Name: Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Öğrenin, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi ile karışık 3D hücre kültürlerinden hedef hücreleri seçici olarak elimine etme yöntemini. Bu teknik doku mühendisliğinde yan etkileri minimize eder ve rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Kanser Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Not: Aşağıdaki protokol NUR-PIT kullanarak belirli hücreleri ortadan kaldırmak için gereken adımları açıklar. Kontroller ve NUR-PIT ve hücre canlılığı ile ilgili diğer ayrıntıları başka bir yerde 18 bulunabilir. Monoklonal antikorlara IR700 1. Konjugasyon (mAb) <ol><li> 2-5 mg / 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.6) çözeltisi içinde ml&#39;de ilgi mAb hazırlayın. </li><li> Mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 M Na 2 HPO 4 çözeltisi (pH 8.6) içinde 10 mM IR700 30.8 nmol olan mAb 6.8 nmol karıştırın ve alüminyum folyo ile kaplı 1 saat için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> iki kez 15 ml PBS ile PD-10 kolonu (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) yıkayın. Adım 1.2 numuneyi yükleyin. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, PBS ile akıtılarak PD-10 kolonu ile bir karışım saflaştınlır. Not: Burada, elüsyon IR700 band rengi boyunca oldu. 300 ul örnek, PBS elüsyon fraksiyonu 4.4 ml, tipik olarak 2,5 ila ml&#39;dir. </li><li> belirlemekBir spektrofotometre 9 595 nm&#39;de emilimin ölçülmesiyle, Coomassie boyama ile protein konsantrasyonu. Her mAb molekülüne 9 konjuge florofor moleküllerinin sayısını onaylamak için 689 nm&#39;de absorpsiyon ile IR700 konsantrasyonunu belirleyin. Not: bir spektrofotometre ile 1 MAB&#39;deki IR700 moleküllerinin optimal konjügasyon sayısını belirlemek için önemlidir. Genel olarak, 1 mAb molekül içinde 3 çevresinde IR700 molekülleri, in vitro ve in vivo çalışmaları en uygunudur. HPLC ve SDS-PAGE yöntemleri mAb ile IR700 bağlı olup olmadıklarını teyit etmek için kullanılabilir. </li><li> protein konsantrasyonu belirlendikten sonra 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Karışık 3D Hücre Kültürü 2. Hazırlık (spheroid Karışık) <ol><li> damla plakaları asılı levha rezervuar kısmına steril su (yaklaşık 1 ml) uygulayın. </li><li> A431-luc-GFP hücreleri ve 3T3-RFP hücrelerini - çeşitli ilgi hücre tiplerinin oranları hazırlayın -Kültür ortamı, 50 ul içerisinde süspansiyon haline toplam 5000 hücreleri ihtiva eden her bir örnek ile. Not: kültür ortamı daki hücre türlerinin oranı, hücre tipine bağlı olarak vb 100: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 1 hazırlayın. </li><li> 37 ° C ve% 5 karbon dioksit nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 96 gözenekli asılı bırakma plakasında 5-7 gün karışımı inkübe edin. 2 günde kültür ortamı değiştirin. Not: hücreleri içeren damlalar olarak, 3D tam küremsi yapmak hafifçe plaka işlemek için 3D şekiller oluşturan önce kolayca düşmek. </li><li> 40X büyütme - 10X bir ters aydınlık mikroskop kullanılarak küremsi morfolojisi ve boyutunu dikkate alınmalıdır. Not: Bu hücre tipleri ve asılı damla büyüklüğüne bağlı olmasına rağmen, sfero çapı de damla plaka asılı 96&#39;da kuluçkalamadan 7 gün sonra yaklaşık 400-600 um olduğundan emin olun. </li></ol> Karışık 3D Hücre Kültürü için İn Vitro NUR-PIT 3. <ol><li> ha ortamı değiştirmek10 ug / ml antikor-photoabsorber konjügatı (APC) ihtiva eden ortama açılan levhalar donanımının değiştirilmesi, ve 37 ° C&#39;de ve% 5 karbon dioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 6 saat inkübe edilir. </li><li> 6 saat kuluçkalamadan sonra, taze kültür ortamı (fenol kırmızısı Free) ile iki kez sfero yıkayın. ucu kesilmiş hafifçe steril bir 200 ul pipet kullanarak 100 ul taze fenol kırmızısı ücretsiz kültür ortamı ile bir cam tabanlı 50 mm çanak sfero aktarın. Her yemeğin bir sfero yerleştirin. </li><li> morfoloji değişikliği tespit etmek için ters aydınlık mikroskop ile sfero dikkate alınmalıdır. Aşağıdaki filtre ayarları ile floresan mikroskop kullanmak optik gazetecilere (örneğin, GFP ve RFP) gözlemlemek için: GFP - 469 nm uyarma filtresi ve 525 nm emisyon filtresi; RFP - 559 nm uyarma filtresi ve 630 nm emisyon filtresi. </li><li> ışınlanması için cam tabanlı tabak üzerinde ışık yayan diyot (LED) koyun. Not: küremsi NIR maruz kalabilirmikroskop veya laminer kaputu ya yanar. <ol><li> Bir optik güç ölçer 9 NIR ışık güç yoğunluğunu ölçün. Bu ölçüme göre, 2 J / cm2 de 670 nm 710 dalga boylarında ışık yayan ışık yayan diyotlar (LED&#39;ler) üzerinden NIR ışık saçmak. Not: LED ışık yaklaşık 5 inç maksimum derinliği nüfuz edebilir. NIR PIT sitotoksik etkileri bağımsız olarak güç yoğunluğu ve maruz kalma 23 süresi, sadece belirli bir enerji bağlıdır. </li></ol></li><li> Işık verilmesinden sonra taze kültür ortamı 50 ul yeni Asılı damla plakasına sfero aktarmak ve 37 ° C&#39;de ve% 5 karbon dioksit, bir nemlendirilmiş inkübatörde 1 gün süreyle inkübe edilir. </li><li> Yavaşça kesilmiş ucu ile steril 200 ul pipet kullanarak taze kültür ortamı (fenol kırmızısı ücretsiz), 100 ul bir cam tabanlı çanak sfero aktarın. NUR-PIT kullanarak fi sonra bir floresan mikroskop 1 gün sfero gözlemlemekltresi ayarları adım 3.3 tarif. <ol><li> Veya bir floresan mikroskobu (Şekil 2B) 14,18,22 kullanılarak sitoplazmik GFP floresans kaybı ile 2 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda ortamına propidyum iyodür eklenerek ölü hücreleri algılar. </li></ol></li><li> Hedef hücreler tamamen ortadan değilse tekrarlayın 3,1-3,6 adımları. </li></ol>

