Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan ayrımı kullanarak cilde sızan lökositleri izole etmektir. Bu yöntem, atopik dermatit de dahil olmak üzere cilt patolojilerinin birçok fare modelinde hücresel ve moleküler mekanizmaların araştırılmasına uygulanabilir. Bu yöntem cilde sızan lökosit biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer yerleşik hücre popülasyonlarının araştırılmasına da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, fazla yağ ve bağ dokularının tamamen çıkarılmasını içeren deri toplama işlemi ile mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü deri toplama ve yoğunluk gradyanı işlemenin öğrenilmesi zordur ve hassasiyet ve pratik gerektirir. Tedaviden sonra uygun zaman noktasında, sekiz ila on iki haftalık yetişkin bir dişi ND4 Swiss-Webster faresinden 25 x 25 milimetrelik traşlı yan deri alanını dikkatlice çıkarmak için 10 santimetre cerrahi makas kullanın.

Derideki fazla yağ ve bağ dokusunu kazımak için temiz, keskin bir cerrahi bıçak kullanın, ardından cildi EDTA, HEPES ve FBS ile desteklenmiş 10 mililitre oda sıcaklığında HBSS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve dokuyu kuru, gazsız bir ortamda 30 dakika boyunca dönen bir plaka üzerinde önceden sindirin, 37 santigrat derece inkübatör. İnkübasyonun sonunda, tüpü on saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın ve doku bulamacını 70 mikronluk bir süzgeçten süzün. Daha sonra, yan deri parçalarını süzgeçten EDTA, HEPES ve FBS ile desteklenmiş on mililitre taze, oda sıcaklığında HBSS ortamı içeren 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarmak için bir çift forseps kullanın, ardından 12.5 santimetrelik bir çift cerrahi diseksiyon makası kullanarak her bir yan deri parçasını kıymak için ortalama doku parçası yaklaşık 2,2 x 2,2 milimetre boyutunda olur.

Tüm parçalar kıyıldığında, tüpü 30 dakikalık bir inkübasyon için dönen plakaya geri koyun. İnkübasyonun sonunda tüpü 10 saniye kuvvetlice vorteksleyin ve içeriği 70 mikronluk süzgeçten süzün. Kalan yan deri parçalarını, mililitre başına 0.7 miligram Kollajenaz D ile desteklenmiş 10 mililitre HBSS içeren 50 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın ve tüpü 30 dakikalık bir inkübasyon için dönen plakaya geri koyun.

10 saniye daha girdaplamadan sonra, tüpün içeriğini tekrar süzün, bu sefer süzgeçteki kalıntıları atın, ardından tüpü 50 mililitreye kadar HBSS, EDTA, HEPES, FBS ile doldurun, hücreleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanı boşaltın. Yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe üç mililitre oda sıcaklığı, PBS'de yüzde 67 yoğunluk gradyan santrifüj ortamı ekleyin ve hücre peletini fenol kırmızısı ile HBSS'de beş mililitre oda sıcaklığında yüzde 44 yoğunluk gradyan santrifüjleme ortamında yeniden süspanse edin. Pipetleyiciyi en düşük hıza ayarlayın, pipeti tüpün yan tarafına yerleştirin ve hücreleri yüzde 67 yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamının üzerine nazikçe yerleştirin.

Yoğunluk gradyanlarıyla çalışırken, kabarcık yapmaktan kaçınmaya ve gradyan arayüzündeki herhangi bir kesintiyi en aza indirmeye dikkat edin. Ardından, santrifüjlemenin sonundaki arayüzdeki hücreleri toplamak için beş mililitrelik bir transfer pipeti kullanarak hücreleri ayırın. Degradenin nazikçe katmanlanması ve degradelerin arayüzünün dikkatlice çıkarılması kritik adımlar olduğundan, ilgilenilen deneysel hücrelerle prosedürü denemeden önce yoğunluk gradyan santrifüjleme ortamı katmanlaması ve murin splenositlerinin süspansiyonu ile arayüz çıkarma işlemini uygulamak akıllıca olacaktır.

Son olarak, toplanan hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte FBS ile desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'de yıkayın ve tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını sayın. CD4 ve CD8-alfa yüzey ekspresyonu, Kollajenaz D sindiriminden etkilenmez, çünkü aynı sayıda CD4 pozitif ve CD8-alfa pozitif hücre, enzimatik sindirim olsun veya olmasın tespit edilir. Ayrıca, Kollajenaz D sindirimi, CD4 pozitif T hücreleri üzerindeki T hücresi aktivasyon belirteçleri CD44 ve CD62L'nin yüzey yoğunluğu üzerinde hiçbir etki göstermez.

Gradyan ayrılmasından sonra, milimetre kare yan doku başına yaklaşık 250 canlı bağışıklık hücresi, Oksazolon veya Ox'a meydan okunan farelerden izole edilirken, daha önce Ox ile duyarlı hale getirilmiş, araç meydan okuyan farelerde doku metrekare başına sadece dört canlı bağışıklık hücresi izole edilir ve Ox'a meydan okuyan farelerde düşük ileri ve yan saçılma tek hücrelerinin yüzde 95'i ve araçta zorlanan kontrollerde bu hücrelerin yüzde 71'i canlı CD45 pozitif hücrelerdir, üç günlük Ox zorluğunu takiben yan deride sızan CD67 pozitif bağışıklık hücresi popülasyonunda yaklaşık 45 kat artışa eşdeğerdir. Gerçekten de, Ox meydan okuması, Ox ile tedavi edilen hayvanlarda tek, canlı CD45 pozitif hücrelerin yüzde 42'si, görünür Gr-1 pozitif nötrofiller ve yaklaşık yüzde 84 CD3 pozitif T hücreleri, kontrol, etanol ile muamele edilen hayvanlara kıyasla CD8-alfa veya CD4 eksprese eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yaklaşık üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, yoğunluk gradyanını dikkatli bir şekilde ele almayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman oda sıcaklığında yoğunluk gradyan santrifüj ortamını kullanmayı unutmayın. Bu prosedürü takiben, cilde sızan lökositlerin fenotipini ve işlevini değerlendirmek için akış sitometrik analizi, hücre sınıflandırması, hücre transferi veya in vitro hücre kültürü gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanarak cilde sızan lökositlerin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.