Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

Bu metodolojinin genel amacı, tek hücreli analizdeki uygulamalarla bir antikor dizisi üretmektir. Bu yöntem, tek hücreli analiz alanında, aynı tek hücreden gizli proteinleri ve hücre içi proteinleri aynı anda nasıl tespit edebileceğimiz gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ve bu hedefe ulaşmak için bir mikro dizi platformunu nasıl üretebiliriz?

Bu tekniğin temel avantajı, özelleştirilebilir olmasıdır. Akış modelleme stratejilerini değiştirerek, çeşitli boyutlarda diziler oluşturulabilir. Önceden, barkod akış modelleri için SU-8 master'ı oluşturun.

Talimatlar metin protokolünde verilmiştir. Bu, bir krom fotoğraf maskesi tasarlamayı ve yapmayı içerir. Maskeyi foto-dirençli bir ceket üzerine yerleştirmek ve UV uygulamak deseni sağlar.

PDMS barkod kalıbını hazırlamaya başlamak için 40 gram silikon elastomer tabanı dört gram sertleştirici ile birleştirin, ardından 10 dakika kuvvetlice karıştırın. Ardından, ön polimer çözeltisini vakum altında 20 dakika boyunca gazdan arındırın. Ardından, çözeltiyi, barkod deseninin SU-8 master'ı ile bir silikon gofret içeren bir petri kabına yükleyin.

Çözeltiyi 7.45 milimetre derinliğe dökün. Ardından, kalan kabarcıkları gidermek için tabaktaki karışımın gazını alın. PDMS'yi sertleştirmek için karışımı 75 Santigrat derecede bir saat pişirerek gazdan arındırma işlemini takip edin.

Ardından, bir neşterle keserek, barkod kalıbını dikkatlice çıkarın. Ardından, levhayı gofretten dikkatlice soyun. Ardından, kalıp için istenen şekli elde etmek için levhanın kenarlarını kesin.

Desen üzerindeki giriş ve çıkışları temsil eden dairesel özelliklerde yarım milimetre delikler açmak için pistonlu bir biyopsi zımbası kullanarak kalıbı bitirin. Nitrojen üfleme tabancası ile poli-L-lizin kaplı bir cam slayttaki tozu üfledikten sonra, PDMS kalıbını slayta takın. Kalıbın kenarlarını dikkatlice slayta hizalayın.

Şimdi, PDMS ile slayt arasındaki bağı güçlendirmek için düzeneği 75 santigrat derecede 90 dakika pişirin. Bu arada, girişler ve çıkışlar için 20 adet esnek polietilen boru hazırlayın. Her bir boru parçasına, bir milimetre çapında paslanmaz çelik içi boş bir pim takın.

Ardından, pimler aracılığıyla, uzunlukları bir santimetre veya daha fazla poli-L-lizin ile doldurun. Cama yapıştırıldıktan sonra, pimleri kalıbın girişlerine dikkatlice sabitleyin. Bu, hazırlığın en zor adımıdır.

Süreci aceleye getirmeyin. Tüplerin diğer ucunu, 20 üç vanadan oluşan bir ağdan oluşan ve aynı anda iki kalıbı idare edebilen, basınç ayarlı bir nitrojen tankı kurulumuna takın. Kurulumu kullanarak, çözeltiyi kalıptan en az altı saat boyunca 0,5 ila bir PSI arasında üfleyin.

BS-3'te yeni hazırlanmış tek sarmallı DNA solüsyonlarını paslanmaz çelik pimlerden ve polietilen boruya aspire ederek başlayın. Ardından, PDMS kalıbını nitrojen kaynağına bağlayın ve çözeltiyi yaklaşık 40 dakika veya tüm kanallar dolana kadar barkod kalıbından akıtın. Ardından akışı durdurun ve kalıbın oda sıcaklığında iki saat inkübe etmesine izin verin.

Birkaç saat sonra barkod kalıbını 75 derecede bir saat pişirin. Piştikten sonra kalıbı slayttan ayırın ve slaydı %01 SDS ile nazikçe yıkayın. Ardından, slaytı ultra saf suyla üç kez yıkayın.

