İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Bu prosedürün genel amacı, multiparametrik akış sitometrisi ile niceliklerinin belirlenmesi ve fenotipik karakterizasyonu için iskemik fare beyninden bağışıklık hücrelerini izole etmektir. Beyindeki post-iskemik inflamasyonun çok renkli akış sitometrisi ile analizi, lezyonun ilerlemesi, onarımı ve inmenin genel sonucu ile ilgili immünolojik süreçlerin derinlemesine anlaşılmasını sağlar. Bu prosedürün ana avantajı, iskemik fare beyninden yüksek sayıda canlı bağışıklık hücresinin izolasyonuna izin veren hızlı, tek aşamalı yoğunluk gradyan santrifüjlemesidir.

Bu tekniğin uygulanması, inmenin daha geniş bir zaman penceresinde uygulanabilecek yeni immünomodülatör tedavi stratejilerinin tanımlanmasını ve doğrulanmasını hedefler. Peristaltik perfüzyon pompası tüpünün bir ucunu buz gibi soğuk kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'ye daldırarak başlayın. Tüpün diğer ucuna 23 gauge kör bir iğne sabitleyin.

Ve boruyu HBSS ile tamamen doldurmak için pompayı açın. Daha sonra, ötenazi yapılmış bir fareyi plastik bir tepsiye gömülü bir diseksiyon tahtasına dorsal olarak yerleştirin ve ön ve arka pençeleri 20 gauge iğnelerle mümkün olduğunca geniş bir şekilde gerilmiş olarak sabitleyin. Karın derisini kavramak için bir çift düz, iki diş forseps kullanarak, karaciğeri ortaya çıkarmak için keskin İris makasıyla bütünlük ve karın duvarından yanal bir kesi yapın.

Ardından sternumu kaldırın ve diyaframı kesmek için bir çift keskin künt İris makasının kör bıçağını kullanın. Akciğer, kalp ve torasik arterlere zarar vermemeye dikkat ederek lateral göğüs kafesini her iki taraftan kaudokranial yönde kesmeye devam edin ve cilt flebine uyacak şekilde künt forseps kullanın. Flebi diseksiyon tahtasına sabitleyin ve kalbi bağ dokusundan dikkatlice ayırın.

Kalbi künt uçlu bir forseps ile tutarak, ardından perfüzyon tüpünün ucundaki 23 gauge iğnenin ucunu intraventriküler septuma zarar vermemeye dikkat ederek sol ventrikülün tepesine sokun. Keskin İris makası kullanarak sağ atriyumu kesin ve pompalama içinde kabarcık oluşumunu önlemeye dikkat ederek pompayı hemen çalıştırın. Karaciğer açık kahve rengine döndüğünde, kafatasının hemen arkasındaki farenin başını kesmek için düz cerrahi makas kullanın.

Ardından kafa derisinde orta hat kesisi yapmak için İris makasını kullanın. Kafatası göründüğünde, keskin İris makasının bir ucunu foramen magnumuna yerleştirin ve kemiğe yanal bir kesi yapın. Diğer taraftaki kesiyi tekrarlayın.

Ardından, aynı boşluktan orta hatta yukarıya, buruna doğru dikkatlice kesmek için keskin İris makası kullanın. İnce forseps kullanarak, her beyin yarım küresinden kafatası kemiklerini nazikçe soyun. Daha sonra beyni bir spatula ile kaldırın ve onu kafatasına sabitleyen kraniyal sinir liflerini dikkatlice incelemek için keskin İris makası kullanın.

Beyni, buz üzerinde kalsiyum ve magnezyum içeren 10 mililitre HBSS içeren 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirmek. Serebral dokuyu tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için, önce beyin sapını ve serebulu dikkatlice çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Daha sonra beyni yarıya ayırmak için başka bir temiz tıraş bıçağı kullanın ve koronal düzlem boyunca her yarım küreyi kabaca eşit büyüklükte üç parçaya bölün

Beş mililitrelik bir şırınganın piston ucunu kullanarak, beyin dokusu parçalarını 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve süzgeci kalsiyum ve magnezyum içeren buz gibi soğuk HBSS ile sürekli durulayın. Daha sonra homojenize edilmiş dokuları buzun üzerine yerleştirin. Tüm numuneler işlendiğinde, hücre süspansiyonlarını aşağı doğru döndürün ve süpernatanları dikkatlice atın.

