Name: Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin, stereotaktik enjeksiyonla rekombinant adeno-ilişkili viral vektör kullanarak Parkinson Hastalığı için fare modeli geliştirme yöntemini. Bu teknik, spesifik beyin bölgelerinde hedeflenen gen ifadesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar mükemmel teknik yardım için Joris Van Asselberghs ve Ann Van Santvoort teşekkür ederim. Araştırma AT-FP6 programı &#39;Dimi&#39; (LSHB-CT-2005-512146), 7.ÇP RTD proje MEFOPA (SAĞLIK tarafından, IWT-Vlaanderen (/ 80020 IWT SBO), FWO Vlaanderen (G.0768.10) tarafından finanse edildi -2.009-241791), 7.ÇP programı &#39;Inmind&#39; (SAĞLIK-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, İmir PF / 10/017), ve MJFox Vakfı (Hedef doğrulama 2010). A. Van der Perren ve C Casteels Bilimsel Araştırma Flaman Fonu doktora sonrası adamlar vardır. K. Van Laere Bilimsel Araştırma Flaman Fonu üst düzey bir klinik üyesidir.

Tüm hayvan deneyleri Leuven Üniversitesi Biyoetik Komitesi (Belçika) tarafından 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi uyarınca yürütülen ve onaylanır. 1. Rekombinant AAV Üretimi ve Saflaştırılması Not: Daha önce tarif edildiği gibi 17 rAAV vektör üretimi ve saflaştırılması Leuven Viral vektör çekirdek (LVVC) ile gerçekleştirilmiştir. <ol><li> Kısaca, transfeksiyonu konflüan düşük (&lt;50) geçiş, 25kD, doğrusal polietilenimin 1 bir oranda 150 nM NaCI transfeksiyon solüsyonu ve üç farklı plazmitler ile yapışık HEK 293T hücreleri: DMEM ortamı,% 2 fetal sığır serumu içinde 1: 1 arasındadır. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edildikten 24 saat sonra, taze DMEM ortamı,% 2 fetal sığır serumu ile orta yerine. Not: plazmidler AAV7 serotipi için konstruktlar arasında, CMVie kontrolünde-sin α insan A53T mutantını kodlayan AAV aktarım plazmid sinaps gelişmişin1 promotör ve pAdvDeltaF6 adenoviral yardımcı plazmid 17. </li><li> Geçici transfeksiyondan sonra orta 5 gün hasat ve teğetsel akış filtrasyonu 17 kullanılarak konsantre. </li><li> Bir iyodiksanol basamaklı bir derece 17 kullanılarak konsantre ortamdan rAAV vektörü tanecikleri arındırın. </li><li> genomik kopya (GC) tayini için real-time PCR standart teknikleri kullanın. Bu protokol, 3.0 E11 GC bir vektör titresi / ml PD 17 için bir α-SYN tabanlı sıçan modeli geliştirmek için kullanıldı. </li></ol> rAAV a-SYN 2. Stereotaktik enjeksiyon Sıçan SN Vektör (Şekil 2) <ol><li> pelet haline yiyecek ve musluk suyu ücretsiz erişim ile normal 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında yaklaşık 200-250 g ağırlığında Ev sekiz haftalık dişi Wistar rat. </li><li> intraperitoneal sıçan sun (ip), bir ketamin (60 mg / kg) ve medetomidini (/ kg, 0.4 mg) ihtiva eden anestezi. sıçan anestezi ve tepki vermiyor kezFarklı pençeleri sıkma yaparken, bir mikro-Transponder IMPLANTER kullanarak daha fazla tanınması için sıçan arkasında bir mikro-Transponder subkutan yönetmek. Mikro-Transponder doğru konumlandırılmış ve okuma cihazı tarafından okunabilir olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Kafa derisinin üstünde saçlarını kesti. derisi ve kulakların hem bir lokal anestezik uygulayın. aseptik teknikler kullanılarak bir laminer akış altında cerrahi geri kalanını gerçekleştirin. </li><li> İki kulak çubukları, bir ağız ve burun çubuğunu kullanarak bir stereotaktik kafa çerçevesi içinde sıçan yerleştirin. vücut ısısında bir düşüş önlemek için bir kağıt battaniye ile sıçan vücudu kaplar. kurutma gözleri önlemek için bir göz yağ sürün. </li><li> izopropanol% 70 jodium% 1 ile saçlı deri dezenfekte ve kafa derisi orta hatta küçük bir kesi yapmak. Yavaşça kafatası membranlar kazınması ve tuzlu su ile durulayın. birkaç dakika kafatası kurumasını bekleyin. Bregma ile lambda: kranial sütürler ve iki referans noktaları dikkate alın. </li&gt; <li> SN içine rAAV vektör enjekte, Bregma doğru koordinatları define (ön-arka: 5,3 mm; mediyolateral: 2.0 mm ve dorsoventral: dura hesaplanan 7.2 mm). Not: her bir ilgi bölgesi için üç boyutlu koordinatlar, anatomik bir referans noktası olarak bregmadan uygulanması, sıçan beyninin bir stereotaksik Atlası kullanarak hesaplanabilir. </li><li> rAAV vektörü ile bir 10 ul mikroenjeksiyon şırınga (30 ölçer 20 mm) doldurun ve motorlu bir mikroenjeksiyon pompasına bağlı stereotaksik alet içine koyun. Vektör bir damla bırakarak ses düzeyini kontrol ve bir çok değerlikli temizlik deterjanı pH 9 (örneğin RBS) olarak ortadan kaldırır. </li><li> Görme baş düz kafa çerçeveye sabit olup olmadığını kontrol edin ve sol-sağ eksen değerlendirir. Dikkatle görsel bregma ile lambda için ön-arka ve mediolateral koordinatlarını