Name: Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Keşfedin, BrdU ChIP-Slot-Batı tekniğiyle memeli hücrelerde yeni sentezlenen DNA'ya bağlı proteinleri ve histon modifikasyonlarını hızlıca inceleyin. Bu yöntem, DNA replikasyonu ve onarımı sırasında protein etkileşimlerini nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazıda iş Radyasyon Onkolojisi Bölümü ve Huntsman Kanser Enstitüsü ve SB Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü (R01-CA188520) fon tarafından desteklenmiştir. Ben protokol gösteren ve avantajlarını açıklayan benim laboratuvar Danielle Johnson ve Steven Bennett teşekkür ederiz. Ben yazının eleştirel yorumlar için Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Kanser Enstitüsü) müteşekkirim.

BrdU Etiketleme aşağıdaki 1. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) <ol><li> DMSO veya HDAC1,2 seçici önleyicileri, ya mevcudiyetinde kültür NIH3T3 hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi, 6. </li><li> DMSO veya HDAC1,2 seçici inhibitörler ile işlendikten sonra, steril doku kültürü kaputu hücrelere BrdU ekleyin. Steril 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde 60 dakika için bromodeoksiüridin bir 20 uM nihai konsantrasyon (BrdU) ile 10 mi NIH3T3 ortamda kaplanmıştır 2 x 10 6, NIH3T3 hücreleri inkübe edin. </li><li> % 1 bir son konsantrasyonda kültür ortamına doğrudan formaldehid eklenerek DNA çapraz bağ hücre içi proteinlerdir. Bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında formaldehid ile 2 x 10 6 NIH3T3 hücreleri inkübe edin. </li><li> 125 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar glisinin eklenmesi ile çapraz bağlanma Quench. Bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Ortamı çıkarın ve 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne PBS içinde hücreleri toplamak. Spin cel4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 956 x g&#39;de ls. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez hücre pelletini yıkayın. Tüp PBS çıkarın. Kullanılana kadar -80 ° C&#39;de PBS (süpernatant) olmadan çapraz bağlanmış hücre pelletini saklayın. </li><li> 500 ul FA140 tamponu eklenerek çapraz bağlanmış hücre topağından lizat hazırlanması (50 HEPES KOH mM pH 7.5, NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat) proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiştir. </li><li> Numuneleri% 35 güçte ve 15 sn darbesi ile beş kez, 0.9 sn ve 0,1 sn kapalı ayarı sonicating ile kromatin Kayma. Numunelerin ısınmasını önlemek için sonication her turdan sonra buz üzerinde tüpler tutun. <ol><li> Farklı sonicators arasında değişecektir kesme verimliliği gibi bir DNA jel üzerinde kesme kontrol edin. Sonikasyon kontrol etmek için, 0.16 M &#39;lik bir konsantrasyon NaCI eklenerek çapraz bağ ve ters adımları 1.17.1 gerçekleştirin. - 1.22. Run kesme olup olmadığını kontrol etmek için% 1.5 agaroz jel üzerinde 10 ul DNA yıkandı500 bp ortalama bir yoğunlukta bp 700-300 arasında. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 17.949 x g&#39;de 10 dakika süre ile sonikasyon santrifüj örnekleri takip eder ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. <ol><li> Imalatçının protokolüne göre, ticari protein tahlil kiti kullanılarak protein tahmin gerçekleştirin. Deney ve kontrol örneklerinin ChIP için lizatın eşit miktarda kullanın. Genellikle, ChIP reaksiyon başına toplam lizatın 1 mg kullanın. </li></ol></li><li> Proteaz inhibitörü kokteyli içeren FA140 tamponu kullanılarak protein A-agaroz% 50 bulamaç hazırlanır. Proteaz inhibitör kokteyli 1/10 hacim. Toplam numune sayısına göre gerekli boncuk hacmini hesaplayın. <ol><li> FA140 tamponu ile yıkayın Protein A-agaroz taneleri iki depolama tamponunu çıkarın ve% 50 bulamaç yapmak için tanelere FA140 tamponuna eşit hacmi ekleyin. </li><li> , Spesifik olmayan