Peletleri bir mililitre sindirim tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 37 santigrat derecede yavaş sürekli rotasyon altında inkübe edin. Bir saat sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve filtreyi DNaz içeren üç mililitre yıkama tamponu ile iyice durulayın.

Daha sonra süzgeci 15 mililitre DNaz içermeyen yıkama tamponu ile yıkayın, hücreleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın. Hücre kalıntılarını ve miyelini çıkarmak için, hücreleri beş mililitre oda sıcaklığında,% 25 yoğunluk gradyan ortamında yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tekrarlanan nazik pipetleme ile hücreleri gradyanda iyice karıştırın.

Sonra hücre çözeltisini aşağı doğru döndürün. Ayırma işleminin sonunda, peleti bozmadan miyelin kaplamayı ve süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 10 mililitre DNaz içermeyen yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve peleti 100 mikrolitre soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek tekrar döndürün.

Daha sonra tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını sayın ve bunları dört santigrat derecede saklayın. İmmün boyamaya başlamadan önce, herhangi bir spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için hücreleri anti-murin CD26 / CD32 Fc reseptör bloke edici reaktif ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, karanlıkta 20 dakika boyunca dört santigrat derecede florofor konjuge primer antikorları ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki mililitre akış sitometrisi tamponunda yıkayın. Döndürün. Peletleri 200 mikrolitre akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri akış sitometrik analizine kadar dört santigrat derecede saklayın.

Boncuk sayma ile sızan bağışıklık hücrelerinin mutlak sayısını ölçmek için, tam olarak 40 mikrolitre akış sitometrisi ve 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bilinen sayıda floresan boncuk içeren bir sayma tüpüne ters pipetleyin. Daha sonra, hücre ve boncuk süspansiyonunu karanlıkta 20 dakika boyunca dört santigrat derecede FITC etiketli CD45 antikoru ile inkübe edin ve ardından sayma tüpünün 200 mikrolitre akış sitometrisi tamponu ile ters doldurulması ile inkübe edin. Daha sonra numuneyi hemen akış sitometresinde çalıştırın, boncuğu ve CD45 pozitif hücre olaylarını kaydedin.

Orta serebral arter tıkanıklığından 24 saat sonra, beyne sızan lökositler CD45 yüksekliğindeki ekspresyonları ile tanımlanabilir. CD45-yüksek popülasyon içinde, polimorfonükleer nötrofiller LY-6G ekspresyonu ile tanımlanırken, T-lenfositler bir CD45 yüksekliğinde, CD3-pozitif hücre yüzeyi fenotipi sergiler. Kalan CD45 yüksek hücreler, CD19 ve CD11b ekspresyonu ile daha da ayırt edilebilir.

CD11b-pozitif fraksiyon, Ly-6C-yüksek inflamatuar monositler ve monosit, makrofaj ve dendritik hücre popülasyonlarını kapsayan bir Ly-6C-düşük popülasyon olarak alt kategorilere ayrılabilir. İnmenin akut aşamasında, Ly-6G pozitif nötrofiller damar tıkanıklığından sonra hızla beyne girer. Buna karşılık, iskemik hemisferdeki CD3 pozitif T hücrelerinin frekansları, sahte cerrahi beyinleri ve kontralateral hemisfere kıyasla azalır.

CD11b pozitif popülasyon içinde, beyin iskemisi dengeyi Ly-6C-yüksek inflamatuar monositlerin güçlü bir baskınlığına doğru kaydırır. Ayrıca, enfarktüslü hemisferdeki toplam lökosit sayıları, orta serebral arter tıkanıklığından 24 saat sonra, kontrendoral hemisfer ve sahte cerrahi beyinlerine kıyasla önemli ölçüde artar. Bu videoyu izledikten sonra, mekanik parçalanma, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjleme ile iskemik beyinden bağışıklık hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve bu hücrelerin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, toplam hücre veriminin kritik olarak beyin dokusunun tamamen ayrışmasına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Ayrıca, beyne sızan lökositlerin enflamatuar olmayan dolaşımdaki bağışıklık hücreleri ile kontaminasyonunu önlemek için yeterli transkardiyal perfüzyon gereklidir.

Bu prosedürü takiben, iskemik inme bağlamında farklı immün apsenin fonksiyonel önemi hakkında ek bilgiler elde etmek için gen ekspresyon testleri veya sitokin profil analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.