tanımlamak ve stereotaktik çerçevenin dorsoventral kolunda bir 30 ölçü 20 mm iğne kullanılarak onların yüksekliğini ölçmek. <ol><li> am izinBregma ile lambda arasındaki yükseklik 0.3 mm farkı edilen maksimum eğim. geri Bregma üzerinde iğne yerleştirin ve ön-arka ve stereotaktik çerçevenin mediyolateral kolunu hareket ettirerek ön-arka ve mediyolateral koordinatlarını geçerlidir. </li></ol></li><li> Enjeksiyon yerinde, kafatasının yüksekliğini ölçmek ve bregma yükseklikten fazla 0,3 mm farklılık olmamasını sağlamak. Yaklaşık 2 mm çaplı kafatasında bir delik delin. Dura yüksekliğini ölçmek, bu dorsoventral koordinat uygulamak için bir referans olarak hizmet verecek. Seçenek olarak kafatası (0.9 mm) sabit bir kalınlığı çıkarılır. </li><li> 26 gauge iğne kullanılarak dura nüfuz ve steril bir doku ile kan emer. Tüm kanama devam etmeden önce durmasını bekleyin. </li><li> Yavaş yavaş (koordinat dorsoventral) 10 ul mikroenjeksiyon şırınga önceden belirlenmiş bir derinlikte beyin içine vektörü çözeltisi ile önceden yüklenmiş yerleştirin. yerinde iğne ile 1 dakika bekleyin. 3 ul enjekte0.25 ul hacmi motorlu mikroenjeksiyon pompa kullanılarak (rAAV2 / 7 α-sin ya eGFP kontrol vektörü 3.0 E11 genom kopya / ml (orta vektör doz) ya da 1.0 E12 GC / ml (yüksek vektör doz)) vektörü çözeltisi / min. </li><li> Enjeksiyondan sonra, yavaş yavaş çıkarmadan önce başka bir 5 dakika boyunca yerde iğne tutmak. kaplanmış örgülü polyester 3.0 kullanarak kafa derisi Dikiş,% 70 izopropanol içinde% 1 jodium ile dezenfekte ve yavaşça stereotaktik enstrüman hayvan kaldırmak. Öncelikle, daha sonra iki kulak çubukları burun ve ağız çubuğu gevşetin. </li><li> Anestezi tersine çevirmek için, 0.5 mg / kg atipamezol ile intraperitoneal sıçan enjekte ve uyanır kadar 38 ° C&#39;lik bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafeste sıçan yerleştirin. vücut ısısında bir düşüş önlemek için bir kağıt battaniye ile sıçan örtün. </li><li> İlk saat için yiyecek ve su kolay erişim sağlar. İlk birkaç gün sıçan izleyin. Gerekirse analjezi uygulanır. Not: t dikiş kaldırmak için gerek yokturO kafatası. 1-2 hafta sonra kafatası tamamen tamir edilir ve stiches gevşemiş. </li></ol> Non-invaziv PET Görüntüleme, Davranışsal Testler ve immünohistokimyasal Analizi 3. rAAV2 Değerlendirilmesi / 7 α-SYN Enjekte Sıçanlar <ol><li> (DAT) dopamin taşıyıcısı ölçmek küçük hayvan pozitron emisyon tomografisi (PET) ve DA Transporter, örneğin bir izleyici kullanarak bağlama, non-invaziv bireysel hayvanlarda zamanla nigrostriatal dopaminerjik nörodejenerasyon kinetiği takip etmek [18 F] -FECT 16 . </li><li> dopaminerjik nörodejenerasyon seviyesi kendiliğinden ön ayakları kullanımını değerlendirmek, sıçanlarda motor bozukluk neden silindir testi fareler tabi yeterli olup olmadığını incelemek için. <ol><li> Bir arka sonrasında duvar ve iniş boyunca dikey hareketleri sırasında cam silindir ve video kaset davranışı geniş açık 20 cm sıçan yerleştirin. 20 toplam her forepaw tarafından yapılan kişilerin sayısını skorrehber. Puanlama kriterlerinin ayrıntılı bilgi için bkz Schallert ve ark., 18 toplam ön ayakları temas yüzdesi (sol artı sağ forepaw) olarak bozulmuş ön ayakları temas (örneğin sol forepaw) sayısını ifade eder. Not: eşit iki pençeleri kullanarak Olmayan lezyonlu kontrol sıçanların bu teste yaklaşık% 50 puan olmalıdır. </li></ol></li><li> transgen ifade ve dopaminerjik hücre kaybı seviyesini değerlendirmek için immünohistokimyasal (İHK) analizi yapın. <ol><li> Farklı son aşamalarında, sodyum pentobarbital (60 mg / kg, ip) bir fazla dozu ile kurban fareleri ve PBS 19 içinde% 4 paraformaldehid, ardından, soğuk tuz ile intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin. gece boyunca 4 ° C &#39;de beyin sabitlemek ve titreşimli mikrotom kullanılarak 50 um kalınlığında koronal beyin kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> α-SYN ifade seviyelerini ve le analiz α-SYN ve tirozin hidroksilaz karşı antikorlar kullanılarak serbest yüzen bölümlerde İHK boyama gerçekleştirinnörodejenerasyon 16 vel. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Magen, I., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+Parkinson%27s+disease+The+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art.</a> Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).</li>
<li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+loss+and+inclusion+body+formation+in+alpha-synuclein+mice%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders.</a> Science. 287, 1265-1269 (2000).</li>