<ol><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Birchall, M. A., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%27s+green+shoots+of+disruptive+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation.</a> Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).</li>
<li>Ben-David, U., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenicity+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).</li>
<li>Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+cellular+reprogramming%3A+facts%2C+hypotheses%2C+unresolved+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues.</a> Cell. 143 (4), 508-525 (2010).</li>
<li>Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotent+stem+cell-derived+teratoma+formation+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Tang, C., Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+-+selective+in+vivo+near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+specific+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules.</a> Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+in+vivo+target-specific+cancer+cell+death+after+near+infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy.</a> BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+in+vivo+acute+necrotic+cancer+cell+death+induced+by+near+infrared+photoimmunotherapy+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging.</a> Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).</li>
<li>Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+photoimmunotherapy+assessed+by+18F-FDG+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET.</a> J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).</li>
<li>Sato, K., Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+Comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PloS one. 9 (11), 113276(2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficacy+of+Photoimmunotherapy+%28PIT%29+using+a+cocktail+of+antibody+conjugates+in+a+multiple+antigen+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model.</a> Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).</li>
<li>Shirasu, N., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+antitumor+effect+of+CEA-targeted+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu NIR PIT kullanarak hedef olmayan hücrelere zarar vermeden karışık bir 3D hücre kültüründen spesifik hücre eliminasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Şimdiye kadar, hiçbir pratik hücre eleme yöntemi doku sağlandıktan sonra veya transplantasyon sonrasında bulunmamaktadır. Böylece, NIR-PIT bunu gerçekleştirmek için gelecek vadeden bir yöntemdir. APC &#39;ler mAb kendisi benzer farmakokinetiği göstermektedir, çünkü bu teknik, aynı zamanda, in vivo 18,22 yararlanılabilir. hedef ...

