Name: İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Öğrenin, iskemik fare beyninden bağışıklık hücrelerini izole etme ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon yapma yöntemini. Bu teknik, inme sonrası inflamasyonu ve immünoterapi stratejilerini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mükemmel teknik destek için Isabell Schulz teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri (Sağlık, NIH Yayın No: 85-23 ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları, Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu 1996 revize örn.) Hayvan bakımı için uygun standartlara uygun ve onaylanmış olması gerekir uygun devlet otoritesi tarafından. Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> Sindirim tamponu (hemisfer başına 1 mi), örneğin arıtılmış, sindirim enzimleri, standart bir karışımı eritilir, Liberase bir Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ihtiva eden kalsiyum 2U / ml konsantrasyonunda (Ca) ve magnezyum düşük termolisin konsantrasyonunun (TL) (Mg) </li><li> DNAz ile yıkama tamponu: HBSS 666U / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar DNase I çözündürülür (Ca / Mg serbest) fetal dana serumu, 10% ihtiva eden (FCS) </li><li> DNAz olmadan tampon Yıkama: HBSS (Ca / Mg ücretsiz) FCS% 10 içeren </li><li> Yoğunluk degrade orta (yarımkürede başına 5 ml): stok izotonik yoğunluk gradiyenti hazırlamak0; ortamı (SIP% 100) bir bölümü, 1.5 M sodyum klorid ile yoğunluk gradyan ortamının dokuz kısım karıştırılarak. FCS% 3 ihtiva eden HBSS uygun bir hacmi (Ca / Mg Free) eklenerek% 25 yoğunluğa SIP seyreltin </li><li> sitometrisi (FC) tampon akış: FCS% 3 ihtiva eden (PBS), fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama </li></ol> 2. Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Not: 18 12-haftalık erkek C57BL / 6 fareleri, daha önce tarif edildiği gibi lümen içi bir dikiş tekniği ile geçici orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) yapıldı. <ol><li> Kısaca,% 100 oksijen% 2.0 izofluran ile fareler uyutmak. 36.5 ° C &#39;de vücut ısısını korumak, bir geri-besleme ile kontrol edilen ısıtma aygıtı ile 0.5 ° C ±. </li><li> karotis ve dış karotid arter ligasyonu sonra, orta c kökenli karotis ve önceden bunu bir standart silikon-kauçuk kaplı monofilament tanıtmakerebral arter. </li><li> 45 dakika sonra reperfüzyona izin verecek şekilde filaman çıkarın. sham operasyonu hayvanlarda, hemen iskemi önlemek için orta serebral arter kapatılmasıy sonra filamanın çekme. </li></ol> 3. Transcardial Perfüzyon ve Beyin Diseksiyon <ol><li> (Ca / Mg Free) buzla soğutulmuş HBSS içine hortumun bir ucunu daldırılmasıyla peristaltik perfüzyon pompası hazırlayın. perfüzyon tüpünün diğer ucuna bir künt 23 G iğne düzeltmek ve tamamen HBSS (Ca / Mg ücretsiz) ile boru doldurmak için pompa açın. </li><li> Derinden% 4 izofluran ile fare uyutmak ve CO 2 inhalasyon yoluyla euthanize. </li><li> Bir plastik tepsi gömülü bir diseksiyon gemide fare dorsal yerleştirin. Yayılma ön ve mümkün olduğu kadar geniş ve 20 G iğne ile diseksiyon gemide bunları düzeltmek arka pençeleri. </li><li> düz 1 x 2 diş forseps ile karın cildi kapmak ve kabuklarıyla ve karın duvarından bir yanal kesi yapmak için keskin iris makas kullanın ve maruzkaraciğer. </li><li> sternum kaldırın ve keskin / künt iris makas künt bıçak ile diyafram insizyon. caudocranial doğrultusunun her iki yanında yanal göğüs kafesi kesmek için devam edin. akciğer, kalp ve göğüs arterleri zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> künt forseps ile flep kaldırın ve diseksiyon gemide pin. dikkatle bağ dokusundan kalbi ayırmak için künt uç forseps ve makas kullanın. </li><li> künt uç forseps ile kalbi tutun ve sol ventrikül apeksi içine ekli perfüzyon tüp ile künt 23 G iğne ucu yerleştirin. Not: interventriküler septum yaralanmaları önlemek için sol ventrikül içine çok iğne sokmayın. Gerekirse, bir düz keskin forseps ile yerine kanül düzeltmek. </li><li> Keskin iris makası ile sağ atrium insizyon ve hemen pompa açmak (: - 10 ml / dak 8 debi). </li><li> Karaciğer hafif kahve rengi (~ HBSS 30 ml) gösterene kadar perfüzyon devam edin. Boyuncaperfüzyon dikkatlice tüpün içinde herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek. </li><li> sadece kafatası arkasındaki düz cerrahi makas ile fare başını kesmek. kafatası açığa çıkarmak için kafa derisi orta hat kesi yapmak için iris makas kullanın. </li><li> foramen magnum içine keskin iris makası biri ucu yerleştirin ve kafatası içine yanal kesti. diğer taraf için de tekrarlayın. </li><li> Keskin iris makas kullanmak dikkatle burnuna doğru orta hatta kadar aynı boşluğundan kesmek için. Beynin yaralanmaları önlemek için mümkün olduğunca yüzeysel makas sonunu tutmaya çalışın. </li><li> yavaşça her beyin yarımkürede kafatası kemikleri soymak için ince forseps kullanın. Not: infarkt doku menenjlerin veya kafatası yapışabilir; nedeniyle tedbirsiz diseksiyon beyin dokusunun kaybetmek değil emin olun </li><li> bir spatula ile beyin kaldırın ve dikkatlice kafatasına bunu düzeltmek kranial sinir liflerini incelemek için keskin iris makas kullanın. HBSS (+ Ca / Mg), 10 ml ile dolu bir 15 ml&#39;lik bir tüp içine beyin yerleştirin ve s tutmakhortly buz üzerinde. </li></ol> Tek hücre süspansiyonları içine Serebral Doku 4. Ayrışma <ol><li> Dikkatle temiz bir jilet ile beyin sapı ve beyincik çıkarın. beyin Hemisect ve kabaca eşit büyüklükte üç parçaya koronal düzlem boyunca her yarımkürede kesmek için temiz bir jilet kullanın. </li><li> Kıyma 5 ml şırınga pistonu ucunu kullanarak bir 100 um hücre süzgecinden her hemisfer doku kesilir. Sürekli buz gibi soğuk HBSS (+ Ca / Mg) ile hücre süzgeç durulayın. buz üzerinde homojenize örnekleri saklamak. </li><li> 286 xg 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj dikkatlice süpernatant atılır. sindirim tamponu 1 ml pelet yeniden süspanse edin ve 2 ml&#39;lik bir tüp içine süspansiyon aktarın. 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de yavaş ve sürekli bir rotasyon altında süspansiyon inkübe edin. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden Elek hücre süspansiyonu ve DNAse içermeyen yıkama tamponu, ardından 15 ml DNAz ihtiva eden yıkama tamponu 3 ml ile iyice yıkayın. 286 x g&#39;de santrifüj ve 5 dakika boyunca 18 ° C ve supernatant atın. Not: Not: DNAz kullanımı hücre yaşamını tehlikeye hücre toplama yol açabilecek hücre parçalama neden olduğu DNA mukus ortadan kaldırır. </li></ol> Miyelin ve hücre kalıntılarının uzaklaştırılmasından 5. yoğunluk dereceli santrifüj <ol><li> 5% 25 yoğunluk gradyan ortamının ml ve 15 ml tüp süspansiyonu pipetle tekrar süspansiyon hücre pelletini. kabarcık oluşumunu önlemek tekrarlanan ve Nazik pipetleme ile iyice karıştırın. Not: yoğunluk gradyan orta hücre topaklanma önlemek için oda sıcaklığında kullanılmalıdır. </li><li> 521 x g&#39;de santrifüj ve 20 dakika boyunca 18 ° C. Rotor düşük ivme profilini kullanın ve rotor Frensiz durdurmak için izin verir. Yavaşça sallayarak olmadan santrifüj tüpleri kaldırın. tüpün alt hücre pelet koruyarak dikkatli bir şekilde miyelin ceket ve süpernatant aspire. Not: Herhangi bir artık impai gibi tüm miyelin kat kaldırmak için emin olunr akım sitometri analizi. </li><li> DNAz serbest Yıkama tamponu, 10 ml pelet yeniden süspanse edin ve yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe süspansiyonu pipetle. Not: yoğunluk gradyan ortamının yeterli çıkarılması önemli ölçüde nihai hücre örneği miktar ve kalitesine katkıda çünkü bu yıkama adım çok önemlidir. </li><li> yine 286 xg&#39;de ve 5 dakika boyunca 10 ° C ve süpernatant atın santrifüj. Soğuk Yıkama tamponu, 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve bir hemositometrede tripan mavi dışlama hücre sayısı ve hücre canlılığı belirler. Mağaza 4 ° C&#39;de örnekler ve hızlı bir şekilde bu işlem bundan başka, onları. </li></ol> 6. Antikor Boyama akım sitometri analizi için <ol><li> Spesifik olmayan bağlanma önlemek için, antikor etiketleme önce, anti-murin CD16 / CD32 FC-reseptörü bloke edici bir reaktif ile, 10 dakika (200 2.5 ug / ml nihai konsantrasyon, seyreltme faktörü 1), 4 ° C&#39;de bir hücre süspansiyonu inkübe edilir. </li><li> a at fluorofor-konjuge primer antikor ekleyinHücre süspansiyonuna (Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi) ve karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe ppropriate konsantrasyonu. Not: Kontrol numuneleri primer antikorlar ile boyanmış, ama başka türlü aynı tedavi edilmezler. </li><li> 350 xg FC tamponu ve santrifüj 2 ml hücreleri yıkayın ve 7 min.Carefully 10 ° C FC tampon 200 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire. akış sitometrik analiz edilinceye kadar karanlıkta geçici 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li></ol> Sayma Boncuk tarafından 7. Mutlak miktar tayini <ol><li> Ters FC tamponu 40 ul ve flüoresan boncuklar bilinen bir dizi ihtiva eden bir sayıcı tüp hücre süspansiyonu 10 ul pipetle. Not: pipetler lökosit sayımı sonraki hesaplama bu birime değinmektedir örnek tam 10 ul sunmak için kalibre edilmesi dikkat edin. </li><li> FITC işaretli CD45 antikoru (nihai konsantrasyon hücre süspansiyonu inkübe100), 4 ° C&#39;de karanlıkta, 20 dakika için iyi: 5 ug / ml, sulandırma faktörü 1. </li><li> Ters herhangi bir yıkama aşaması olmadan FC tampon 200 ul sayma tüp girip doğrudan akış sitometresi olarak CD45 + hücreleri kaydeder. </li></ol> 8. Akım Sitometrisi Edinme Not: Önerilen antikor paneli analiz etmek, uygun sitometresinin FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7 kırmızı mavi (488 nm), (635 nm) ve mor (405 nm) lazer ve filtreler ile donatılmış olması olup, APC-Cy7 ve AmCyan. <ol><li> iskemik yarımkürede lekesiz hücreleri kullanarak ileri (FSC) ve yana (SSC) dağılım ayarlayın. FSC alanı ve yüksekliği gösteren bir nokta arsa tek hücrelerden ikilileri ayırt edebilir. </li><li> kullanılan her floresan kanal için tek parametre histogramlar tüm tek hücre görüntüler ve photomultiplier tüp (PMT) tek hücre uzak histogram sol görüntülenir, böylece gerilimleri ayarlayın. </li><li> Bir CD45-FITC tek kullanınHer histogram ve scatter plot CD45 yüksek bağışıklık hücrelerini backgating ile ilgi hücreleri için dağılım ve PMT ayarlarını kontrol etmek için lekeli örnek. Not: CD45 negatif, ara madde (int) ve yüksek ifade eden hücreler, birbirinden ayırt edilmesi, böylece FITC PMT gerilim ayarlayın. </li><li> çok renkli tazminat gerçekleştirmek için antikor yakalanan tazminat boncuk kullanın. Şekil 1&#39;de gösterilen yolluk stratejisine göre lökosit alt popülasyonları tanımlamak sonradan mikroglia (CD45 int) ve lökositler (CD45 yüksek) için kapıları ayarlayın ve. </li></ol>

<ol><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+activates+hematopoietic+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells.</a> Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).</li>
<li>Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+after+permanent+distal+MCA+occlusion+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).</li>
<li>Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-adhesion+molecule+strategies+as+potential+neuroprotective+agents+in+cerebral+ischemia%3A+a+critical+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+research%22%5BJournal%5D)">Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature.</a> Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).</li>
<li>Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+the+chemokine+receptor+CCR2+protects+against+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice.</a> Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).</li>
<li>Gliem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+prevent+hemorrhagic+infarct+transformation+in+murine+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models.</a> Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes%3A+distinct+subsets%2C+how+they+relate+to+dendritic+cells%2C+and+their+possible+roles+in+the+regulation+of+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses.</a> Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).</li>