<li>Freichel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cognitive+decline+and+amygdala+pathology+in+alpha-synuclein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice.</a> Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).</li>
<li>Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+parkinsonism%3A+strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations.</a> NeuroRx. 2, 495-503 (2005).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+insolubility+of+alpha-synuclein+in+human+Lewy+body+diseases+is+recapitulated+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model.</a> Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+genes+at+work+in+the+living+brain+with+non-invasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging.</a> Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).</li>
<li>Manfredsson, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+nigral+human+parkin+over-expression+partially+ameliorates+motor+deficits+via+enhanced+dopamine+neurotransmission+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease.</a> Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).</li>
<li>Vercammen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+protects+against+neurotoxicity+in+the+6-hydroxydopamine+rat+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease.</a> Mol Ther. 14, 716-723 (2006).</li>
<li>Winklhofer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parkin+protein+as+a+therapeutic+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+therapeutic+targets%22%5BJournal%5D)">The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson-like+neurodegeneration+induced+by+targeted+overexpression+of+alpha-synuclein+in+the+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system.</a> J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nigrostriatal+alpha-synucleinopathy+induced+by+viral+vector-mediated+overexpression+of+human+alpha-synuclein%3A+a+new+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).</li>
<li>Lauwers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology+and+neurodegeneration+in+rodent+brain+induced+by+lentiviral+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+pathology%22%5BJournal%5D)">Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein.</a> Brain pathology. 13, 364-372 (2003).</li>
<li>Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+cell+loss+induced+by+human+A30P+alpha-synuclein+gene+transfer+to+the+rat+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra.</a> Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).</li>
<li>Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector-Based+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Beh+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease.</a> Curr Top Beh Neurosci. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+follow-up+and+characterization+of+a+robust+rat+model+for+Parkinson%27s+disease+based+on+overexpression+of+alpha-synuclein+with+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors.</a> Neurobiol Aging. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transduction+of+dopaminergic+neurons+in+rat+substantia+nigra+by+rAAV++2%2F1%2C+2%2F2%2C+2%2F5%2C+2%2F6.2%2C+2%2F7%2C+2%2F8+and+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9.</a> Gene Ther. , (2011).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+Methods+of+Animal+Brain+Surgery%3A+Perfusion%2C+Brain+Removal%2C+and+Histological+Techniques.+Brain+Neurotrauma%3A+Molecular%2C+Neuropsychological%2C+and+Rehabilitation+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li>
<li>Dale, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+Lewy+bodies+and+pale+bodies+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).</li>
<li>Dawson, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+flies+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of flies and mice.</a> Science. 288, 631-632 (2000).</li>
<li>Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+PD%3A+pieces+of+the+same+puzzle%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Animal models of PD: pieces of the same puzzle?</a> Neuron. 35, 219-222 (2002).</li>
<li>LeVine, H. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+beta-sheet+amyloid+fibril+structures+with+thioflavin+T%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T.</a> Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).</li>
<li>Oliveras-Salva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV2%2F7+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+mouse+substantia+nigra+induces+protein+aggregation+and+progressive+dose-dependent+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar fiili ya da potansiyel bir çatışma olduğunu beyan ederim.