Diğer hücrelere zarar vermeden özel hücrelerin ortadan kaldırılması özellikle kurulmuş doku olarak, son derece zordur ve doku mühendisliği alanında bir hücre eleme yöntemi için acil bir ihtiyaç vardır. 3 - Günümüzde rejeneratif tıp alanında, embriyonik kök hücreleri (ES), pluripotent kök hücrelerini (PSC), ya da uyarılmış pluripotent kök hücre (iPS) kullanarak doku kültürleri umut verici malzemeler 1 bulunmaktadır. Bu doku rejenerasyonu umut verici olmasına rağmen, istenmeyen hücreleri ile kirlenme önemli bir husustur. Ayrıca, transplantasyon 4,5 sonra tümorijenisite &#39;nin güvenlik endişesi var. Birçok çalışmalar bu konular üzerinde duruldu olmasına rağmen özellikle rejeneratif tıp 6, belirli hücreleri ortadan kaldırmak için - 8, hiçbir pratik bir yöntem geliştirilmiştir. Yakın Kızılötesi photoimmunotherapy (NIR PIT) bir antikor-photoabsorber conjugat göre bir tedavi yöntemie (APC). Bir APC hücreye spesifik monoklonal antikor (mAb) ve photoabsorber, IR700 oluşur. IR700 bir hidrofilik silika ftalosiyanin türevi ve tek başına 9 ile fototoksisite indüklemez. IR700 kovalent lisin molekülü yan zinciri üzerinde amid artıkları ile antikora konjuge edilir. APC hücre membran hedef molekülüne bağlanması ve daha sonra 690 nm &#39;de, NIR ışığa maruz kaldıktan sonra yaklaşık anında hücre nekrozunu indükler. 14 - NUR-ışık, hücre ölümüne 9 yol açan hücresel membran rüptürü maruz kalma sırasında. 21 - NIR PIT anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mezotelin, anti-GPC3 ve anti-CEA 15 de dahil olmak üzere birden fazla antikor ya da antikor fragmanları, etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, NIR PIT hedef moleküller, çok çeşitli karşı kullanılabilir. Ayrıca, NIR-PIT NIR ligh kısıtlayarak belirli bölgelerde seçici tedavi sağlayan bir iyi-kontrollü tedavit ışınlama 18,22. Burada, karışık 3D kültürlerden gelen NIR PIT kullanarak belirli hücre eleme bir yöntem mevcut.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester Kızılötesi Boya</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, ABD)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, ABD)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 sütunu (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Sağlık (Piscataway, NJ, ABD)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (bradford) Plus protein tahlili</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, ABD)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96 Kuyulu asılı Damla Plakaları</td><td>3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, ABD)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>Optik güç ölçer</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, ABD)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, ABD)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (panitumumab)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp; mm cam alt tabak, tabak boyutu 35&nbsp; mm, kuyu boyutu 10&nbsp; mm</td><td>Cellvis (Dağ Manzaralı, CA, ABD)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

bir yakın kızılötesi photoimmunotherapy tekniği karışık 3d kültür seçici hücre eliminasyon

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Doku mühendisliğindeki son gelişmeler birçok hastalık için yenilikçi çözümler sunmaktadır. Örneğin, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPS) kullanan doku mühendisliği, rejeneratif tıpta yeni bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu doku rejenerasyonu umut verici olsa da, doku kültürleri sırasında istenmeyen hücrelerle kontaminasyon büyük bir endişe kaynağıdır. Ayrıca, transplantasyon sonrası tümörjenite ile ilgili bir güvenlik endişesi vardır. Bu nedenle, özellikle kurulu dokuda, korunması gereken diğer hücrelere zarar vermeden belirli hücrelerin ortadan kaldırılmasına acil ihtiyaç vardır. Burada, hedeflenmemiş hücrelere zarar vermeden yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT) ile in vitro olarak karışık bir 3D hücre kültüründen spesifik hücre eliminasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu teknik, karışık hücre kültürlerinden veya dokulardan belirli hücrelerin elimine edilmesini sağlar.

optik olarak EGFR aşın NIR PIT, A431 hücre hattı, etkin olabilmesi için, genetik olarak GFP ve lusiferaz (A431-Luc-GFP) ifade etmek için modifiye edilmiştir. NIR PIT olmayan bir hedef olarak Balb / 3T3 hücre çizgisi optik RFP (3T3-RFP) ifade etmek için modifiye edilmiştir. APC panitumumab-IR700 (pan-IR700) sentezlendi. Hücreleri (A431-luc-GFP ve 3T3-RFP) çeşitli oranlarda oluşmuştur Karışık sferoidler, bu protokol (Şekil 1) &#39;e göre imal edildi. Tekrarlanan NIR PIT pa...

