlemek için bir biyogüvenlik kabininde, kapak camlarını yıkamak için mutlak alkol kullanın ve bunları havayla kurutmak için altı oyuklu bir plakanın kuyularına koyun.

Örtü fişleri kuruduğunda, onları kuyucuklara koyun ve plakanın her bir oyuğunda bir mililitre tam DMEM'de 0,2 ila 0,3 milyon hücre tohumlayın. Hücreleri gece boyunca kültürleyin. Ertesi gün, bir biyogüvenlik kabini içinde, 0.1 mikrogram tdTomato etiketli vahşi tip veya motorsuz KIF5B ekspresyon plazmidini aday kargo proteinini eksprese eden bir plazmid ile veya bir plazmid olmadan seyreltmek için 5 mililitre transfeksiyon ortamı kullanın.

Başka bir 1.6 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde, 0.1 mililitre transfeksiyon ortamına 1.8 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Daha sonra oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, seyreltilmiş DNA örneklerine 0.1 mililitre seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ekleyin.

İçeriği karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve beş saniye aşağı döndürün. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Transfeksiyon kompleksinin oluşumu için kuluçka süresi boyunca, hücreleri üç kez yıkamak için PBS kullanın.

Daha sonra her bir oyuğa 0.8 mililitre önceden ısıtılmış transfeksiyon ortamı ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi 45 dakika inkübe edildikten sonra, plakanın her bir oyuğuna damla damla 0.2 mililitre çözelti ekleyin. Altı kuyulu plakayı beş saniye boyunca nazikçe sallayın ve altı ila sekiz saat boyunca 37 derece Santigrat derece inkübatöre geri koyun.

Ardından ortamı değiştirmek için tam DMEM kullanın. 16 saatlik ek bir inkübasyondan sonra canlı hücre görüntülemesi yapmak için, DNA interkalasyon boyası Hoechst 33342'yi ortama 1 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 40X'lik bir objektif kullanarak, floresan proteinlerin ekspresyonu için hücreleri inceleyin.

Transfeksiyon reaktifi ile inkübe edilmiş hücreler üzerinde dolaylı immünofloresan yapmak için: Metin protokolüne göre paraformaldehit hazırladıktan sonra, altı oyuklu plakayı beş saniye döndürerek hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında PBS'yi kullanın. Oyuk başına bir mililitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ve PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, plakayı döndürerek hücreleri bir kez yıkamak için PBS'yi kullanın ve çözeltiyi atın.

Daha sonra, her bir oyuğa PBS'de bir mililitre% 0.1 Triton-X 100 ekleyin ve hücrelere nüfuz etmek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri dört kez yıkamak için PBS kullanın ve her yıkamadan sonra çözeltiyi atın. Birincil antikorları ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında dört saat boyunca sallanarak inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, plakayı döndürerek hücreleri dört kez yıkamak için PBS kullanın. Daha sonra bir mililitre floresan boya konjuge ikincil antikorlar ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca sallanarak inkübe edin. Hücreleri PBS ile dört kez yıkadıktan sonra, bir mililitre DAPI ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

Numunelerle birlikte örtü camları kullanılıyorsa, mikroskop lamının ortasına 10 mikrolitre montaj solüsyonu uygulayın ve montaj solüsyonunun üzerine bir kapak camı monte edin. Daha sonra gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Ertesi gün, kenarları kapatmak için oje kullanın ve gece boyunca karanlıkta bir davlumbazda kuluçkaya yatırın.

Floresan mikroskobu yapmak için, uygun olduğunda DAPI, CFP, FITC ve Cy40 için filtre setleriyle 3X'lik bir objektif kullanın. Burada gösterildiği gibi, eksojen olarak eksprese edilen vahşi tip KIFB sitoplazmada homojen olarak ortaya çıkarken, c-MYC esas olarak çekirdekte ortaya çıktı. Bununla birlikte, motorsuz KIF5B mutantı, sitoplazmada agregalar oluşturdu ve bu, c-MYC'nin agregasyonuna yol açtı.

Ek olarak, motorsuz KIF5B ayrıca endojen c-MYC ve transkripsiyon faktörü p53'ün agregasyonunu indükledi, bu da c-MYC ve p53'ün her ikisinin de Kinesin-1'in kargoları olduğunu ve KIF5B'nin her iki endojen proteinin hücre altı lokalizasyonunu düzenlediğini gösterir. Bu şekil, transkripsiyon faktörlerinin KIF5B tarafından hareketinin spesifik göründüğünü göstermektedir, çünkü motorsuz KIF5B mutantının ekspresyonu, c-Fos'un hücre altı lokalizasyonunu etkilememiştir veya toplanmasına neden olmamıştır. Bu veriler, bu videoda gösterilen yöntemin Kinesin-1 kargolarının yüksek özgüllüklü tanımlamasına izin verdiğini ortaya koymaktadır.

Bu prosedürü denerken, sitoplazmada toplanmanın kolayca gözlemlenebilmesi için çok fazla sitoplazma hacmine sahip hücreler için en uygun kinesinlerin olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, moleküler motorlar alanındaki araştırmacıların, belirli kargolarını tanımlamak için diğer kinesin ve miyozinlerin benzer baskın negatif mutantlarını inşa etmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, floresan mikroskobu kullanarak bu kargoyu tanımlamak için bir moleküler motorun baskın negatif mutantının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Feno, etidyum bromür ve paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken bunlarla doğrudan cilt temasını önlemek için her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın. İzlediğiniz için teşekkürler. Denemenizde iyi şanslar.