protokolü içinde birkaç kritik adımlar vardır. vektör titresi yanı sıra vektör saflık doğrudan modelin fenotipik sonuçlarını etkiler. Aşırı vektör titreleri ya da yeterli saflaştırılmış vektör toplu spesifik olmayan toksisite ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, yüksek kaliteli vektör gruplar ve uygun kontrol vektörlerin kullanılması kaçınılmazdır. Bundan başka, stereotaksik çerçeveye sıçan kafasının tam olarak konumlandırılması ve koordinatları doğru belirlenmesi substantia nigra hedefleme gereklidir. enjeksiyon yerinde kaf...

PD patofizyolojisini incelemek ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla, yakından insan PH nöropatoloji, fizyoloji ve motor semptomları benzer hayvan modellerinde için acil bir ihtiyaç vardır. yüksek öngörü değeri, daha iyi biz hastalara hayvan modellerinde yeni tedaviler çevirebilir. 1997 yılında ilk PARK geninde gibi alfa-sinüklein keşfi (α-sin) ilk genetik PD modelini gelişmesine yol açmıştır. İnsan doğal tip (WT) veya mutant (A30P, A53T) aşırı ifade eden transjenik farelerin, bir çok α-EŞZ son on yıl içinde oluşturulmuştur. α-EŞZ aşırı ifadesinin düzeyleri patoloji gelişiminde çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca fare suşu, endojen α-sin ve tam uzunlukta veya kesik bir şekilde ifade edilip varlığı veya yokluğu, (Magen ve Chesselet 1 ile ayrıntılı bir inceleme) rol oynar. WT ve insan çeşitli klinik mutantlar hem aşırı ekspresyonu &amp;# 945; transgenik farelerin -SYN α-SYN patolojik birikimi ve nöronal disfonksiyon 2-6 uyarır. Ancak, şimdi en transgenik α-SYN fare modelleri berrak dopaminerjik hücre kaybı ve dopamin-bağımlı davranış açıkları görüntülemek için başarısız kadar. Bu engel α-SYN fazla sentezleyen viral vektörlerle substantia nigra (SN) doğrudan hedefleme ile üstesinden oldu. Viral vektörler kolayca hücreleri enfekte ev sahibi genoma genetik malzemeyi vermek ve yeni virüs parçacıklarının üretilmesi amacıyla viral genomu çoğaltmak için konakçı hücrenin zorlayabilir virüslerden türetilir. Virüsler hücrelerine girip genlerin katılmasıdır yeteneklerini muhafaza replike olmayan viral vektörler için tasarlanmış olabilir. Viral genomun parçalarını silme ve ilgi genleri tarafından değiştirmek suretiyle, vektör uygulanması genellikle &quot;transdüksiyon&quot; olarak adlandırılan bir konakçı hücre, replikasyon olmaksızın tek bir tur enfeksiyona neden olur. Viral vektörler CıBir aşırı ekspresyonu, gen susturma hem de kullanılabilir. Ifade transgen bir raportör protein (örneğin, yeşil fluoresan protein ya da ateşböceği lusiferaz) 7, bu yazıda üzerinde durulacak bir terapötik gen terapi uygulamaları 8-10 protein ya da olabilir, bir hastalıkla ilişkili proteinin hastalıkta modelleme 11 için kullanılan -14. Viral vektör aracılığıyla gen teslimi birçok avantaj CNS&#39;de transgenleri ifade için alternatif bir yöntem sağlar. lokal transgen uygulama kullanıldığında spesifik beyin bölgelerinde hedeflenebilir. Dahası, transgen ifade gelişimi sırasında telafi mekanizmalarının riskinin azaltılması yetişkinlik döneminde teşvik edilebilir. Ayrıca, modeller farklı türler ve suşları oluşturulabilir. Ve son olarak, farklı transgenler kolaylıkla birleştirilebilir. viral vektörler kullanılarak yüksek transgen sentezleme seviyeleri hastalığın başlama ve şiddeti genellikle overexp düzeyine bağlı olduğundan çok önemli olabilir, elde edilebilirdışarı yansıması. farklı virüsler dayalı çeşitli vektör sistemleri geliştirilmiştir. bir vektör sisteminin seçimi, ilgi konusu genin, gen ekspresyonu, hedef hücre ve biyo-güvenlik sorunları gerekli süre büyüklüğüne bağlıdır. bu