Belirli hücreleri diğer hücrelere zarar vermeden ortadan kaldırmak, özellikle kurulu dokularda son derece zordur, ancak doku mühendisliği alanında acil bir hücre eliminasyon yöntemine ihtiyaç vardır. Burada, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT) kullanarak karışık bir 3D hücre kültüründen spesifik hücre eliminasyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi kullanarak karma bir 3D hücre kültüründen ilgilenilen belirli hücrelerin elimine edildiğini göstermektir. Bu yöntem, doku mühendisliği alanında rejeneratif tıp ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli hedef moleküllere karşı kullanılabilmesi ve tedavinin ilgilenilen belirli lezyonlarla sınırlandırılabilmesidir.Bu sayede yan etki minimize edilebilir. Monoklonal antikorların IR700 ile konjugasyonu için, ilgili antikorları Disodyum Fosfat içindeki IR700 ile bir mikrocentrifüj tüpünde, oda sıcaklığında, alüminyum folyo ile kapalı olarak bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bir PD10 kolonunu 15 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, antikor çözeltisini kolona yükleyin ve üretici talimatlarına uygun olarak PBS elüsyonu ile karışımı saflaştırın. Her bir monoklonal antikor molekülüne konjuge olan fluoro-4 moleküllerinin sayısını doğrulamak için, monoklonal antikor protein konsantrasyonunu belirlemek amacıyla bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra, konjugatı 4-degree Celsius'ta saklayın.Karma 3D hücre kültürünü hazırlamak için, 96 kuyucuklu askılı damla plakasının plaka rezervuar kısmına 1 mililitre steril su ekleyin. Ardından, ilgilenilen hücre tipi oranlarını, uygun hücre kültürü ortamında, kuyucuk başına 50 mikrolitre ortamda en az 5.000 hücre olacak şekilde, 37-derece Celsius ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde beş ila yedi gün boyunca ekimleyin. Kültür ortamını her iki günde bir değiştirin ve sferoidlerin morfolojisini ve boyutunu her gün, 10 ila 40 kat büyütme oranında bir ters parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin.Sferoidler 400 ila 600 mikron çapına ulaştığında, asılı damla plakası besiyerini antikor fotoabsorber konjugatı içeren besiyeri ile değiştirin ve plakayı altı saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, sferoidleri taze fenol kırmızısı içermeyen kültür besiyeri ile iki kez yıkayın. Ardından, ucu kesilmiş bir 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak, her bir sferoidi tek tek, her birinde 100 mikrolitre taze fenol kırmızısı içermeyen kültür besiyeri bulunan ayrı cam tabanlı 50 milimetrelik kaplara aktarın.Sferoid morfolojisindeki değişiklikleri gözlemlemek için evirme mikroskobu kullanın. Sferoidleri ışınlamak için, cam tabanlı kapların en fazla 5 inç yukarısına bir ışık yayan diyot yerleştirin. Ayrıca, santimetrekare başına 2 joule enerji ile 670 ila 710 nanometre dalga boyunda emisyonu doğrulamak için bir optik güç ölçer kullanın.NIR kızılötesi fotoimmünoterapi sonrası, sferoidleri kuyuk başına 50 µL taze kültür ortamı içeren yeni bir asılı damla plakasına aktarıp hücre kültürü inkübatöründe bir gün bekletin. Ardından, ucu kesilmiş başka bir 200 µL pipet ucu kullanarak, sferoidleri nazikçe 100 µL fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı bulunan yeni cam tabanlı kaplara aktarın ve floresan mikroskobu altında optik raporlayıcı ekspresyonunu değerlendirin. Son olarak, ortama propidyum iyodür ekleyerek ölü hücreleri tespit edin.Veya sitoplazmik GFP floresansının kaybıyla. Bu temsili deneyde, az önce gösterildiği gibi A431-luc-GFP ve 3T3-RFP hücrelerinin çeşitli oranlarından oluşan karma sferoidler hazırlandı. Ardından, gösterildiği gibi panitumumab-IR700 inkübasyonu ile tekrarlayan NIR kızılötesi fotoimmünoterapi uygulandı.Ve hedef hücre eliminasyonu, asılı damla kültürlerindeki floresan ve lüsiferaz aktivitelerinin değerlendirilmesi yoluyla izlendi. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütülürse bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, ışık enerjisinin ters kare yasasına göre azaldığını hatırlamak önemlidir.

selective-cell-elimination-from-mixed-3d-culture-using-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, tümör  dokusunda sızan T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarını analiz etmek için yerinde floresan multispektral görüntüleme tekniğini göstermektedir. Bir renal hücreli karsinom doku kriyoseksiyonu, spesifik inhibitör reseptörleri eksprese eden ve immünoterapiye dirençli bir fenotip sergileyen CD8 + T hücrelerini etiketlemek için antikorlarla tedavi edilir. Etiketli bölüm, farklı CD8 + T hücresi alt popülasyonlarını tanımlamak için multispektral bir mikroskop kullanılarak...