Barkod slaytını bir sürgü döndürücü kullanarak kurutarak yıkamaları takip edin. Kuruduktan sonra barkod slaytını 50 mililitrelik temiz bir tüpte saklayın. Devam etmek için, tek boyutlu deseni doğrulamak için metin protokolünü izleyin.

Doğrulama prosedürünü gerçekleştirmek için, slaytı bloke edin, siyanin üç tamamlayıcı DNA'yı ona hibritleyin ve sonuçları ölçün. Üçe üç dizi için SU-8 master, ilk tasarımınkine dik bir akış modeline sahiptir. Bu desenin yeni bir PDMS kalıbını yapmak için daha önce açıklanan yöntemi kullanın.

Başlamak için, dokuz oligonükleotidin yeni çalışma konsantrasyonlarını yapın. Şimdi, yüzde üçlük bir BSA engelleme çözümünü, 0,5 ila bir PSI hızında bir saat boyunca dizi slaytının 20 kanalının tümüne akıtın. Ardından, DNA çözeltilerini ilgili kanallarına yükleyin.

Onları yaklaşık 40 dakika akıttıktan sonra, DNA'nın hibritleşmesine izin vermek için slaytı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, bir saat boyunca 20 kanalın tümüne yüzde üç BSA engelleme solüsyonu akıtın. Bu, hibritlenmemiş DNA'yı çıkaracaktır.

Şimdi, dizi slaytını PDMS'den soyun ve slaytı bir kez yüzde üç BSA'ya batırın. Ardından, slaydı PBS'ye iki kez daldırın ve ardından yüzde iki PBS'ye bir daldırın. Ardından, daha önce olduğu gibi, bir mikroskop slayt döndürücü kullanarak slaydı kurutun.

Devam etmek için, tek boyutlu slaytları doğrulamaya benzer bir doğrulama adımı gerçekleştirin. Oligonükleotidleri kullanın: bir asal ila dokuz, hepsi siyanin üçe konjuge edilmiştir. Daha sonra kullanmak üzere üçe üç dizi slaytını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın.

Metin protokolü ayrıca DNA dizisinin bir antikor dizisine nasıl dönüştürüleceğini açıklar. Antikor-oligo konjugatlarını hazırladıktan ve saflaştırdıktan sonra, mikro odacıklı başka bir PDMS kalıbı hazırlayın. Ayrıntılar için metne bakın.

Bu kalıbı dizi slaytı ile eşleştirin. Şimdi, slaytı yüzde bir BSA ile bloke edin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Kuluçka sırasında 200 mikro litre antikor-oligonükleotid konjugatı hazırlayın.

Bloktan sonra, antikor-oligo kokteylini kuruluma ekleyin. Antikorların dizi üzerinde 37 santigrat derecede bir saat inkübe etmesine izin verin ve ardından metin protokolünde açıklanan slayt daldırmalarına devam etmeden önce slaydı temizleyin ve kurulayın. Açıklanan protokolü takip ettikten sonra, üçe üç dizi kullanılarak, elde edilen antikor paneli, esas olarak sandviç ELISA platformu aracılığıyla çoklu pleks tespitinde kullanıldı.

Proteinler, cam lamın bir ucundan diğer ucuna% 10'dan daha az varyasyon gösterdi. Üçe üç dizide, siyanin üç tarafından etiketlenmiş bir referans ve bir negatif kontrol ile birlikte yedi adede kadar protein tespit edilebilir. Bir tümör çalışması için yapılan tek hücreli bir deneyde, altı proteinin tümü aynı anda tespit edildi.

Kalibrasyon için, rekombinant proteinler çeşitli konsantrasyonlarda bir diziye uygulandı. Algılama hassasiyeti, geleneksel bir sandviç ELISA'ya oldukça benzerdi. Bu prosedürü denerken, PDMS kalıplarını partikül maddelerden uzak tutmayı unutmamak önemlidir.

Kanallardaki toz, zayıf homojenliğe ve düşük hassasiyete sahip dizilere neden olabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların, tümör mikro ortamlarının modellerini kullanarak hücre-hücre sinyalizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı.