Name: Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Öğrenin, EYFP-Parkin toplanmasını zaman atlamalı video mikroskopi ile değerlendirerek mitofaji dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, canlı hücrelerde protein dinamiklerini izlemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen NIH hibeleri (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to RGP), Kimmel Kanser Merkezi NIH Kanser Merkezi Çekirdek hibe P30CA056036 (RGP), Meme Kanseri Araştırma Vakfı'ndan bir hibe, Dr. Ralph ve Marian C. Falk Medical Research Trust'tan (RGP) cömert hibeler ve Pennsylvania Sağlık Bakanlığı'ndan (RGP) bir hibe ile desteklenmiştir. Kısmen, bu çalışma bir Amerikan İtalyan Kanser Vakfı doktora sonrası bursu (GD) ve Sidney Kimmel Kanser Merkezi'nin Biyogörüntüleme Ortak Kaynağı (NCI 5 P30 CA-56036) tarafından desteklenmiştir. Bakanlık, bir analiz, yorum veya sonuç için sorumluluğu özellikle reddeder. Bu el yazması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Hem ifade vektörleri EYFP-Parkin ve pDsRed2-Mito ile fibroblast 1. elektroporasyonu <ol><li> 100 mg / ml DMEM (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı),% 10 fetal bovin serumu, 2 mmol / L L-glutamin, 100 U / ml penisilin ortamı kullanılarak 10 sm doku kültürü plakasında ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblast hücreleri büyür ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde kültürlendi. <ol><li> % 80 hücre Akışların birleştiği yerde hücreler, HPO 4, KH 2.4 g, steril emilerek tam bir DMEM ortamıyla atmak ve steril 1 x fosfat tampon çözeltisi (10 ml PBS) (NaCl 80 g, KCl 2.0 g, Na 2, 14.4 g ekleme 7.4): 2 PO 4 ve 1 L H2O PH damıtıldı. </li><li> Steril emme PBS atın ve Tripsin-EDTA% 0.25 1 ml ekleyin. (- 3 dk 2) Hücreler müstakil kadar 37 ° C&#39;de inkübe plakası. _, Tam DMEM orta 4 ml ekleyin hücreleri tekrar süspansiyon ve 10 çıkar6; hemositometre sayımı hücre süspansiyonu l. Not: 16 Köşe kareler bir takım hücre sayısı hücrelerin x 10 4 / mi sayısına eşit olacak şekilde hemositometre tasarlanmıştır. </li></ol></li><li> Elektroporasyon işlemine 24 saat önce 10 cm doku kültürü yemekleri üzerine Tohum 1 x 10 6 hücre. </li><li> Steril emilerek tam bir DMEM ortamıyla atın ve steril 10 ml PBS ilave edin. Steril emme PBS atın ve Tripsin-EDTA% 0.25 1 ml ekleyin. (- 3 dk 2) Hücreler müstakil kadar 37 ° C&#39;de inkübe plakası. tam bir DMEM ortamıyla 4 ml ilave edilir ve 15 ml&#39;lik bir tüp içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> bir buzdolabında-santrifüj (4 ° C) ile 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. Steril emme Süpernatantı atın ve steril PBS 1 ml pelletini. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Steril emerek supernatant atmak ve 100 ul o ekleyinelektroporasyon f çözüm karışımı hücre pelet (82 Company solüsyon 1 elektroporasyon Çözüm V + 18 ul ul) ve hafifçe pipetleme pelletini (Daha fazla bilgi için kullanım kılavuzuna başvurun). hücre süspansiyonu de EYFP-Parkin (uyarma / emisyon 514/527) ve 1 mcg pDsRed2-Mito (uyarma / emisyon 565/620) 2 ug ekleyin. </li><li> tek kullanımlık pastör kullanarak steril küvete solüsyonu (her iki araç kiti ile birlikte sağlanır) aktarın ve önceden ayarlanmış bir program NIH / 3T3 U-030 (Tek nabız, gerilim 200 V, kapasitans 960 mF, darbe süresi 20 milisaniye kullanarak electroporate , darbe sayısı: 1). </li><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde bunları hemen Elektroporasyon işleminden sonra, taze, önceden ısıtılmış tam bir DMEM ortamıyla 500 ul ve 6 cm doku kültürü plakası, canlı görüntü dereceli hücreyi tohum ve inkübe 24 saat. </li></ol> 2. Time-Lapse video Mikroskopi <ol><li&gt; Kullanmadan önce 37 ° C&#39;de mikroskop odasının sıcaklığı ayarlayın. </li><li> Bu noktada deney protokolü ile devam etmek için, belirli bir canlı görüntüleme ortamı hazırlar. aşağıdaki gibi canlı görüntüleme ortamı hazırlayın; karıştırın DMEM fenol içermeyen,% 10 fetal bovin serumu, 2 mmol / L L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. Bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de, canlı görüntü ortamı önceden ısıtın. </li><li> Steril emilerek elektroporasyona hücre ortamı atılır ve P1000 pipet kullanarak, önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamının 1 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle plaka inkübe edin. </li><li> 37 ° C&#39;lik bir sabit sıcaklıkta önce mikroskop odasındaki Plaka, inkübasyon süresi, akış,% 5 CO2 içinde. </li><li> büyük hareketler ya da salınımları kaçınarak mikroskobun odasına Electroporated hücreleri ile plaka koyun. </li><li> Yazılım arayüzü kullanarak, her iki fluore tespit etmek için mikroskop ayarlamakko-transfekte vektörler tarafından kodlanan füzyon proteinleri scence sinyalleri EYFP-Parkin ve (Uyarım aralığı 495 nm ve emisyon aralığı yeşil 520-550 nm, 510) pDsRed2-Mito (Uyarım maksimum 558 nm ve emisyon maksimum 583 nm, kırmızı). <ol><li> time-lapse video mikroskopi yazılımını açın. Üst menüde pDsRed2-Mito için EYFP-Parkin ve rodamin için FITC seçin. Üst menüde büyütme (20X) seçin. </li></ol></li><li> yazılım arayüzü kullanarak, hem birlikte transfekte vektörleri ifade tek bir hücre için bakmak ve konumunu kaydeder. 10 hücrelerinin en az her deneysel koşul (Deney grubu) için toplanana kadar bu adımı tekrarlayın. <ol><li> menu &quot;Uygulamalar&quot; ı seçin ve Çok Boyutlu Edinme tıklayın. Çok Boyutlu Toplama pencerelerinde bu tür satın almalar sayısı, her satın alma ve kaydedilen hücrenin konumu arasındaki zaman aralığı olarak gerekli parametreleri seçin. Edinme &quot;üzerine tıklayın&quot;Satın alma işlemini başlatmak için. </li></ol></li><li> EYFP-Parkin ve 15 dakika olmak üzere toplam aralığı için görüntüleri her 5 dakikada toplama DsRed2-Mito floresan sinyal hem bazal alımı başlatabilirsiniz. </li><li> son çalışma konsantrasyonu iki katından daha yüksek bir FCCP bir konsantrasyon ile önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamı hazırlayın (0,1-10 uM, hücre tipine bağlı olarak). </li><li> satın alma işlemini kesintiye ve P1000 pipet kullanarak mikroskobun odasının içine plakasına FCCP önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamı yavaşça 1 ml ekleyin. </li><li> daha önce kaydedilmiş konumu kullanarak, 3 saatlik bir toplam süre için, tarif edildiği gibi elde etme işlemi başlatın. bunları analiz ve satın alma bittiğinde mitophagic sürecinin bir video oluşturmak için tüm kazanılmış görüntüleri kaydedin. </li></ol> 3. Analiz <ol><li> Bir kişisel bilgisayarda &quot;.tiff&quot; biçiminde tüm kazanılmış görüntüleri toplayın </li><li> Bir grafik yumuşak görüntüleri açıngereçleri ve zamansal aralık define (Görüntüler her 5 dakika edinilen) mitokondrial membran içine Parkin istihdamı gösteren ilk görüntüye FCCP mitokondriyal kaynaklı-depolarizasyon dan oluştu. Deney grubunda, her bir hücre için, bu analiz tekrarı. </li><li> Deney grubu adıyla bir tablo üzerinde sütunun ilk hücresini Etiket. her bir deney grubu için, 10 hücreleri en az Parkin alımı için zamansal aralıkları ölçmek. Parkin işe alım için hesaplanan geçici aralıklarla ortalama yapın ve her bir deney grubu için standart sapmayı tanımlamak (Ortalama ± SD, n = 10). <ol><li> sütun tek hesaplanan geçici aralıklarla içine düzenleyin. Her sütun n = deney grubunun 10 ölçümlerini içerir. </li><li> Formula Builder menüden fonksiyon &quot;ortalama&quot; seçeneğini seçin. sütunundaki verileri seçin. Formula Builder menüden fonksiyon &quot;Standart Sapma&quot; seçeneğini seçin. Selesütundaki veriler, CT. </li></ol></li><li> istatistiksel bir yaklaşım kullanarak, deney grupları arasında mitophagy dinamiği önemli bir fark tanımlamak için uygun istatistik uygulayarak deney grupları karşılaştırmak. (Örneğin, iki grup = Student t-testi, üç veya daha fazla gruplar = ANOVA artı bir post-hoc testi) </li></ol>

<ol><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).</li>
<li>Zhi, X., Zhong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Autophagy in cancer.</a> F1000Prime Rep. 7, 18(2015).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biol Chem. 393, 547-564 (2012).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+mitochondrial+autophagy%2C+or+mitophagy%2C+as+a+targeted+defense+against+oxidative+stress%2C+mitochondrial+dysfunction%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging.</a> Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).</li>
<li>Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uth1p+is+involved+in+the+autophagic+degradation+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria.</a> J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).</li>
<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).</li>
<li>Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+mechanisms+and+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy mechanisms and role in human diseases.</a> Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).</li>
<li>Di Sante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+sirt1+promotes+prostatic+intraepithelial+neoplasia%2C+reduces+mitophagy%2C+and+delays+park2+translocation+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria.</a> Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).</li>
<li>Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin-mediated+selective+mitochondrial+autophagy%2C+mitophagy%3A+Parkin+purges+damaged+organelles+from+the+vital+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network.</a> FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).</li>
<li>Shiba-Fukushima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-mediated+phosphorylation+of+the+Parkin+ubiquitin-like+domain+primes+mitochondrial+translocation+of+Parkin+and+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy.</a> Sci Rep. 2, 1002(2012).</li>
<li>Trinh, J., Farrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417, 1-13 (2009).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wild+type+and+mutant+ELOVL4+in+cell+culture%3A+subcellular+localization+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability.</a> Mol Vis. 10, 248-253 (2004).</li>
<li>Jin, S. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-mediated+mitophagy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance.</a> J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).</li>
<li>Kerr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+macropinosome+maturation+by+the+recruitment+of+sorting+nexins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins.</a> J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).</li>
<li>Edin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+gel+culture+and+time-lapse+video+microscopy+of+the+human+vestibular+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve.</a> Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).</li>
<li>Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPI-2+type+III+secretion+system+restricts+motility+of+Salmonella-containing+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles.</a> Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).</li>
<li>Meseguer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+incubation+and+selection+in+a+time-lapse+monitoring+system+improves+pregnancy+outcome+compared+with+a+standard+incubator%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study.</a> Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).</li>
<li>Campbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+a+risk+classification+of+aneuploidy+in+human+embryos+using+non-invasive+morphokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics.</a> Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510, 370-375 (2014).</li>
<li>Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+sensitizes+toward+apoptosis+induced+by+mitochondrial+depolarization+through+promoting+degradation+of+Mcl-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1.</a> Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).</li>
<li>Batlevi, Y., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+autophagy+in+neural+function%2C+neurodegenerative+disease%2C+neuron+cell+death%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging.</a> Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).</li>
<li>Frank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+is+triggered+by+mild+oxidative+stress+in+a+mitochondrial+fission+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation.</a> Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variants+of+mitochondrial+autophagy%3A+Types+1+and+2+mitophagy+and+micromitophagy+%28Type+3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3).</a> Redox Biol. 2, 749-754 (2014).</li>
<li>Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+mitochondrial+electron+transport+and+energy+coupling+by+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light.</a> Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).</li>
<li>Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblast+alterations+induced+by+low+power+laser+irradiation+at+the+single+cell+level+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).</li>
<li>Kim, I., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+selectively+degrades+individual+damaged+mitochondria+after+photoirradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation.</a> Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Time-lapse mikroskopi uzun süre boyunca hücresel dinamiklerinin gözlem zamanında tek bir gözlem canlı hücre görüntüleme uzanan tekniği olarak tanımlanabilir. bu gözlemci gerçek zamanlı olarak tek bir floresan etiketli protein tespit ve tek bir canlı hücrenin içinde kendi dinamiğini takip sağlar, çünkü bu yöntem, basit bir konfokal veya canlı hücre mikroskopi ayrılır. Aslında, konfokal mikroskopi kolayca flüoresan antikor kullanılarak imüno-etiketli proteinlerin tanımlar, ancak, hücre ve canlı ortamda molekül etkinlik gö...

