Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

Bu prosedürün genel amacı, merkezi sinir sisteminde Stereotaktik Enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmektir. Bu yöntem, klinik öncesi ilaç testlerine izin veren normal hayvan modelleri geliştirmek için kullanılabilir ve Parkinson Hastalığının yanı sıra diğer birçok nörodejeneratif bozukluğun moleküler mekanizmasının incelenmesinde faydalı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyin bölgelerinin spesifik hedeflemesi için kullanılabilmesidir.

Yüksek hendek açma beyin ifadesi elde edilebilir ve belirli hayvan türlerinde ve türlerinde hayvan modelleri oluşturmak için kullanılabilir. Farklı nihai vektör sistemleri geliştirilmiştir. Vektör sisteminin seçimi, ifade etmek istediğiniz hendeğin boyutuna, gen ifadesinin süresine, hedeflemek istediğiniz seslere ve biyo-güvenlik konularına bağlıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Annelies Aertgeerts olacak. Sekiz haftalık bir dişi Wistar sıçanını onaylanmış protokollere göre uygun şekilde anestezi yaparak başlayın. Her bir pençeyi sıkarak ve geri çekilme refleksinin yokluğuna dikkat ederek cerrahi bir anestezi düzleminin elde edilip edilmediğini kontrol edin.

Daha sonra, farenin arkasına bir MicroTransponder yerleştirmek için bir MicroTransponder implanter kullanın. MicroTransponder'ın doğru konumlandırıldığını ve bir okuma elde edilebildiğini kontrol edin. Şimdi farenin kafa derisindeki saçları kesin ve kafa derisine ve kulaklara lokal anestezik uygulayın.

Sıçanı laminer bir akış başlığına aktarın ve prosedürün geri kalanını aseptik teknik kullanarak gerçekleştirin. Kulak çubuklarını, ardından ağız ve burun çubuğunu sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Vücut ısısında bir düşüş olmasını önlemek için farenin vücudunu bir kağıt örtü ile örtün.

Gözlerin kurumasını önlemek için oküler bir kayganlaştırıcı uygulayın. Ardından, kafa derisini onaylanmış prosedürlere göre dezenfekte edin. Burada %70 izopropil içinde yüzde bir iyot kullanılır.

Kafa derisinin orta çizgisinde küçük bir kesi yaptıktan sonra, kafatasındaki zarları nazikçe kazıyın ve tuzlu su ile durulayın. Kafatasının kurumasına izin verdikten sonra, bregma ve lambda'nın net bir şekilde görülebildiğinden emin olun. Şimdi, 10 mikro litrelik, 30 gauge 20 milometrelik bir mikroenjeksiyon şırıngasını rekombinant AAV ile doldurun ve stereotaksik alete bağlı motorlu mikro enjeksiyon pompasına yerleştirin.

Substantia nigra'nın Dopaminerjik nöronlarının spesifik işlemi için, rekombinant AV vektörleri, yüksek titreleri ve Dopaminerjik nöronları dönüştürme verimliliği nedeniyle ilk tercihtir. Bir damla AAV bırakarak akışı test edin. Açığa çıkan herhangi bir AAV'yi çok değerlikli bir temizlik deterjanı içinde atın.

Kafanın düz bir şekilde kafa çerçevesine sabitlendiğini görsel olarak kontrol edin. Daha sonra kafatasının düz olup olmadığını kontrol edin, önce iğnenin ucunu bregmaya hareket ettirerek ve bu noktadaki yüksekliği ölçerek, iğnenin ucunu kafatasına değene kadar dorsal-ventral yönde indirerek kontrol edin. İşlemi lambda'da tekrarlayın.

İğneyi bregmaya geri döndürdükten sonra, iğneyi anterior posterior ve medial lateral yönde mikroenjeksiyon için stereotaksik koordinatlara hareket ettirin. Koordinatları not edin. Enjeksiyon bölgesinde, kafatasının yüksekliğini daha önce olduğu gibi ölçün ve bregma yüksekliğinden 0,3 mm'den fazla farklılık göstermediğinden emin olun.