boncuklara bağlanan proteinler kaldırmak Protein A-agaroz ve% 50 bulamaç 50 ul için30 dakika boyunca bir mikser içinde rotisserie sabit ucu-üzerinde uca döndürülerek 4 ° C&#39;de örnekleri cubate. </li></ol></li><li> Bir dakika boyunca 4 ° C&#39;de 956 x g&#39;de örnekleri dönerler. Süpernatant toplayın ve 8 ul H4K16ac antikor veya süpernatana 1 mg / ml SMARCA5 antikorun 5 ul (5 ug) ya da eklenmesi ile imüno gerçekleştirin. Bir et lokantası mikserde sabit uç-over-end rotasyon ile 4 ° CO / N inkübe edin. </li><li> &#39;Giriş&#39; kontrol için ekstraktı 1 / 10th kaydedin ve kenara -20 ° C&#39;de ayarlayın. Giriş IP örnekleri ile birlikte çapraz bağlanmış ters olması gerekmektedir. </li><li> Negatif kontrol numunesi olarak immüno-tavşan IgG eşit miktarda (1 mg / ml 5 ul) kullanın. </li><li> Ertesi gün, ekstraktı% 50 protein A-agaroz bulamacın 50 ul ve rotasyon ile 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 956 x g&#39;de santrifüj ile agaroz boncuklar Pelet, dikkatli bir şekilde süpernatan ve wa kaldırmaardışık olarak, aşağıdaki tampon maddeleri ile boncuk sh. Tampon hazırlıkları ise, sağ kullanımdan önce proteaz inhibitörleri ekleyin. <ol><li> Düşük Tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA140 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> Yüksek tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA500 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 500 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> LiCİ İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ucu-üzerinde uç rotasyon ile 4 ° C &#39;de 5 dakika süre ile (Tris-Cl pH 8.0, LiCI 250 mM,% 0.5 NP-40 ve% 0.5 sodyum deoksikolat, 10 mM nihai konsantrasyon) ile yıkayın. </li></ol></li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi yıkama sonrasında, 200 ul yıkama çözeltisi ve incubat (% 1 SDS ve 100 mM sodyum bikarbonat nihai konsantrasyon) ekleyinoda sıcaklığında ucu-üzerinde uç rotasyon ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ör. </li><li> Oda sıcaklığında 956 xg&#39;de örnekleri Spin ve yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe eluat aktarın. Ek 200 ul yıkama solüsyonu ile adımı yineleyin 1.15. </li><li> Taşıma ürününden 400 ul için, 0.16 M &#39;lik bir konsantrasyon NaCI ekleyin ve iyice karıştırın. <ol><li> Buna ek olarak, bir kenara bırakıldı 10 ul girişi (adım 1,11) 400 ul yıkama çözeltisi eklenmekte ve hem de çapraz giriş örnekleri ters 0.16 M&#39;lik bir konsantrasyona kadar NaCl ilave edin. 5 saat boyunca 65 ° C su banyosu içinde inkübe edilerek örnekleri çapraz bağlanması ters. </li></ol></li><li> Ters-çapraz bağlanmış, ayrılmış malzeme% 100 EtOH 1 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 2 için -80 ° C&#39;de inkübe - 3 saat ya da -20 ° CO / N oranında. 15 dakika boyunca 17.949 x g&#39;de örnekleri Spin ve etanol atın. </li><li> Pelet yıkamak için 800 ul% 70 etanol ekleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17.949 x g&#39;de Spin ve etanol atın. Herhangi bir kalıntı etanol çıkarmak için kısaca Spin. 1 için 37 ° C &#39;de numuneler hava-kurutun0 dakika geriye kalan etanolü atmak üzere. </li><li> 90 ul RNase DNA ve DNaz serbest su içinde çözülür ve 0.2 mg / ml nihai konsantrasyonda 2 ul 10 mg / ml RNase ekleyin. 30 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 ul 10x Proteinaz K tamponu (100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 5 SDS) eklenir. İyice karıştırın ve 1 saat süre ile 42 ° C &#39;de 1 ul Proteinaz K inkübe ekleyin. </li><li> Imalatçının protokolüne göre, ticari PCR saflaştırma kiti kullanılarak giriş ve yonga DNA saflaştınlır ve 50 ul su içinde elüt DNA. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklayın DNA arasında değişir. </li></ol> 2. Yuva yonga DNA bölgesinin Leke Analizi <ol><li> 280 değerinde bir spektrofotometre kullanılarak mil üreticinin protokolüne göre aşama 1,22 tarif edildiği gibi 50 ul su içinde elüt giriş ve yonga DNA verimini ölçün. </li><li> Algılama lineer aralığında olan giriş eşit hacimlerde (50 | il) veya immünopresipitasyon DNA al. <ol><li> Örneğin, eğer girişDNA verimi 1.5 ng / ml, daha sonra (toplam DNA ng veya 45) 30 ul almak ve su ile 50 ul hacmi hale getirilmesidir. Faktör ChIP için Adım 2.1 tamamını 50 ul eluat alıp 2.3 adıma geçin. </li></ol></li><li> 0.4 N NaOH, kısa bir süre vorteks ve 10 saniye boyunca 956 x g&#39;de santrifüj 2.5 hacmi eklenerek 50 ul giriş veya immünopresipitasyon DNA&#39;yı denatüre ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 10 sn için 956 x g&#39;de 1 M Tris-HCl, 175 ul, pH 6.8, girdap, santrifüj eklenerek denatüre DNA nötralize ve buz üzerinde örnekleri yer. </li><li> Aşağıda tarif edildiği gibi Slot Blot analizi için bir giriş seri dilüsyonu ve immünopresipitasyon DNA hazırlayın. <ol><li> Adımları 2.3 takip - 350 ul toplam numune hacmi elde etmek için 2.4 (örneğin, 50 ul giriş / yonga DNA, 125 ul 0.4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCI, pH 6.8). Not: Yukarıda belirtilen örnek için, giriş DNA 45 ng 0.129 ng / ml olarak sona erecek. </li><li> Giriş DNA, üç tüp etikets, 100, 50 ve 25 ve 100 ul, 50 ul ve denatüre edilmiş DNA, ve nötralize örnek 25 ul olarak. Nükleaz içermeyen su ile 100 ul son hacim sağlayın. ChIP DNA, etiket 200, 100 ve 50 ve 200 ul ekleyin üç tüp, 100 ul ve denatüre ve nötralize DNA örneği 50 ul. Nukleaz ücretsiz su ile 200 ul son hacim yapın. </li></ol></li><li> Slot Blot düzeneğinin büyüklüğüne zar kesilir. Önce 20x SSC içinde membran ve kurutma kağıtları Öncesi ıslak ve DNA eklemeden önce. Üreticinin protokolüne uygun olarak slot blot cihazının içine monte edin. </li><li> Uygun yuvalara adım 2.5.2 den Pipetleyin DNA. Zeta-prob zar üzerine DNA çekmek için yavaşça vakum uygulayın. Tüm numuneler aparatı sayesinde geçtikten sonra vakum durdurun. <ol><li> Aparat sökün ve hemen UV çapraz bağlayıcı kullanılarak zar üzerine DNA hareketsiz. UV çapraz bağlayıcı DNA tarafı yukarı ve au kullanınçapraz bağlayıcı ayarı tocrosslink. Üreticinin protokolü takip edin. </li></ol></li><li> Batı blotting gerçekleştirerek yuvası leke üzerinde BrdU Algılama. <ol><li> PBS içinde yağsız kuru süt,% 5 zara antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere, oda sıcaklığında 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (PBST) içeren bir membran bloke. </li><li> Birincil anti-BrdU antikoru (1: 500 seyreltme) ilave PBST içinde% 1 yağsız kuru süt içinde seyreltilir ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 3 saat primer antikor ile leke inkübe edin. Primer antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın. </li><li> Blot HRP-konjuge anti-fare ikincil antikor ekleyin (1: 5000 seyreltme) ile, 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. İkincil antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın. NOT: Tamamen birincil ve ikincil antikor inkubasyon sırasında membran kapsayacak antikorların yeterli hacim kullanın. </li></ol></li><li> ECL karışımı hazırlayın ve leke ac eklemeküreticinin protokolüne kordlardan seçilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ECL karışımı ile membran inkübe edin. <ol><li> , Bir X-ışını kasetine membran yerleştirin X-ışını filmine maruz membranı ve üretici protokolü kullanılarak leke gelişir. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, Resim J yazılımı kullanılarak blot tarama sonra giriş ve chiped DNA için elde edilen sinyal, sayısal olarak. Nicelendirilmesi için, ölçüm doğruluğunu sağlamak amacıyla tespit doğrusal aralığı içindedir sinyali kullanılır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li>
<li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

Birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarım yok.

Bu yazıda tarif edilen protokol, yeni çoğaltılmış ya da doğan DNA protein veya translasyon sonrası modifiye edilmiş formları varlığını göstermek için nispeten hızlı bir yöntemidir. Buna ek olarak, bu teknik, bir protein ya da doğan DNA ile değiştirilmiş bir biçiminin bağlanma-ayrılma kinetikleri ölçmek için bir olanak sağlamaktadır. Bu teknik zarif iPOND teknolojisi 13 tamamlayıcıdır. IPOND teknolojisinde, yeni sentezlenmiş DNA, etil deoksiüridin (edu) ile etiketlenir. Bir biyotin konjuge sonra tıklama kimyas...

Kusurlu DNA onarım ve / veya DNA replikasyon hücre ölümünü tetikleyebilir genom istikrarsızlık, önemli bir nedeni vardır. Tek onarılmamış çift iplikli sonu hücre ölümüne neden 1 için yeterlidir. Kromatin organizasyonu geçici, hem çoğaltma sırasında değişmiş ve 2,3 onarmak ve bu süreçlerin bütünlüğünü genom için bir tehdit neden olacaktır sırasında epigenetik bilgileri korumak için başarısızlık olduğunu. HDAC3 veya HDAC1,2 fonksiyon kaybı genotoksik strese (DNA hasarının) ve hücre ölümüne yol açan 4-9 S-faz ilerlemesi, DNA replikasyonu ve onarımı engellemektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde replikasyon, onarım ve kromatin bozabilir ve bu da büyümeyi durdurur ve hızlı bir şekilde büyüyen bir kanser hücrelerinde seçici hücre ölümünü teşvik DNA hasarına neden seçici HDAC inhibitörlerinin kullanımı pratik bir stratejidir. DNA replikasyonu sırasında, kromatin hızla sökülüp ve daha sonra DNA çoğaltılması takip yeniden birleştirilen. Yeni synthesized histon H4 kromatinden üzerine K5 ve K12 kalıntılarının (H4K5K12ac) ve aşağıdaki birikimi asetillenebilir edilir hızla histon deasetilazların (HDAC&#39;ler) 10,11 tarafından deasetile edilir. Histon deasetilasyonu ile oluşmakta olan kromatin bütünlüğünü korumak için hücrelerin hatası da, DNA hasarı ve hücre ölümüne neden olabilir çatal çöküşü, yol açabilir. Biz son zamanlarda HDAC1,2 selektif inhibisyonu artırır histon asetilasyonu (H4K5ac, H4K12ac ve H4K16ac) ve azaltılmış çoğaltma çatal ilerlemesi ile ilişkilidir doğmakta kromatin üzerinde SMARCA5 kromatin remodeler aktivitesini inhibe olduğunu gösterdi çatal çöküşü artmış ve çoğaltma strese bağlı DNA hasarı 6 arttı . Bu nedenle, HDAC inhibitörü tedavisi hızla bu hücrelerin döngüsü olarak, kanser hücrelerinde çok hızlı bir şekilde, DNA hasarı ve ölümü tetikleyebilir ve S-fazı yoluyla birçok kez geçmek için oluşmakta olan kromatin yapısını değiştirebilir. Bu HDAC&#39;ler histon asetilasyonunu ve protein Bindi düzenleyen nasıl işlediğini anlamak önemlidirng memeli hücrelerinde DNA replikasyonu korumak için. Kantitatif histon asetilasyonu ve DNA replikasyonu sırasında doğmakta olan DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını ölçmek için, bir modifiye ChIP tahlil BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği denilen geliştirmiştir. Bir yarık kullanılarak zar üzerine arzu edilen bir protein ya da histon modifikasyonu kromatin, immüno-çökeltme (chip) takiben, henüz olgunlaşmamış DNA miktarı BrdU etiketli yonga DNA batı analizi kullanılarak tespit edilebilir çips numunesi olarak (timidin analoğu BrdU ile işaretlenmiş) transfer Leke aygıt. Bu tekniği kullanarak, H4K16ac (kromatin paket yer alan bir marka) ve ISWI aile üyesi SMARCA5 (kromatin SWI / SNF ilişkili matris ile ilişkili aktin bağımlı regülatör) kromatin remodeler S-fazı hücrelerinde doğmakta olan DNA ile ilişkili olduğunu göstermiştir 6. Biz de doğmakta olan H4K16ac işareti DNA replikasyonu sırasında 6 HDAC1,2 tarafından deasetile olduğunu gördük. H4K16ac inhibeISWI aile üyesi SMARCA5 12 kromatin remodeler aktivitesi. Bu nedenle, BrdU-CHIP-Slot-Batı tekniği kullanılarak, DNA replikasyonu sırasında kromatin remodeling düzenlenmesinde HDAC1,2 işlevlerini bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, BrdU-çip-Slot Blot tekniği kantitatif oluşmakta olan DNA&#39;ya bağlanan proteinlerin ya da bunların post-translasyonel modifikasyonlar, birleşme ve ayrılma dinamiklerini ölçmek için güçlü bir yaklaşım.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westernler)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Aktif Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agaroz</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG & nbsp;</td><td>Kırlangıç</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Şirketi</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC ile arıtılmış su</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Mallinckrodt GenAR ve nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kuru süt</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ışını filmi</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirici</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Çapraz Bağlayıcı</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson Sonifier&nbsp; Dijital Ultrasonik Hücre Bozucu</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spektrofotometre</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Yuva Leke aparatı&nbsp;</td><td>Schleicher ve Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü İnkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Su Ceketli CO2 İnkübatörleri</td><td></td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerde nascent dna bound proteinlerin incelenmesi brdu chip-slot-batı tekniği

