Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Bu Zaman Atlamalı Video Mikroskobisi'nin genel amacı, mitofaji süreci sırasında hasarlı mitokondrilerin Parkin aracılı seçici olarak uzaklaştırılmasını takip etmektir. Bu yöntem, mitofajinin kalıcı patolojik durumları nasıl etkilediği gibi moleküler metabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, etiketli proteinlerin moleküler süreçleri sırasındaki dinamiklerini takip etmek için çok güçlü bir araç sunmasıdır.

Bu yöntem, mitokondriyal yaşam döngüsü hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca primer hücre kültürleri, embriyoloji çalışmaları ve bir öncelik tahmini gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu çalışmada kullanılan ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblastları, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de, on santimetrelik bir doku kültürü plağında tamamlayıcı DMEM besiyerinde büyütülür.

Hücreler yüzde 80 konfluense ulaştığında, besiyerini steril vakumla uzaklaştırın ve on mililitre steril PBS ekleyin. PBS'yi uzaklaştırın ve bir mililitre yüzde 0,25 Trypsin EDTA ekleyin. Plakayı, hücreler kopana kadar 37 °C'de iki ila üç dakika inkübe edin.

Dört mililitre komple DMEM medyum ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Hemositometre ile sayım yapmak için hücre süspansiyonundan on mikrolitre alın. On santimetrelik bir doku kültürü plağına 1x10⁶ hücre ekleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve daha önce gösterildiği gibi tripsinizasyonla hücreleri ayırın. Dört mililitre tam DMEM besiyeri ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 250 gs ve dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve pelletini bir mililitre steril PBS içinde yeniden süspande edin. Hücreleri tekrar santrifüjleyin. İkinci santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın.

Hücre peletine 100 µL elektroporasyon için hazırlanan çözelti karışımı ekleyin ve peleti pipetleyerek nazikçe yeniden süspande edin. Ardından, hücre süspansiyonuna 2 µg EYFP Parkin ekspresyon plazmidi ve 1 µg DsRed2 Mito ekspresyon plazmidi ekleyin. Çözeltiyi steril bir küvete aktarmak için tek kullanımlık Pasteur pipeti kullanın.

Hücreleri önceden ayarlanmış bir program kullanarak elektropore edin. Elektroporasyondan hemen sonra, hücrelere 500 µL taze, önceden ısıtılmış tamamlayıcı DMEM ortamı ekleyin ve hücreleri altı santimetrelik canlı görüntüleme sınıfı bir doku kültürü plağına ekin.

Hücreleri, yüzde beş karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de 24 saat boyunca inkube edin. Bu prosedüre başlamadan önce, mikroskobun haznesinin sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. Ardından; yüzde on FBS, litre başına iki milimolar L-Glutamin, mililitre başına 100 ünite penisilin ve mililitre başına 100 miligram streptomisin ile desteklenmiş fenolsüz DMEM'yi karıştırarak spesifik bir canlı görüntüleme ortamı hazırlayın.

Besiyerini bir su banyosunda 37 °C'de önceden ısıtın. Elektropore edilmiş hücrelerin besiyerini steril aspirasyonla uzaklaştırın ve bir mililitre önceden ısıtılmış canlı görüntüleme besiyeri ekleyin. Plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Mikroskop odasının 37 °C'lik sabit bir sıcaklıkta olduğu onaylandıktan sonra, odaya yüzde beş karbondioksit verilmelidir. Elektropore edilmiş hücreleri içeren plak, büyük hareketler veya sarsıntılar olmadan dikkatlice mikroskop odasına yerleştirilmelidir.

Yazılım arayüzünü kullanarak mikroskobu, EYFP Parkin ve DsRed2 Mito ekspresyon vektörleri tarafından kodlanan füzyon proteinlerinden gelen floresan sinyalleri tespit edecek şekilde ayarlayın. Time lapse video mikroskopi yazılımını açın. Üst menüden, EYFP Parkin için FITC'yi ve DsRed2 Mito için Rhodamine'i seçin.

20X büyütmeyi seçin. Yazılım arayüzünü kullanarak, her iki kotransefte vektörü de eksprese eden tek bir hücre bulun ve konumunu kaydedin. Bunu her deneysel koşul için en az 10 hücrede gerçekleştirin.

Menüden Apps seçeneğini seçin ve Multi Dimensional Acquisition'a tıklayın. Multi Dimensional Acquisition pencerelerinden; kayıt sayısı, her kayıt arasındaki zaman aralığı ve kaydedilen hücrenin konumu gibi gerekli parametreleri seçin. Her iki floresan sinyalinin bazal kayıt işlemini başlatmak için Acquire'a tıklayın.

Toplam on beş dakikalık bir süre boyunca her beş dakikada bir görüntüler toplayın. Görüntüleme işlemi devam ederken, final çalışma konsantrasyonunun iki katı konsantrasyonda Karbonil Siyanür 4 triflorometoksi fenilhidrazon veya FCCP içeren, önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamını hazırlayın. Görüntüleme işlemini durdurun ve önceden ısıtılmış FCCP'li canlı görüntüleme ortamından bir mililitreyi mikroskobun haznesindeki plağa nazikçe ekleyin.

FCCP eklendikten sonra, görüntüleme işlemini yeniden başlatmadan önce mikroskobun odağını tekrar ayarlamak önemlidir. Görüntüleme sürecini daha önce açıklanan şekilde yeniden başlatın ve kaydedilen konumu kullanarak toplam üç saatlik bir süre boyunca görüntüler toplayın. Görüntüleme işlemi tamamlandığında, edinilen tüm görüntüleri daha sonraki analizler için kaydedin.

Burada, FCCP uygulamasından önce fibroblastlardaki EYFP-Parkin ve DsRED2-Mito floresan sinyallerinin zaman geçişli görüntüleri gösterilmektedir. Beyaz kutular, sağdaki ilgili panellerin büyütülmüş alanlarını temsil etmektedir. Bazal zaman noktaları boyunca, yeşil renkte görselleştirilen EYFP-Parkin, hücre boyunca homojen bir şekilde yayılmıştır.

Beyaz oklarla belirtildiği üzere, kırmızı renkte görselleştirilen mitokondri ağı iyi bir şekilde birbirine bağlı görünmektedir. FCCP uygulamasının ardından, beşinci dakikada membran depolarizasyonuna bağlı olarak mitokondri fraksiyonalizasyonu gözlemlenir. Buna rağmen, EYFP-Parkin sitoplazma boyunca hala homojen bir şekilde yayılmış durumdadır.

FCCP uygulamasından 55 dakika sonra, EYFP-Parkin, mitofaji sürecini tetiklemek için hasarlı mitokondriyal membranlara çekilir. FCCP uygulamasını takiben EYFP-Parkin'in mitokondriyal membrana hareketi, bu temsilci zaman atlamalı filmde gösterilmektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütülürse iki saat içinde tamamlanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, otofaji alanındaki araştırmacıların mitokondriyal geri dönüşüm deneyleri yapmalarının önünü açmıştır. Bu sayede hücrelerin, mitofaji sürecini hücrelerdeki bir mitokondriyal kalite kontrol mekanizması olarak incelemelerine olanak sağlanmıştır.