<li>Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+but+not+neutrophils+are+necessary+to+control+infection+with+Toxoplasma+gondii+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice.</a> Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).</li>
<li>Hammond, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2%2B+Ly6C%28hi%29+inflammatory+monocyte+recruitment+exacerbates+acute+disability+following+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage.</a> The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).</li>
<li>Shichita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+cerebral+interleukin-17-producing+gammadeltaT+cells+in+the+delayed+phase+of+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury.</a> Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).</li>
<li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+are+key+cerebroprotective+immunomodulators+in+acute+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke.</a> Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).</li>
<li>Kleinschnitz, C., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Con%3A+Regulatory+T+cells+are+protective+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke.</a> Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).</li>
<li>Hu, X., Li, P., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro%3A+Regulatory+T+cells+are+protective+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke.</a> Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).</li>
<li>Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+inflammatory+cells+from+rat+brain+tissue+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+translational+stroke+medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke.</a> Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20(2012).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+B+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).</li>
<li>Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbu%2C+DI+%22Methods+in+molecular+biology%22">Methods in molecular biology</a>. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li>
<li>Wagner, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allometric+dose+retranslation+unveiled+substantial+immunological+side+effects+of+granulocyte+colony-stimulating+factor+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke.</a> Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+brain+infiltration+of+leukocyte+subpopulations+differs+among+murine+permanent+and+transient+focal+cerebral+ischemia+models%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+pathology%22%5BJournal%5D)">Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models.</a> Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).</li>
<li>Gelderblom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+dynamics+of+cerebral+immune+cell+accumulation+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke.</a> Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).</li>
<li>Soehnlein, O., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte+partnership+during+the+onset+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation.</a> Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).</li>
<li>Arac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+augmentation+of+alphaB-crystallin+provides+therapeutic+benefit+twelve+hours+post-stroke+onset+via+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).</li>
<li>Mattern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+and+lipid+A+stimulate+proliferation+of+human+T+cells+in+the+presence+of+autologous+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes.</a> Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).</li>
<li>Berney, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-mediated+delayed+islet+graft+function+is+associated+with+increased+intra-islet+cytokine+production+and+islet+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis.</a> Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).</li>
<li>McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+activity+in+pancreatic+islet+isolation+by+enzymatic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion.</a> Diabetes. 38, s126-s128 (1989).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Burada, deney, inme sonrası kemirgen beyin lökositlerin izolasyonu için, basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. yaklaşım güvenilir bir biyolojik tekrarında farklı akış panelleri ölçmek için izin beyin yarımkürede başına yüksek tekrarlanabilir hücre sayıları verir. Görünüşe göre, kan dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri tam olmayan şekilde ayrılması, iskemik beyin giren enflamatuar hücreler asıl miktarına çarpık bir neden olur. Bu protokolü kullanarak Böylece, non-inflamatuar dolaşan lökositler ile sızmış bağışıklık hücrelerinin kirlenmesini önlemek için kapsamlı transcardial perfüzyon özellikle dikkat. deneyim, sol ventrikül ponksiyonu için künt iğne kullanımı sistemik dolaşıma perfüzyon atlamak istiyorum interventriküler septum yaralanma riskini azaltır. burun deliklerinden perfüzyon sıvısına Doğuşu perfüzyon böylece, çok yüksek pressureis bir işareti olduğunuvoid akış oranları&gt; 10 ml / dak. pembemsi renk yoksul perfüzyon bir işareti ise beyin dokusunun beyaz renk soluk iyi perfüzyon gösterir. Bu protokolün diğer kritik adım mekanik parçalanma yanı sıra enzimatik sindirim içermektedir beyin dokusunun etkin ayrışma olduğunu. hücre süzgecinden doku kıyma proteazların etkililiği arttırmak için çok önemlidir. Doku homojenize zaman mononükleer fagositler autolysis 22 derece duyarlı Ancak, aşırı basınç kaçının. enzimatik sindirim Liberase TL Nötr proteaz termolisinle düşük konsantrasyonlarını içeren yüksek düzeyde saflaştırılmış kolajenaz I ve II bir karışımı olduğu önerilir. Liberase TL tedavisi (KM yayınlanmamış veri) tarafından canlı hücreler önemli ölçüde daha yüksek iyileşme ortaya daha önce açıklanan izolasyon protokolleri 14,22,23 ile doğrudan karşılaştırılması. kollajenaz ile karşılaştırıldığında sık kullandığınız hangibeyin bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için d, Liberase TL endotoksin önemsiz düzeyde içerir. Endotoksin düzeyi yüksek bağışıklık hücrelerinin 24 aktivasyon durumunu değiştirme ve ciddi hücre kültürü bozabildikleri için hücreler 25 çıktıları alt analiz için kriteri, bu özel bir önem taşımaktadır. Geleneksel kolajenaz başka bir sakıncası, sonuçların tekrarlanabilirliği tehlikeye ve her bir lot 26 çalışan konsantrasyon belirlenmesi gerekir enzim faaliyetlerinde önemli yeri partiye farklılıklarıdır. bir yetişkin beyinde, yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile miyelin ayrılması, gen veya protein ifadesi üzerindeki akış sitometrisi ya da daha fazla çalışmalar gibi alt uygulamalar için vazgeçilmez bir adımdır. protokolün bir büyük avantajı gradyanları zaman alıcı hazırlık gerektirmeyen tek katmanlı yoğunluğu işlemdir. Ayrıca, ayırma protokolü güvenilir sonuç üretiroldukça deneyimsiz deneyci tarafından gerçekleştirilen bile s. Bu arada arayüz bozmadan biri pipet zor olduğunu birbirine yakın yoğunlukları ile katmanlı geçişlerini yoksundur. yüzey işaretleyici CD45 ekspresyonu göre, protokol iskemik beyin üç ana hücre kategorisi verir. hücrelerin büyük bir çoğunluğu nöronal hücrelerin, astroglial, ependim ve endotelyal hücrelerden oluşan bir CD45 negatif popülasyon aittir. Onların bol varlığı öncelikle verimli miyelin ve enkaz kaldırma amaçlayan tek katmanlı yoğunluk gradyanı atfedilir. Buna ek olarak, yerleşik mikroglia 27 temsil eden bir CD45 int nüfus öncelikle hematojen lökosit infiltre içeren bir CD45 yüksek nüfus ayırt edilebilir. Bununla birlikte, aktif mikroglia kanla miyeloid hücrelerin fenotip ve işlevini benimseyebilir unutulmamalıdır. Bu nedenle, sadece uygulama entellektüel28 parabiyoz olarak d teknikleri gibi, kemik iliği 29 kuruntulardan veya kader haritalama analizi 30 inflamasyon sırasında bu iki popülasyonlar arasındaki kesin bir ayrım sağlar. Akış sitometrisi veri analizi, genellikle belirli bir hücre popülasyonun yüzde oranı dağılımı ile sınırlıdır. olmayan enfarktüslü beyin dokusuna yarımkürede infarkt karşılaştırırken iskemik yaralanma tarafından değiştirildi toplam beyin lökosit sayımı dikkate almaz Ancak, bu bilgiler yanıltıcı olabilir. bağışıklık hücre alt gruplarının inme göreli dağılımı mutlak hücre sayıları ile tamamlanmalıdır sonra Böylece, büyüklük ve enflamatuar infiltratlar fenotipi tam bir resim çizmek için. Bu protokolde tarif edildiği gibi mikro-boncuklar kullanıldığında, kesin bir örnek hacmi pipetleme güvenilir sonuçlar elde etmek için kesinlikle gereklidir. Ayrıca, ters pipetleme güçlü sayıcı tüp köpük oluşumunu önlemek için önerilir. hava kabarcıklarını Kaynaklananmikro-beklenen hacmini azaltmak ve dolayısıyla numunede mutlak CD45 yüksek lökosit sayımı fazla tahmin edilmesine yol açacaktır. Özet olarak, bu protokol beyinden immün hücreleri izole etmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bu iskemik inme inflamatuar yanıt karmaşıklığını incelemek için değerli bir araç olarak hizmet edebilir. Gelecekteki uygulamalar yayılması ve iskemik beyin iltihabı çözümünde monosit alt grupları zamana bağlı bir rol soruşturma bulunmaktadır. Benzer şekilde, inme sonrası adaptif bağışıklık sisteminin rolü tam olarak bilinmemektedir. Uzun vadeli inme sonrası iyileşme ve yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesi için bu nedenle açık umut verici caddeleri üzerindeki etkilerini açıklamak için yardımcı olabilecek in situ alt kümesi özgü transkripsiyon faktörleri veya sitokinler ifade tarafından tespit T hücre alt akım sitometri yöntemiyle.

Serebral kontur hızlı lokal kan akışı kesildikten sonra başlar ve bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm parçaları içeren bir sürekli inflamatuar yanıtı tetikler. Bu enflamatuar yanıtın önemli bir özelliğidir, beyin endotel hücreleri, büyük kemokin salgılanmasının aktivasyonu ile tahrik ve sempatik akışı 1-3 artar beyne bağışıklık hücreleri bir zaman ayarlı akışı olan. Inflamatuar hücre infiltrasyonu önceden iskemik inme zararlı kabul edildi, ancak, gelişigüzel beyne lökosit çıkışını engellemek üzere tasarlanmış çeşitli tedavi denemeleri ölçülebilir bir klinik yarar 4 ikna etmek için başarısız oldu. Daha yakın zamanda, ilk iskemik hasar 5 ilerlemesinde kapsanan monosit türevli hücreler, iltihabı ve daha sonra doku onarımı 6 çözülmesi için çok önemli bir rol oynadığını ortaya çıkmıştır. fenotipik ve functi tanımlanması sayesindemonositler ve makrofajlar arasında Önal heterojenite, geliştirme ve inflamasyon çözümünde mononükleer fagositler rolü üzerine bilgiler önemli ölçüde genişletti. Farelerde, dolaşımdaki monositlerin lenfosit antijeni 6 kompleksi (Ly-6C) 7 yüzey ifadeye göre, en az iki fonksiyonel olarak farklı alt-grup halinde sınıflandırılabilir. LY-6C yüksek&#39;inflammatory monocytes&#39; açık bakteriyel enfeksiyonların 8 kontrolü için gerekli olduğu gösterilmiştir da steril yaralanmalara rolü daha tartışmalıdır. Iskemik inme olarak, CCR2 + Ly-6C yüksek monositlerin seçici ablasyon hemorajik infarkt transformasyon 6 sonuçlandı. Ancak, aynı deneysel yaklaşım intraserebral kanama 9 sonrası akut sakatlık düzeldi. Benzer şekilde, T-hücrelerinin, farklı alt-gruplar, iskemik beyin tahribatı ya 10 zarar verici ya da koruyucu eylem 11 uygulamak için inanılmaktadır, bununla birlikte, veri controversi olduğuEl 12,13 ve garanti ileri araştırmalar. Bu artan karmaşıklığı göz önüne alındığında, iskemik hasar ve tamir çeşitli bağışıklık hücrelerinin rolleri daha derin bilgi inme sonrası enflamasyonu hedefleyen terapiler içine deneysel bulgular çevirmek için son derece önemli olduğunu açık hale gelir. Bugün, hücresel immün yanıtları analiz etmek için en güçlü araçtır polikromatik akış sitometri olduğunu. Bu sapma gereği, in vivo etiketleme veya genetik manipülasyon 14 sistem olmayan iltihap bölgesinde belirlenmesini ve çeşitli immün hücre alt ölçümü sağlar. Hücre içi sitokin 15 veya transkripsiyon karşı antikorlar ile hücre yüzeyi markerlerinin aynı anda boyama 16 ilave olarak tek tek, fenotipik olarak tespit hücrelerin fonksiyonel durumu