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histon deasetilaz 1 ve 2 (HDAC1,2) DNA replikasyonunun bölgelerine yerleşemez. Önceki bir çalışmada, seçici bir inhibitörü ve genetik demonte sistemi kullanılmasıyla, çoğalma çatala ilerlemesi ve memeli hücrelerinde doğmakta olan kromatin bakım HDAC1,2 için yeni fonksiyonlar göstermiştir. Ayrıca, yuva leke ile brom-deoksiüridin (BrdU) -etiketli DNA kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve Batı nicel doğmakta olan DNA ile ilişkili proteinler veya histon modifikasyonu ölçmek için analizler bir BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği kullanılmıştır. Aktif bölünen hücreler HDAC1,2 selektif inhibitörü ile tedavi edilebilen veya HDAC1 ve HDAC2 karşı siRNA&#39;lar transfekte edilmiş ve daha sonra, yeni sentezlenmiş DNA, timidin analog bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir edildi. Önemli bir hücre döngüsü tutuklama veya apoptozis varken BrdU etiketleme nedeniyle HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybına bağlı olarak bir zaman noktasında yapılmıştır. Aşağıdakı lBrdU histon asetilasyonu bakışı, Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) veya kromatin remodeler hücrelerin Abeling spesifik antikorlar ile gerçekleştirildi. BrdU etiketli giriş DNA çökeltilmiş (veya chiped) DNA daha sonra slot blot tekniği kullanılarak bir membran üzerine noktalar ve UV kullanılarak immobilize edildi. Her yuvaya doğmakta olan DNA miktarı, kantitatif bir anti-BrdU antikoru ile Western analizi kullanılarak değerlendirildi. Yeni sentezlenen DNA ile ilişkili histon asetilasyonu işaretleri ve kromatin Remodeler seviyeleri üzerindeki HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybı etkisinin daha sonra kontrol numunelerine ile muamele edilmiş örneklerde elde edilen BrdU-yongası sinyali normalize ederek belirlenir.

HDAC1,2 seçici önleyicileri özgüllüğünü belirlemek için, Hdac1,2 FL / FL ve HDAC3 FL / FL fibrosarkom hücreleri kullanıldı. Adenovirüs içeren Cre rekombinaz (Cre Ad-) bu hücrelerde Hdac1,2 ve HDAC3 silmek için kullanılmıştır. Hdac1,2 FL / FL ardından Ad-Cre enfeksiyonu Hücreler, H4K5ac sağlam bir artış gözlenmiştir. 233 ya da 898 ile Hdac1,2 knockout hücre tedavisi 233 ve 898, bu ...