Makro otofaji, organeller ve proteinler gibi hem hasarlı hem de işlevsiz hücresel bileşenlerin geri dönüşüm veya enerji üretimi amacıyla katabolik bozunmasını içeren hücre içi bir süreçtir. Bu metabolik süreci başlatmak için hücre, hasarlı hücresel bileşenleri, bir lizozomla birleşen ve içeriği bozulan ve geri dönüştürülen otofagozom olarak bilinen çift zarlı bir yapıya yutar 1,2. Seçici olmayan ve seçici olmak üzere iki ana otofaji türü vardır. Seçici olmayan otofaji süreci, hücre besin yoksunluğu koşulları altındayken ve hem temel besinleri hem de enerjiyi temizlemesi gerektiğinde ortaya çıkar. Bununla birlikte, seçici otofaji, hem işlevsiz / hasarlı organellerin hem de aksi takdirde toksik olabilecek proteinlerin uzaklaştırılmasına aracılık etmek için ortaya çıkar. En çok çalışılan seçici otofaji süreçlerinden biri, mitofaji 1,3-5 olarak adlandırılan mitokondrinin uzaklaştırılmasıdır.
Mitokondri, hücre metabolizması için merkezi organellerdir ve elektron taşıma zinciri, yağ asidi oksidasyonu ve trikarboksilik asit (TCA) döngüsü yoluyla oksidatif fosforilasyon yoluyla birincil adenozin trifosfat (ATP) kaynağıdır. Ayrıca mitokondri, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini düzenler ve hücre ölüm yollarına 6-8 katılan proteinleri serbest bırakır.
PTEN ile indüklenen varsayılan kinaz 1 (PINK1) ve Parkin RBR E3 ubikitin ligaz (Parkin), mitofaji sürecinde yer alan anahtar proteinlerdir. Parkin, mitokondriyal kalite kontrolü9 yoluyla hücreyi sağlıklı tutarak hücre ölümüne karşı koruma sağlayabilir. Mitokondriyal membran potansiyelinin kaybı üzerine, sitozolik Parkin, PINK1 tarafından mitokondriye alınır. Bu işe alım, mitofaji 10'un ardışık olaylarını tetikler. Mitofajinin temel bir mitokondri kalite kontrol süreci olduğuna ve bu süreçteki anormalliklerin hastalığa neden olduğuna dair çok çeşitli kanıtlar vardır 7. Örneğin, otozomal resesif Parkinson hastalığı, Parkin ve PINK1'i kodlayan genlerdeki mutasyonlarla ilişkilendirilmiştir (sırasıyla PARK2 ve PINK1) 11. Mitokondriyal sağlığın kalite kontrolü, ROS12 birikimine katkıda bulunan mitokondrinin uzaklaştırılması için gereklidir. Hücre içi ROS'un aşırı varlığı hem nükleer hem de mitokondriyal DNA'nın (sırasıyla DNA ve mt DNA'sı) hasarına yol açabilir.
Burada, karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) -fenilhidrazonun (FCCP) in vitro uygulaması yoluyla ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblastlarında Parkin aracılı mitofajinin indüksiyonundan sonra Parkin agregasyonunu takip etmek için hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımı gösteriyoruz. FCCP, protonları dış mitokondri zarı boyunca kısa devre yaparak ve dolayısıyla oksidatif fosforilasyonu elektron taşıma zincirinden 13 ayırarak ATP sentezini bozar. Mitokondriyal zarın depolarizasyonunu tetiklemek, mitokondrinin bozulmasına ve seçici Parkine bağlı uzaklaştırmaya yol açar. Bu nedenle, ilgilenilen hücrelerin bir floresan işaretleyici (geliştirilmiş sarı floresan proteini, EYFP) ile kaynaşmış Parkin'i kodlayan bir ekspresyon vektörü ile transfekte edilmesi, mitofajik süreç sırasında Parkin'in alımını takip etmek için bir floresan etiketi olarak kullanılabilir. Mitokondriyi görselleştirmek için, sitokrom c oksidaz alt birimi VIII'in (Mito) mitokondriyal hedefleme dizisini içeren kırmızı floresan proteini (DsRed2) kodlayan pDsRed2-Mito'yu birlikte transfekte ettik. pDsRed2-Mito, mitokondri14'ün floresan etiketlemesi için tasarlanmıştır. Parkinin mitokondriyal membrana translokasyonu için gereken süre ölçülebilir ve hücresel sağlığın dolaylı bir ölçüsünü verir. Örneğin, belirli bir ilgilenilen gen için nakavt edilen bir hücre hattı, FCCP tarafından mitofajinin indüksiyonundan sonra Parkin'in daha hızlı veya daha yavaş bir şekilde işe alındığını gösteriyorsa, bu gen ürününün, hücrenin metabolik hızlarını fizyolojik durumda tutmak ve hastalıkların gelişmesini önlemek için kilit bir oyuncu olacağını söyleyebiliriz. Bu nedenle, hızlandırılmış video mikroskobu, etiketli proteinlerin moleküler süreçleri sırasında dinamiğini takip etmede ve bu süreçlerin patolojik bir durum sırasında nasıl etkilendiğini anlamada hem temel hem de klinik araştırma uygulamaları için çok güçlü bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>10-013-CV</td><td>37 & # 176'da ön ısıtma; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>: Fenol içermeyen DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>37 & # 176'da ön ısıtma; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>37 & # 176'da ön ısıtma; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>37 & # 176'da ön ısıtma; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>37 & # 176'da ön ısıtma; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>EYFP-PARKIN ekspresyon vektörü</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-Mito ekspresyon vektörü</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B cihazı</td><td>LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>R kiti için nükleofektör NIH/3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS AXIOVERT 200M ters mikroskop</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbonil Siyanür 4- (triflorometoksi) -Fenilhidrazon (FCCP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td></tr></tbody></table>