hakkında bilgi sağlar faktörleri. bir büyük dezavantajı olarak, tek hücre süspansiyonları akış sitometrik deneyleri için gerekli olan ve loc üzerinde böylece bilgiHücresel infiltratlarının layan serbestleştirme kaybolur. Histoloji uzamsal bilgiler elde etmek için ideal bir Ancak, belirli bir dokuda immün hücre alt tipi karakterize etmek için tek seferde kullanılabilen antikorların sayısı ile sınırlıdır. Günümüzde, çeşitli yüzey markerlerinin varlığında ve yokluğunda bir kombinasyonu açıkça inflamasyon 17 esnasında ender immün hücre alt kümelerini, özellikle de tat monosit türevli hücre popülasyonlarının tanımlanması için gereklidir. Burada, basit bir tek katmanlı yoğunluğu gradyanı kullanılarak postiskemik fare beyin lökositlerin yüksek sayıda izole edilmesi için etkin bir protokol açıklar. Elde edilen hücre süspansiyonları ya sitometrisi ya da daha fazla çok-boyutlu bir akış sitometrisi ile analiz edilebilir oldukça spesifik alt analizlerini gerçekleştirmek için akış sitometrik sıralama veya immünomanyetik seçimi ile daha da zenginleştirilebilir. yöntem tek hücre asmalar içine transcardial perfüzyon, beyin hemisfer kaldırılmasını, serebral doku ayrışmasını detaylarıensions, akış sitometrik analiz için miyelin çıkarılması için yoğunluk gradyanlı santrifüj gibi antikor boyama.

<table><tbody><tr><td>Peri-Star Pro Peristaltik Pompa, 4 kanallı</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 inkübatör&</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tüp Döndürücü</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR +</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>4831850</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum/Magnezyum ile HBSS</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Liberaz TL</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Plus</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-5445-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>3302-P101003</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trucount</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Biochrom AG</td><td>L 182-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Horizon V500</td><td>BD Biosciences</td><td>562128</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / CD32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0454</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE</td><td>Biolegend</td><td>100307</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>115519</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560596</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Boru, 1 m</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>503022</td><td></td></tr><tr><td>İnce İris Makas keskin</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>İnce İris Makası keskin/künt</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Düz 1 x 2 diş forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>5ml şırınga pistonu</td><td>Carl Roth GmbH (Braun)</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 100 & m</td><td>Dr. I. Schubert, BD</td><td>2360-00</td><td></td></tr><tr><td>Omnican İnce dozaj şırıngası 1 ml</td><td>Braun</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 70 & m</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>542 070</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tüpleri</td><td>BD Bioscience GmbH</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler, 10 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler, 10 ml</td><td>Sarstedt AG& Co</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler, 25 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler, 5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler, 25 ml</td><td>Sarstedt AG& Co</td><td>861,685,020</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler, 5 ml</td><td>Sarstedt AG& Co</td><td>861,253,025</td><td></td></tr><tr><td>Uçlar, 0.1 - 10 &mikro; l</td><td>Corning B.V.Life Bilimleri</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>İpuçları, 100 - 1.000 & mikro; l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>İpuçları, 10 - 200 & l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>739296</td><td></td></tr><tr><td>Reaksiyon tüpleri 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Reaksiyon tüpleri 2 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>623201</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik petri kabı, 94 x 16 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>VWR International GmbH (BD)</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer hemositometre</td><td>Biochrom AG</td><td>PDHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>tıraş bıçağı</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>CK07.1</td><td></td></tr></tbody></table>

İskemik fare beyin gelen bağışıklık hücreleri İzolasyon ve akım sitometrisi analizi

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik inme intravasküler bölmeye başlar ve beyin ikamet hücrelerin hızlı aktivasyonunu içerir sağlam bir inflamatuar yanıtı başlatır. Bu enflamatuar yanıtın temel mekanizma, kemokin Yayım ve artan endotel yapışma molekülü ifade edilmesiyle kolaylaştınlır iskemik beyin immün hücreleri, dolaşımdaki göç. Beyin işgal lökositler erken evre ikincil iskemik hasar katkıda iyi bilinir, ancak inflamasyon ve daha sonra beyin tamir sonlandırılması için önemleri ancak son zamanlarda fark edilmiştir. Burada, iskemik fare beyin bağışıklık hücrelerinin etkili bir izolasyonu için basit bir protokol verilmektedir. transcardial perfüzyon sonra, beyin hemisfer disseke ve mekanik ayrışmış. Liberase ile enzimatik sindirim miyelin ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yoğunluğu (örneğin Percoll gibi) gradyan santrifüj ile takip edilir. Bu protokol, i bir büyük avantajıgradyanlar zaman alıcı hazırlık gerektirmez ve güvenilir yapılabilir tek katmanlı yoğunluk gradyan prosedürü s. yaklaşım beyin yarımkürede başına yüksek tekrarlanabilir hücre sayıları verir ve bir biyolojik tekrarında birkaç akış sitometri panelleri ölçmek için izin verir. Deneysel