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Bu prosedürün genel amacı, BrdU etiketleme ve kromatin çökeltme kullanarak yeni oluşan DNA'ya bağlı proteinleri doğru bir şekilde hızlı bir şekilde incelemektir. Bu yöntem, DNA replikasyonu sırasında hangi proteinlerin yeni oluşan DNA'ya bağlandığı ve replikasyon stresi sırasında hangi onarım proteinlerinin yeni oluşan DNA'ya bağlandığı gibi, kromatin alanındaki replikasyon, onarım ile ilgili temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yeni ortaya çıkan DNA'ya bağlı proteinleri oldukça kantitatif bir şekilde tespit etmek için nispeten hızlı bir yöntem olmasıdır.Başlamak için, DMSO veya inhibitörlerle 10 mililitre ortamda iki milyon NIH 3T3 hücresinin kültürlerini kurun. Ayrıca, BrdU'yu 20 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin. Kaplandıktan sonra, hücreleri 60 dakika inkübe edin.Bir saat sonra, formaldehiti doğrudan kültür ortamına hacimce% 1'lik bir konsantrasyona ekleyerek hücre içi proteinleri DNA'ya çapraz bağlayın. Daha sonra, hücrelerin çalkalama ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin. 10 dakika sonra, ortama 125 milimolar'a glisin ekleyerek reaksiyonu söndürün ve inkübasyona beş dakika daha devam edin.Daha sonra, hücreleri PBS'de toplayın ve santrifüjleme kullanarak PBS ile iki kez yıkayın. Pelet, istenirse depolama başına 80 santigrat derecede dondurulabilir. Şimdi, çapraz bağlı hücrelerden lizatı hazırlayın, proteaz inhibitörü kokteyli ile takviye edilmiş 500 mikrolitre FA140 tamponunu pelete ekleyin ve beş adet 15 saniyelik sonikasyon darbesi kullanarak kromatini kesin.Hücreleri darbeler arasında soğuk tutun. Ardından, kesmenin verimliliğini teşhis etmek için %1,5'lik bir jel üzerinde 10 mikrolitre numune çalıştırın. Kesildikten sonra, numuneleri 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.Ardından, bir kit kullanarak süpernatanttaki protein konsantrasyonunu tahmin edin. Daha sonra, proteaz inhibitörü içeren FA140 tamponu ile% 50'lik bir Protein A Agaroz boncuk bulamacı hazırlayın. Her numuneye 50 mikrolitre bulamaç ekleyin ve numuneleri 30 dakika boyunca sabit uçtan uca dönüşle 4 santigrat derecede inkübe edin.Yarım saat sonra, numuneleri soğutmalı bir santrifüjde yaklaşık 1000 G bir dakika döndürün. Ardından, etiketli kromatini içeren süpernatanı toplayın. Devam etmeden önce, daha sonra giriş kontrolü olarak hizmet etmek için ekstraktın 1 / 10'unu 20 santigrat derecede kaydedin.Kromatini immünopresipite etmek için, süpernatanlara sekiz mikrolitre H4K16ac antikoru veya beş mikrogram SMARCA5 antikoru ekleyin. Ayrıca, negatif kontrol numunesi olarak işlev gören ekstrakta beş mikrogram hızlı IgG ekleyin. Kromatini bir et lokantası mikserinde gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, hazırlanan% 50 Protein A Agaroz bulamacından 50 mikrolitre immünopresipitasyonlara ekleyin ve karışımları rotasyonla 4 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, Agarose boncuklarını peletleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. Şimdi, boncukları üç ardışık tamponda 4 santigrat derecede uçtan uca dönüşler kullanarak yıkayın.İlk olarak, beş dakika boyunca taze hazırlanmış, az tuzlu bağışıklık kompleksi yıkama tamponu kullanın. İkinci olarak, beş dakika boyunca taze hazırlanmış, yüksek tuzlu bağışıklık kompleksi yıkama tamponu kullanın. Üçüncüsü, beş dakika boyunca taze hazırlanmış, Lityum klorür bağışıklık kompleksi yıkama tamponu kullanın.Yıkamalardan sonra, metinde açıklandığı gibi numunelere elüsyon çözeltisi ekleyin. Numuneleri döndürün ve elüatı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Şimdi, çapraz bağlanmayı tersine çevirmek için numuneleri 65 santigrat derecede 5 saat inkübe edin.Daha sonra DNA'yı çökeltin. Numunelere bir mililitre% 100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, 80 santigrat derecede iki ila üç saat veya gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.Çökeltmeden sonra, etanolü 18000 G'de 15 dakikalık bir ceintrifugation ile çıkarın. Ardından, metin protokolünü izleyerek, peleti yıkayın, numuneleri RNaz ile muamele edin, ardından Proteinaz K ile muamele edin, metinde açıklandığı gibi DNA'yı saflaştırın ve son olarak 20 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, bir spektrofotometrede girdi ve ChIP DNA'nın verimini ölçün.Ardından, numuneleri denatüre edin. 2.5 hacim 0.4 normal sodyum hidroksit ekleyin, kısaca vorteksleyin ve santrifüjleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, 175 mikrolitre bir molar Tris hidroklorür pH 6.8 ekleyerek denatüre DNA'yı nötralize edin.Vorteks, santrifüj ve numuneleri buzun üzerine yerleştirin. Şimdi, girdi ve immünopresipite DNA'nın seri dilüsyonlarını hazırlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi slot-blot testine devam edin. Leke üzerindeki DNA UV ile hareketsiz hale getirildikten sonra, western blot kullanarak slot lekesi üzerindeki BrdU'yu tespit edin.İlk olarak, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için zarı PBST'de %5 yağsız kuru sütle oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin. Daha sonra, 1:500 seyreltilmiş anti-BrdU antikoru eklenmiş PBST'de% 1 yağsız kuru süt banyosu hazırlayın. Bu banyodaki lekeyi bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin.Daha sonra membranı PBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra, lekeyi PBST'de 1:5000 oranında HRP konjuge anti-fare ikincil antikoruna batırın. Çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.İkincil olanı çıkarmak ve sonucu analiz etmek için PBST ile üç yıkama kullanın. Yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili H4K16ac miktarını belirlemek için BrdU H4K16ac ChIP slot western tekniği kullanıldı. Hızlı IgG kontrolü ile karşılaştırıldığında, yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili H4K16ac'de sağlam bir zenginleştirme gözlendi.HDAC1/2'nin bileşik 233 ile inhibisyonunu takiben, yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili H4K16ac'de bir artış gözlendi. Aynı sonuç, 898 bileşiği kullanılarak elde edildi. Son olarak, yeni oluşan DNA üzerindeki SMARCA5 kromatin yeniden şekillendirici seviyesi, BrdU SMARCA5 ChIP slot western tekniği kullanılarak belirlendi.Gerçekten de, yeni ortaya çıkan DNA ve bileşik 898 ile ilişkili SMARCA5, SMARCA5 seviyelerini değiştirmedi. Bu videoyu izledikten sonra, memeli hücrelerinde DNA replikasyonu sırasında kromatin ve kromatin modifiye edici enzimlerde meydana gelen değişiklikleri iyi anlamış olmalısınız. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, replikasyon alanındaki araştırmacıların, yeni ortaya çıkan DNA'daki kromatin değişikliklerinin yanı sıra, yeni ortaya çıkan DNA üzerindeki DNA onarım proteinlerinin dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.Gelecekte, bu teknik, çataldaki histon modifikasyonlarını ve kromatin modifiye edici enzimleri incelemenin yanı sıra, durmuş çataldaki DNA hasar tepkisinin ve DNA onarım proteinlerinin dinamiklerini incelemek için de kullanılabilir.