hücresel mitophagy için bir marker olarak eyfp-parkin toplama değerlendirme time-lapse video mikroskopi

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Hızlandırılmış video mikroskobu, canlı hücrelerin gerçek zamanlı görüntülenmesi olarak tanımlanabilir. Bu teknik, farklı zaman noktalarında görüntülerin toplanmasına dayanır. Zaman aralıkları, mikroskoba entegre kamerayı kontrol eden bir bilgisayar arayüzü aracılığıyla ayarlanabilir. Bu tür bir mikroskopi, hem çok hızlı olayları elde etme yeteneğini hem de bu olaylar sırasında gözlemlenen hücresel yapı tarafından üretilen sinyali gerektirir. Görüntüler toplandıktan sonra, ilgilenilen moleküler olayların dinamiğini göstermek için tüm deneyin bir filmi bir araya getirilir. Hızlandırılmış video mikroskobu, biyomedikal araştırma alanında geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir ve hücresel olayların dinamiklerini gerçek zamanlı olarak takip etmek için güçlü ve benzersiz bir araçtır. Bu teknik sayesinde göç, bölünme, sinyal iletimi, büyüme ve ölüm gibi hücresel olayları değerlendirebiliriz. Ayrıca, floresan moleküler problar kullanarak DNA, RNA veya proteinler gibi belirli molekülleri işaretleyebiliyor ve bunları moleküler yolları ve işlevleri boyunca takip edebiliyoruz. Hızlandırılmış video mikroskobunun birçok avantajı vardır, bunlardan en önemlisi tek hücre düzeyinde veri toplama yeteneğidir ve bu da onu hücre biyolojisi alanında araştırma için benzersiz bir teknoloji haline getirir. Bununla birlikte, hızlandırılmış video mikroskobu, yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesini engelleyebilecek sınırlamalara sahiptir. Görüntüler her iki dış faktör tarafından da tehlikeye atılabilir; sıcaklık dalgalanmaları, titreşimler, nem ve iç faktörler; pH, hücre motilitesi. Burada, hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımı kullanarak, hasarlı mitokondrinin seçici olarak uzaklaştırılmasını izlemek için gelişmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile kaynaşmış belirli bir protein olan Parkin'in dinamik olarak edinilmesi için bir protokol açıklıyoruz.