İnme sonrası Fenotipik karakterizasyon ve beyin-işgalci lökositlerin ölçümü iskemik hasar ve tamir onların çok yönlü rolleri daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Serebral işemi, sol orta serebral arter (MCAO) geçici oklüzyonu filament ile 12 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri başlatılmıştır. Sham filament sol orta serebral arter tıkanması için eklenir ve anlık reperfüzyona izin verecek şekilde hemen geri çekilmiştir. Önemlisi, hücresel Nöroenflamasyon yaygın olarak uygulanan inme modelleri 19 arasında esasen farklılık gösterir. Bu, insan inme heterojen patofizyolojisi hayvan çalışmalarından elde edilen bulgular tahminde özellikle akılda tutulmalıdır. Fareler iskemik beyin erken immün hücre işgali analiz etmek MCAO sonra 24 saat kurban edildi. iskemik yarımkürede elde edilen hücre sayımları (MCAO IPSI; ± 0.25 x 10E6 0.95) yoğunluk gradyan santrifüj kontralateral yarımkürede uylumluydu sonra (MCAO ters; 1.09 ± 0.30 x 10E6) ve ipsilateralsahte operasyona farelerin yarımküre (plasebo IPSI; 1.12 ± 0.18 x 10E6, tek yönlü ANOVA, p = 0.524). tripan mavisi dışlama ile ölçülen izole hücrelerin canlılığı yüksek olduğunu ve önemli ölçüde 96,85 ±% 0,60, MCAO kontra 97.12 ±% 1.18, MCAO IPSI 95,68 ± 2,04,% tek yönlü-ANOVA, p = 0.253 sahte gruplar (arasında farklılık yoktu ). MCAO akış sitometrik analizi ile belirlenmiştir sonra beyinde bileşimi 24 saat infiltre. 1 Ayırıcı stratejisi şematik (A) ve Örnek inme hayvan (B) göstermektedir Şekil. Beyin infiltre lökositler CD45 int mikroglia ayırt edilebilir CD45 yüksek hücreler olarak tanımlandı. T lenfositleri, CD45, yüksek CD3 + hücreleri olarak tarif ederken, CD45, yüksek nüfus içinde, polimorfonükleer nötrofiller (PMN), LY-6G ifade ile tespit edildi. Kalan CD45 yüksek hücreler daha sonra ayırt edildiCD19 (B lenfositleri) ve CD11b ifade tarafından ed. CD11b + fraksiyon LY-6C yüksek &#39;enflamatuar monocytes` ve monositler, dendritik hücreler (DC) ve makrofajlar kapsayan bir Ly-6C düşük nüfus içinde alt kategorilere edildi. Inmenin akut aşamasında, miyeloid bağışıklık hücreleri beyin 3,20 sızmak hakim. Nötrofiller damar tıkanması sonra hızla beyne giren ve inflamatuar monositlerin 21 ekstravazasyon teşvik. Şekil 2A kontralateral hemisfer ve sahte cerrahiye oranla MCAO sonra iskemik hemisfer 24 saat içinde Ly6-G + nötrofil yüzdesi artışı gösterir. Bunun aksine, iskemik yarımkürede CD3 + T hücrelerinin oranı, sağlıklı beyinde daha (nispeten) daha düşüktür. CD11b + nüfus içinde, beyin iskemi Ly-6C yüksek inflamatuar monositler güçlü bir ağır basması (Şekil doğru dengeyi kaydırır2B). Göreli dağılımları ilave olarak, sayma borular CD45 pozitif olaylar bazında numune (Şekil 3) immün hücre alt mutlak değerinin belirlenmesi için kullanılmıştır. Sayma tüpleri floresan boncuk bilinen bir dizi bültenleri liyofilize pelet içerir. örnek pozitif hücrelerinin mutlak sayısı olayları boncuk hücresel olayları bulunan belirlenebilir. Aşağıdaki denklem kullanılmıştır yarımkürede başına CD45 yüksek lökosit sayısını hesaplamak için: yarımkürede başına CD45 yüksek hücreler = (CD45 yüksek olaylar x Toplam sayım boncuk / numune boncuk olayları) x (toplam süspansiyon hacmi (100 ul) / numune hacmi (10 ul )). 24 saat MCAO sonra, enfarktüs yarımkürede toplam lökosit sayısı önemli ölçüde kontralateral hemisfer ve sahte cerrahiye kıyasla arttı (Şekil 3D, tek yönlü ANOVA, p = 0.0004). di Sayımlar<html> stinct immün hücre alt (PMN, T-hücrelerinin, B-hücrelerinin, LY-6C, yüksek ve LY-6C düşük monositler) kolayca ilgili örneğin toplam CD45 lökosit sayısı ile göreli frekans çarpılarak hesaplanabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig1.jpg" /> Akım Sitometrisi için Şekil 1. Yolluk Stratejisi. (A) yolluk stratejisinin şematik gösterimi. (B), orta serebral arter oklüzyonu sonrasında Örnek fare beyni, 24 saat izole lökositlerin akış sitometrik analizini göstermektedir. FSC ileri dağılım, PMN polimorfonükleer nötrofiller CDC klasik dendritik hücreler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg &quot;/&gt; İmmün hücre alt Şekil 2. farklılaşması. Ly-6G + -neutrophils (A) bağıl dağılımı, diferansiyel aynı taraf (ipsi) LY-6C (B) &#39;nin ifadesi ve karşı taraftaki (tarafından tanımlanan CD3 + T hücreleri (A) ve monosit alt-kümeleri kontra) hemisfer orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) ya da ilgili bir sahte ameliyat sonrası 24 saat. Her nüfusun yüzdesi kapısı belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53658/53658fig3.jpg" /> Boncuk Sayma ile Beyin lökosit Şekil 3. belirlenmesi. (A) yüksek çift pozitif boncuk kapısını gösterir. Tek hücre nüfus içinde (B) CD45 int mikroglia CD45 yüksek lökositler (C) ayırt edilebilir. Ölçümü için, kapı CD45 yüksek olayların sayısı sayılır boncuk olaylara normalize oldu. Bu toplam lökosit Not (CD45 yüksek) sayısı önemli ölçüde orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) sonra (kontra) hemisfer ve sham 24 saat ile karşılaştırıldığında ipsilateral (ipsi) yarımkürede artmıştır. ** P &lt;0.01, *** p &lt;tek yönlü ANOVA ve Tukey`s post hoc çoklu karşılaştırma testi ile 0.001. n = 4 - grup başına 6. FSC ileri dağılım. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table colgroup="" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> florokrom </td><td rowspan="2"> FITC </td><td rowspan="2"> PE </td><td> PerCP </td><td rowspan="2"> PC7 </td><td rowaçıklık = &quot;2&quot;&gt; APC-Cy7 </td><td rowspan="2"> V500 </td></tr><tr><td> (Cy5.5) </td></tr><tr><td> Antijen </td><td> CD45.2 </td><td> CD3 </td><td> Ly-6G </td><td> CD19 </td><td> LY-6C </td><td> CD11b </td></tr><tr><td> Nihai konsantrasyon [ug / ml] </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> seyreltme faktörü </td><td> 1/100 </td><td> 1/200 </td><td> 1 / 1.000 </td><td> 1 / 1.000 </td><td> 1/200 </td><td> 1/200 </td></tr><tr><td> Klon </td><td> 104 </td><td> 145-2C11 </td><td> 1A8 </td><td> 6D5 </td><td> AL-21 </td><td> M1 / 70 </td></tr></tbody></table> İskemik Beyin Bağışıklık Hücre Tanımlama Tablo 1. Temel Antikor Kokteyl.