kemirgen beyin etkili ve uzun vadeli gen ifadesini yol açacağından beyin, lentiviral (IV) &#39;de sabit gen transferinin ve rekombinant adeno-ilişkili viral, (rAAV), vektörler artık tercih edilen vektör sistemleri kabul edilmektedir. SN dopaminerjik nöronların (DN) özel hedeflemesi için rAAV vektörleri yavaş yavaş nedeniyle yüksek titreleri ve DN transdüksiyon verimliliği LV vektörleri outcompeted var. Şu anda mevcut en iyi α-EŞZ göre kemirgen modelleri yeni AAV serotiplerinin kullanan bir birleşik yaklaşım adlı geliştirilmiştir (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) ve vektör yapıları, titerleri, ve saflık 15,16 optimize edilmiştir. vektör titresi yanı sıra vektör saflık doğrudan etkiliyorModelin fenotipik sonucu. Aşırı vektör titreleri ya da yeterli saflaştırılmış vektör toplu spesifik olmayan toksisite ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, uygun kontrol vektörleri vazgeçilmezdir. Viral vektör üretimi, yükseltme ve saflaştırma işlemlerinde önemli zaman yatırımı da tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli vektör toplu elde etmek için gerekli kanıtlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Dişi 8 haftalık Wistar sıçanları</td><td>Janvier</td><td>/</td><td>200-250 g</td></tr><tr><td>Ketamin (Nimatek)</td><td>Eurovet hayvan sağlığı</td><td>804132</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin (Dormitor)</td><td>Orion-Pharma/ Janssen Hayvan Sağlığı</td><td>1070-499</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Saçlı deri ve kulaklar için lokal anestezik: Xyloca&iuml; ne% 2 jel</td><td>Astrazeneca</td><td>0137-547</td><td></td></tr><tr><td>Terramycine</td><td>Pfizer</td><td>0132-472</td><td></td></tr><tr><td>Bupr&eacute; norfin (Veterjezik)</td><td>Ecuphar</td><td>2623-627</td><td></td></tr><tr><td>Jodium %1 izopropanol</td><td>VWR</td><td>0484-0100</td><td></td></tr><tr><td>stereotaktik kafa çerçevesi</td><td>Stoeling</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Şırınga (30 gauge -20 mm -pst 2)</td><td>Hamilton/ Filtre Servisi</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>atipamezol (Antisedan)</td><td>Orion-Pharma/Elanco</td><td>1300-185</td><td></td></tr><tr><td>rAAV A53T & alpha;-SYN vektör</td><td>LVVC, KU Leuven</td><td>/</td><td>https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/</td></tr> <tr><td>sodyum pentobarbital (Nembutal)</td><td>Ceva Sant&eacute;</td><td>0059-444</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom</td><td>Microm</td><td>HM650</td><td></td></tr><tr><td>tavşan poliklonal sinüklein Ab</td><td>Chemicon</td><td>5038</td><td>1:5.000</td></tr><tr><td>tavşan poliklonal TH Ab</td><td>Chemicon</td><td>152</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Lutesyum oksiortosilikat dedektör tabanlı FOCUS 220 tomografi</td><td>Siemens/ Concorde Microsystems</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>radioligand: 18F-FECT</td><td>Evde</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>L-dopa: Prolopa 125</td><td>Roche</td><td></td><td>6 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>DMEM, Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>N&deg; 31331-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>N&deg; 10270-106</td><td></td></tr><tr><td>25 kD lineer polietilenimin (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı: Iodixanol</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Optimen</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Paxinos 1 watston steretaktik atlas, dördüncü baskı</td><td>Elsevier</td><td>/</td><td></td></tr></tbody></table>

bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla parkinson hastalığı için bir alfa-sinüklein bazlı fare modeli geliştirme

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Parkinson hastalığı (PH) moleküler yollar incelemek ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla, bilimsel araştırmacılar hayvan modellerinde güveniyor. PD-ilişkili genlerin belirlenmesi, genetik PD modelini geliştirilmesine yol açmıştır. En transgenik α-SYN fare modelleri kademeli α-SYN patolojiyi geliştirmek ama net dopaminerjik hücre kaybı ve dopamin-bağımlı davranış açıkları görüntülemek için başarısız. Bu engel PD-ilişkili genleri fazla sentezleyen viral vektörlerin ile substantia nigra doğrudan hedefleme ile üstesinden oldu. viral vektörler kullanılarak yerli gen dağıtım merkezi sinir sisteminde transgenleri ifade için çekici bir yol sağlar. Spesifik beyin bölgelerinde (örneğin, substantia nigra) hedeflenebilir, sentezleme yetişkin ortamda indüklenebilir ve yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilebilir. Bundan başka, çeşitli virüsler ile ilgili olarak farklı vektör sistemleri kullanılabilir. protokol bir viral vektör gerçekleştirmek için bütün önemli adımlar özetlenirSıçan substantia nigra enjeksiyon Parkinson hastalığı için bir viral vektör bazlı alfa-sinüklein hayvan modeli geliştirmek için.

Deney genel şeması, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir A53T α-sin bölgesinin rAAV 2/7 aracılı aşırı dopamin bağımlı motor bozukluklar neden olmaktadır. Α-EŞZ aşırı ekspresyonu seviyesi sıçanlarda motor bozukluk uyarılması için yeterli olup olmadığını incelemek için, kendiliğinden ön ayakları kullanımı (Şekil 3A) değerlendirmek için silindir testi için sıçanlar tabi tutuld...

Bu el yazması, viral vektör aracılı yerel gen iletiminin, merkezi sinir sistemindeki transgenleri ifade etmek için nasıl çekici bir yol sağladığını açıklamaktadır. Protokol, Parkinson hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmek için sıçanın substantia nigra'sında bir viral vektör enjeksiyonu gerçekleştirmek için tüm önemli adımları özetlemektedir.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Bu prosedürün genel amacı, merkezi sinir sistemine Stereotaktik Enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmektir. Bu yöntem, klinik öncesi ilaç testlerine olanak tanıyan normal hayvan modelleri geliştirmek için kullanılabilir ve Parkinson Hastalığının yanı sıra birçok diğer nörodejeneratif bozukluğun moleküler mekanizmalarının incelenmesinde faydalı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyin bölgelerinin spesifik olarak hedeflenmesi için kullanılabilmesidir.Yüksek düzeyde beyin ekspresyonu sağlanabilir ve bu yöntem, spesifik hayvan suşları ve türlerinde hayvan modelleri oluşturmak için kullanılabilir. Farklı nihai vektör sistemleri geliştirilmiştir. Vektör sistemi seçimi, eksprese etmek istediğiniz genin boyutuna, gen ekspresyonunun süresine, hedeflemek istediğiniz dokulara ve biyogüvenlik konularına bağlıdır.Prosedürü, laboratuvarımızdan teknisyen Annelies Aertgeerts uygulamalı olarak gösterecektir. Onaylanmış protokollere uygun olarak, sekiz haftalık dişi bir Wistar sıçanını uygun şekilde anestezi ederek başlayın. Her bir patiyi sıkarak ve geri çekme refleksinin olmadığını gözlemleyerek, cerrahi anestezi düzeyine ulaşıldığını kont