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Bu videoda BrdU immünofloresan boyama protokolü açıklanmaktadır. Teknik, hücre döngüsünün farklı aşamalarındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verir. DNA boyalarının ve antikor etiketlemesinin eklenmesi, daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderinin ayrıntılı analizine izin verir.

BrdU İmmünofloresan Boyama: Hücre Döngüsünün Farklı Aşamalarındaki Hücreleri Tanımlamak İçin Bir Teknik

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Aşağıdaki protokol, hücre döngüsü senkronizasyonu ve ardından RPA2 immünofloresan boyama kullanılarak hücre döngüsünün G1 fazında tek sarmallı DNA odaklarının saptanmasını sunar.

Hücre Döngüsünün G1 Fazında Tek Sarmallı DNA Odaklarının Görselleştirilmesi

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Laminopati bozuklukları genellikle nükleer zarfta değişikliklere yol açar ve bu da nükleer kanama ve sızıntıya neden olabilir. Bu çalışma, memeli hücrelerinde nükleer yapıyı ve bütünlüğü değerlendirmek için bir araç sağlayan, çift sarmallı DNA (dsDNA) ile birlikte nükleer laminayı görselleştirmek için bir immünofloresan yöntemi sunmaktadır.

İmmünofloresan ile Memeli Hücrelerinde Nükleer Kanama ve DNA Sızıntısının Tespiti

Keşfedin, BrdU ChIP-Slot-Batı tekniğiyle memeli hücrelerde yeni sentezlenen DNA'ya bağlı proteinleri ve histon modifikasyonlarını hızlıca inceleyin. Bu yöntem, DNA replikasyonu ve onarımı sırasında protein etkileşimlerini nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Daha fazla video keşfet