İmmünoterapiye Dirençli T Hücresi Alt Popülasyonlarını Analiz Etmek için Çoğullanmış İmmünofloresan Görüntüleme

Bu video, lusiferaz eksprese eden tümör hücreleri sergileyen tasarlanmış bir fare modelinde akciğer kanserini tedavi etmek için yakın kızılötesi fotoimmünoterapi tekniğini göstermektedir. Tümör hücreleri üzerindeki spesifik antijenlere bağlanan bir antikor-ışığa duyarlılaştırıcı konjugatı (APC) enjekte edildikten sonra, fare yakın kızılötesi radyasyona maruz kalır, bu da APC'de fotokimyasal değişikliklere neden olur ve bağlı tümör hücrelerinin nekrotik ölümüne yol açar. Tedavinin etkinliği, bir...

Bir Murin Modelinde Akciğer Kanserini Tedavi Etmek için Yakın Kızılötesi Fotoimmünoterapi Tekniği

Bu video, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi yoluyla karışık bir 3D hücre kültüründen belirli hücrelerin seçici olarak çıkarılması için bir tekniği göstermektedir. Bu yöntemde, hedeflenen hücreler, bir NIR fotoemici ile konjuge edilmiş bir antikor kullanılarak doğru bir şekilde tanımlanır. Kızılötesi ışıkla müteakip ışınlama, hücre ölümünü indükleyerek hedeflenen hücreleri 3D kültürden etkili bir şekilde ortadan kaldırır.

Karışık 3D Kültürlerde Hedeflenen Hücre Eliminasyonu için Yakın Kızılötesi Fotoimmünoterapi

Bu protokol, ilgilenilen belirli hücre tiplerini izole etmek için desthiobiotin, streptavidin ve APTES sisteminin özelleştirilebilir yüzey işlevselleştirmesini tanımlar. Ek olarak, bu makale bu sürecin uygulamalarını, optimizasyonunu ve doğrulanmasını kapsar.

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Fotodinamik Tedavi (PDT) apoptosis ikna etmek için görünür ışık photoactivation tarafından izlenen bir exogenously uygulanan photosensitizer (PS) kuluçka içerir tıbbi bir işlemdir. Biz PS kuluçka ve ışık tedavisi parametreleri farklılıklar çalışmaya kullanılabilir PDT benzetimini yapmak için tasarlanmış bir vitro PDT iletişim kuralı mevcut.

Fotodinamik Tedavi bir Vitro yaklaşım

Yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT), kanser hücrelerini yok etmek için antikor-fotoabsorber (IR700Dye) konjuge ve NIR ışığı kullanan gelişmekte olan bir kanser terapötik stratejisidir. Burada, nir-PIT'in antitümör etkisini biyolüminesans görüntüleme kullanarak plevral yaygın akciğer kanseri ve malign plevral mezotelioma fare modelinde değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Plevral Yayılım Fare Modelleri için Yakın Kızılötesi Fotoimmünoterapi

Kuş embriyosunun koryoallantoik membranı (CAM), çeşitli araştırma alanları için çok yararlı ve uygulanabilir bir araçtır. Japon bıldırcın CAM'in özel bir ex ovo modeli, fotodinamik tedavi araştırması için uygundur.

Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç

Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.

2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı

Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.

Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

Manuel IBEX yöntemi ile düşük maliyetli, çok yönlü bir foto ışınlama tekniğinin uygulanması, önemli doğal otofloresan ile insan dokusunun en iyi şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, ters çevrilmiş bir mikroskop, yaygın olarak bulunan reaktifler ve görüntü hizalama ve işleme için açık kaynaklı yazılım kullanılarak arşivlenmiş klinik örneklerden çoğullanmış, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Öğrenin, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi ile karışık 3D hücre kültürlerinden hedef hücreleri seçici olarak elimine etme yöntemini. Bu teknik doku mühendisliğinde yan etkileri minimize eder ve rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli sunar.

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Daha fazla video keşfet