development-an-alpha-synuclein-based-rat-model-for-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Tagliafierro, L., et al. Epigenom Düzenleme Araçlarının İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Hastalık Modellerine Verimli Bir Şekilde Sunulması için Lentiviral Vektör Platformu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Parkinson hastalığında önemli bir protein olan alfa-sinükleinin hedeflenen epigenetik modifikasyonu için nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) lentiviral transdüksiyonunu göstermektedir. Protokol, metiltransferaz aracılı DNA metilasyonunu mümkün kılarak, gen regülasyonunu ve...

Alfa-sinüklein ekspresyonunun epigenetik regülasyonu için nöral progenitör hücrelerin lentiviral transdüksiyonu

Bu video, nörotoksin 6-hidroksidopamini (6-OHDA) beyne enjekte ederek Parkinson hastalığının bir sıçan modelini oluşturma prosedürünü göstermektedir. Medial ön beyin demetine (MFB) nörotoksin infüzyonu, özellikle motor kontrolden sorumlu dopaminerjik nöronları hedef alır, bu da onların yok olmasına ve Parkinson hastalığı semptomlarının tekrarlanmasına yol açar.

Parkinson Hastalığının 6-hidroksidopamin Sıçan Modelinin Oluşturulması

Bu video, Parkinson hastalığını modellemek için sıçan substantia nigra'ya viral bir vektör enjekte etme sürecini göstermektedir. Sıçanın hazırlanması, viral vektörün substantia nigra'ya mikroenjekte edilmesi ve kurtarma prosedürü için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Nörodejeneratif Hastalık Modellemesi için Sıçan Substantia Nigra'ya Viral Vektör Enjeksiyonu

Fareyi bir geniş ölçekli merkezi sinir sistemi gen teslimi için yöntemleri kaplıdır. Bu örnekte, amacı tüm omurilik etkileyen bir hastalık taklit etmektir. Yaygın iletim bir terapötik protein MSS için bir kerelik, Çevre Yönetimi'nden teslim etmek için kullanılabilir.

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Bu makalenin amacı, monomerik Alfa-synuclein, sonraki kalite kontrol ve önceden biçimlendirilmiş liflerinde in vivo kullanımı liflerinde nesil için gerekli adımları özetlemesidir.

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Burada sıçan substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron sayısının yarı nicel belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunuyoruz.

Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi

Bu çalışma, Parkinson hastalığının bu klinik öncesi modelinde nöroinflamasyonu, nörodejenerasyonu ve motor bozukluğu indüklemek için gereken vektör dozunu ve maruz kalma süresini analiz etmektedir. İnsan α-sinükleini kodlayan bu vektörler, Parkinson hastalığı ile ilişkili sinüklein patolojisini özetlemek için substantia nigra'ya verilir.

İnsan α-Sinükleini Kodlayan Adeno İlişkili Viral Vektörler Tarafından İndüklenen Parkinson Hastalığı Fare Modelinin Analizi

Bu makalede, insan karaciğer kanser hücrelerini hedef için en verimli bir vektör olarak adeno-ilişkili virüs serotip 3 (AAV3) tanımlanması için.

Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Bir protokol unilateral 6-OHDA lezyonlar, farelerde medyal önbeyin demet gerçekleştirmek için tarif edilmektedir. Bu yöntem, striatal dopamin ve 90,63&gt;% 95 kaybı gösteren hayatta kalan hayvanların% 89 ile düşük mortalite oranı (% 13.3) ±% -4,02, lezyonun tarafa doğru ipsiversive dönme önyargı vardır.

Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

Öğrenin, stereotaktik enjeksiyonla rekombinant adeno-ilişkili viral vektör kullanarak Parkinson Hastalığı için fare modeli geliştirme yöntemini. Bu teknik, spesifik beyin bölgelerinde hedeflenen gen ifadesi sağlar.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme (Video) | JoVE Journal

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

Daha fazla video keşfet