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Bu prosedürün genel amacı, multiparametrik akış sitometrisi ile miktarlarının belirlenmesi ve fenotipik karakterizasyonlarının yapılması için iskemik fare beyninden bağışıklık hücrelerini izole etmektir. Çok renkli akış sitometrisi ile beyindeki iskemik sonrası inflamasyonun analizi, lezyon ilerlemesi, onarımı ve inmenin genel sonucu ile ilgili immünolojik süreçlerin derinlemesine anlaşılmasını sağlar. Bu prosedürün temel avantajı, iskemik fare beyninden yüksek sayıda canlı bağışıklık hücresinin izole edilmesine olanak tanıyan hızlı, tek basamaklı yoğunluk gradyanı santrifüjasyonudur.Bu tekniğin uygulanması, inmenin daha geniş bir zaman penceresinde uygulanabilecek yeni immünomodülatör tedavi stratejilerinin tanımlanmasını ve doğrulanmasını hedeflemektedir. Bir peristaltik perfüzyon pompa tüpünün bir ucunu buz gibi soğuk, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içine daldırarak başlayın. Tüpün diğer ucuna küt uçlu 23-gauge bir iğne sabitleyin.Ve boruları tamamen HBSS ile doldurmak için pompayı çalıştırın. Ardından, ötanize edilmiş bir fareyi plastik bir tepsiye yerleştirilmiş diseksiyon tahtasına sırt üstü yatırın ve ön ile arka patileri, mümkün olduğunca genişçe gererek 20-gauge iğnelerle sabitleyin. Karın derisini tutmak için düz, bir iki dişli bir pens kullanarak, karaciğeri ortaya çıkarmak amacıyla keskin Iris makasları ile deri ve karın duvarı boyunca lateral bir insizyon yapın.Ardından sternumu kaldırın ve diyaframı kesmek için bir çift keskin-küt uçlu Iris makasının küt ucunu kullanın. Akciğerlere, kalbe ve torasik arterlere zarar vermemeye dikkat ederek, her iki taraftaki lateral göğüs kafesini kaudokranial yönde kesmeye devam edin ve deri flebini yerleştirmek için küt uçlu pens kullanın. Flebi diseksiyon tahtasına iğneleyin ve kalbi bağ dokudan dikkatlice ayırın.Kalbi küt uçlu bir pensle tutun, ardından perfüzyon borusunun ucundaki 23-gauge iğnenin ucunu, intraventriküler septuma zarar vermemeye dikkat ederek sol ventrikülün apeksine yerleştirin. Keskin Iris makası kullanarak sağ atriyumu kesin ve pompa içerisinde kabarcık oluşmamasına dikkat ederek pompayı hemen çalıştırın. Karaciğer açık kahverengi bir renk aldığında, düz cerrahi makas kullanarak fareyi kafatasının hemen arkasından desite edin.Ardından, kafa derisine orta hat boyunca bir insizyon yapmak için Iris makası kullanın. Kafatası görünür olduğunda, sivri uçlu Iris makasının bir ucunu foramen magnum'a yerleştirin ve kemiğe doğru lateral bir insizyon yapın. İnsizyon işlemini diğer tarafta da tekrarlayın.Ardından, keskin Iris makası kullanarak aynı boşluktan orta hat boyunca buruna doğru dikkatlice kesin. İnce pensler yardımıyla kraniyal kemikleri her bir beyin hemisferinden nazikçe soyun. Daha sonra beyni bir spatula ile kaldırın ve beyni kafatasına sabitleyen kraniyal sinir liflerini dikkatlice diseke etmek için keskin Iris makası kullanın.Beyni, üzerinde kalsiyum ve magnezyum bulunan 10 mL HBSS içeren ve buz üzerinde tutulan 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Serebral dokuyu tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için öncelikle temiz bir jilet kullanarak beyin sapını ve cerebellum'u dikkatlice çıkarın. Ardından, beyni hemisekte etmek için başka bir temiz jilet kullanın ve her bir hemisferi koronal düzlem boyunca yaklaşık olarak eşit büyüklükte üç parçaya bölün.Beş mililitrelik bir şırınganın piston ucunu kullanarak, beyin dokusu parçalarını 100 mikronluk bir hücre süzgecinden ezin ve süzgeci sürekli olarak kalsiyum ve magnezyum içeren buz gibi soğuk HBSS ile yıkayın. Ardından homojenize edilen dokuları buz üzerine yerleştirin. Tüm örnekler işlendiğinde, hücre süspansiyonlarını santrifüjle çöktürün ve süpernatanları dikkatlice uzaklaştırın.Peletleri bir mililitre sindirim tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından hücre süspansiyonunu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 37 °C'de yavaş ve sürekli rotasyon altında inkübe edin. Bir saat sonra, hücre süspansiyonunu 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve filtreyi DNase içeren üç mililitre yıkama tamponu ile iyice durulayın.Ardından süzgeci 15 milliliters DNase-free yıkama tamponu ile yıkayın, hücreleri çöktürmek için santrifüj edin ve süpernatantı atın. Hücre kalıntılarını ve myelini uzaklaştırmak için hücreleri oda sıcaklığındaki 5 milliliters %25 yoğunluk gradyanı ortamında yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu 15-milliliter bir tüpe aktarın. Gradyan içindeki hücreleri, tekrarlanan nazik pipetleme işlemleriyle iyice karıştırın.Ardından hücre solüsyonunu santrifüjle çöktürün. Ayrıştırma işleminin sonunda, peleti bozmadan miyelin kılıfı ve süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 10 mililitre DNase-free yıkama tamponunda yeniden süspande edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tekrar santrifüjle çöktürün, peleti 100 mikrolitre soğuk yıkama tamponunda yeniden süspande edin.Ardından trypan blue dışlama yöntemi ile canlı hücre sayısını belirleyin ve hücreleri 4 °C'de saklayın. İmmün boyamaya başlamadan önce, spesifik