Bu yazıda, time-lapse video mikroskopi tek bir hücrede floresan etiketli proteinlerin moleküler olayları takip etmek için kullanılabilecek güçlü bir tekniktir nasıl gösterir. temsilcisi sonuçları da bu tekniğin yüksek kaliteli görüntüler elde edilmesi için izin verir nasıl gösterir. Moleküler sürecinin görüntüleri elde edilir, biz farklı şekillerde bunları analiz için fırsat var. Burada, biz seçici hasarlı mitokondri kaldırarak hücresel homeostazı korumak önemli moleküler süreç kaynaklı ...

Burada, hasarlı mitokondrinin seçici olarak uzaklaştırılması sırasında EYFP-Parkin'in zamansal alımını ölçmek için hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Hasarlı mitokondrinin EYFP-Parkin'e bağlı olarak uzaklaştırılmasının bu dinamik süreci, farklı deneysel koşullar altında hücresel sağlığın bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Bu Zaman Atlamalı Video Mikroskobisi'nin genel amacı, mitofaji süreci sırasında hasarlı mitokondrilerin Parkin aracılı seçici olarak uzaklaştırılmasını takip etmektir. Bu yöntem, mitofajinin kalıcı patolojik durumları nasıl etkilediği gibi moleküler metabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, etiketli proteinlerin moleküler süreçleri sırasındaki dinamiklerini takip etmek için çok güçlü bir araç sunmasıdır.Bu yöntem, mitokondriyal yaşam döngüsü hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca primer hücre kültürleri, embriyoloji çalışmaları ve bir öncelik tahmini gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu çalışmada kullanılan ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblastları, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de, on santimetrelik bir doku kültürü plağında tamamlayıcı DMEM besiyerinde büyütülür.Hücreler yüzde 80 konfluense ulaştığında, besiyerini steril vakumla uzaklaştırın ve on mililitre steril PBS ekleyin. PBS'yi uzaklaştırın ve bir mililitre yüzde 0,25 Trypsin EDTA ekleyin. Plakayı, hücreler kopana kadar 37 °C'de iki ila üç dakika inkübe edin.Dört mililitre komple DMEM medyum ekleyin ve hücreleri yeniden süspa

time-lapse-video-microscopy-for-assessment-eyfp-parkin-aggregation-as

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir...

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi

İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.

H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Bu çalışma, fare beyin dokusunda immün boyama ve görüntü analizine dayalı olarak mitokondri morfolojisini analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bunun Parkinson hastalığı modellerinde protein agregasyonunun neden olduğu mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri nasıl tespit etmesine izin verdiğini de açıklar.

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Öğrenin, EYFP-Parkin toplanmasını zaman atlamalı video mikroskopi ile değerlendirerek mitofaji dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, canlı hücrelerde protein dinamiklerini izlemek için güçlü bir araç sunar.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Daha fazla video keşfet