olmayan bağlanmaları önlemek amacıyla hücreleri anti-murine CD26/CD32 Fc reseptör bloklama reaktifi ile 10 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin. Daha sonra, ilgili florofor konjuge primer antikorları ekleyerek karanlıkta, 4 °C'de 20 dakika boyunca bekletin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki mililitre akış sitometrisi tamponu ile yıkayın. Santrifüjle çöktürün. Pelleti 200 mikrolitre akış sitometrisi tamponu içinde yeniden süspande edin ve örnekleri akış sitometrik analizine kadar dört santigrat derecede saklayın.Boncuk sayımı ile infiltre olan bağışıklık hücrelerinin mutlak sayısını belirlemek için, bilinen sayıda floresan boncuk içeren bir sayım tüpüne tam olarak 40 µL akış sitometrisi tamponu ve 10 µL hücre süspansiyonu ters pipetleme yöntemiyle aktarın. Ardından, hücre ve boncuk süspansiyonunu FITC ile işaretlenmiş CD45 antikoru ile dört °C'de, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından sayım tüpünü 200 µL akış sitometrisi tamponu ile ters doldurma yöntemiyle tamamlayın. Daha sonra örneği vakit kaybetmeden akış sitometresinde analiz ederek boncuk ve CD45-pozitif hücre olaylarını kaydedin.Orta serebral arter oklüzyonundan 24 saat sonra, beyne infiltre olan lökositler yüksek CD45 ekspresyonları ile tanımlanabilir. CD45-yüksek popülasyon içerisinde, polimorfnükleer nötrofiller LY-6G ekspresyonları ile tanımlanırken, T-lenfositler CD45-yüksek, CD3-pozitif bir hücre yüzey fenotipi sergiler. Geriye kalan CD45-yüksek hücreler, CD19 ve CD11b ekspresyonları ile daha ayrıntılı şekilde ayırt edilebilir.CD11b-pozitif fraksiyon, Ly-6C-yüksek inflamatuar monositler ile monosit, makrofaj ve dendritik hücre popülasyonlarını kapsayan Ly-6C-düşük bir popülasyona alt kategorize edilebilir. İnmenin akut evresinde, Ly-6G-pozitif nötrofiller damar tıkanıklığının ardından beyne hızla girer. Buna karşın, iskemik hemisferdeki CD3-pozitif T-hücrelerinin frekansları, sham cerrahisi uygulanan beyinlere ve kontralateral hemisfere kıyasla azalır.CD11b-pozitif popülasyon içerisinde, beyin iskemisi dengeyi Ly-6C-yüksek inflamatuar monositlerin güçlü bir ağırlığına doğru kaydırır. Ayrıca, orta serebral arter oklüzyonundan 24 saat sonra, enfarkte hemisferdeki toplam lökosit sayıları, kontralateral hemisfer ve şam cerrahi beyinlere kıyasla anlamlı derecede artmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, iskemik beyinden mekanik parçalama, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile immün hücrelerin nasıl izole edileceği ve bu hücrelerin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, toplam hücre veriminin beyin dokusunun eksiksiz disosiyasyonuna kritik şekilde bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Ayrıca, beyne infiltre olan lökositlerin, inflamatuar olmayan dolaşımdaki immün hücrelerle kontamine olmasını önlemek için yeterli transkardiyak perfüzyon gereklidir.Bu prosedürün ardından, iskemik inme bağlamında farklı immün apselerin fonksiyonel önemi hakkında ek bilgiler edinmek için gen ekspresyon analizleri veya sitokin profil analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

isolation-flow-cytometric-analysis-immune-cells-from-ischemic-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Video, tümöre sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak bir fare beyninden izolasyonunu göstermektedir. Bunu, daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplamak için yoğunluk gradyan santrifüjlemesi takip eder.

Murin Beyninden Tümör İçeren Bağışıklık Hücrelerinin İzole Edilmesi

Bu video, inme araştırmalarında inflamasyon tepkilerini incelemek için beyin hücrelerinin ve sızmış bağışıklık hücrelerinin iskemik fare beyin dokularından enzimatik sindirim yoluyla izole edilmesi, ardından hücre kalıntılarının ve miyelinin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile uzaklaştırılması prosedürünü göstermektedir.

İskemik Fare Beyin Dokularından Hücre Süspansiyonlarının Elde Edilmesi

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Bu protokol, iskemik inmenin bir murin modeli olan geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben pulmoner ortamda immün hücre kompozisyonu, sitokin profili ve kemokin profilindeki değişiklikleri tanımlamak için flow sitometrinin kullanımını açıklamaktadır.

Pulmoner Ortamda İmmün Hücrelerin ve Proinflamatuar Mediatörlerin Karakterizasyonu

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Burada, mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak iskemik inme sonrası immün hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimlerin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar ve diğer nörodejeneratif hastalıkları incelemek için uyarlanabilir ve inme patolojisindeki immün yanıtları anlamamızı geliştirir.

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Öğrenin, iskemik fare beyninden bağışıklık hücrelerini izole etme ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon yapma yöntemini. Bu teknik, inme sonrası inflamasyonu ve immünoterapi stratejilerini anlamak için kullanılır.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Daha fazla video keşfet