Sonra kafatasına dikkatlice iki milimetrelik bir delik açın. Delik açıldıktan sonra, dorsal-ventral koordinatın uygulanacağı referansı belirlemek için duranın yüksekliğini ölçün. 26 gauge iğne kullanarak duraya nüfuz edin.

Steril doku ile herhangi bir kanı emdirin ve sadece tüm kanama durduktan sonra devam edin. Şimdi önceden yüklenmiş mikroenjeksiyon şırıngasının iğnesini beyne yavaşça dorsal-ventral koordinata indirin. Ve bir dakika duraklayın.

Daha sonra dakikada 0.25 mikro litre oranında üç mikro litre AAV enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, yavaşça çıkarmadan önce iğne yolu boyunca geri akışı önlemek için iğnenin beş dakika daha yerinde kalmasına izin verin. Kodlanmış örgülü polyester 3.0 kullanarak kafa derisini dikin ve cildi yüzde bir iyot ve% 70 izopropil ile dezenfekte edin.

Hayvanı stereotaksik aletten nazikçe çıkarmak için burun ve ağız çubuğunu ve ardından iki kulak çubuğunu gevşetmek için. Bu sırada analjezi ve gerekirse bir anestezi tersine çevirme ajanı uygulayın. Daha sonra fareyi 38 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma plakası üzerine temiz bir kafese koyun ve uyanana kadar yakından izleyin.

Cerrahiden sonra, nörodejenerasyonun kinetiği, davranışsal testler ve PET görüntüleme kullanılarak tüm hayvanda ve kurban edildikten sonra immünohistokimyasal teknikler kullanılarak incelenebilir. Spontan ön ayak kullanımını değerlendirmek için silindir testi, A53T Mutasyonu alfa sinükleini eksprese eden rekombinant AAV'nin substantia nigra'ya mikroenjeksiyonunu takiben çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirildi. Enjeksiyondan üç hafta sonra, medyan dozu alan sıçanlarda önemli motor bozukluk görüldü.

Enjeksiyondan dört hafta sonra, spontan kontralateral ön pençe kullanımında% 50'lik bir azalma gözlenmiştir. Kontrol eGFP enjekte edilen hayvanlarda ise ön pençe kullanımında asimetri görülmedi. Daha yüksek dozda rekombinant AAV 2 / 7A53T alfa sinüklein alan sıçanlar, enjeksiyondan 29 gün sonra ön pençe kullanımında daha belirgin bir bozulma gösterdi.

Gözlenen motor bozukluğun dopamine bağımlı olduğunu kanıtlamak için tek bir doz L-doba uygulandı. L-dopa tedavisinden 45 dakika sonra silindir testi tekrarlandığında, rekombinant AAV 2 / 7A53T alfa sinüklein enjekte edilen hayvanlarda ön pençe kullanımında tam bir iyileşme gözlendi. Nigrostriatal dopaminerjik nörodejenerasyonun kinetiğini zaman içinde non-invaziv olarak takip etmek için, bireysel hayvanlarda, dopamin taşınan bağlanma, radyoligand olarak F-18FECT ile küçük hayvan pozitron emisyon tomografisi kullanılarak ölçüldü.

Rekombinant AAV 2 / 7A53T alfa sinüklein enjekte edilen sıçanların ipsilateral kaudat budimanında DAT bağlanması zamanla önemli ölçüde azalmıştır. 32 gün sonra DAT bağlanmasında %85'e varan bir azalma gözlendi. Pozitif kontrol olarak, SN'deki nörotoksin 6 OHDA'nın enjeksiyonu, yedi gün içinde% 90 DAT bağlanma kaybına neden oldu.

Zamanla rekombinant AAV 2/7A53T alfa sinüklein ile mikroenjekte edilen sıçanlardan alınan beyin kesitleri, dopaminerjik nöronların bir belirteci olan tirozin hidroksilaz için immün boyalıydı. Bu rakam, mikroenjeksiyondan sonraki 29 günlük bir süre boyunca dopaminerjik nöronların ilerleyici kaybını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 45 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, yüksek kaliteli son vektör eşleşmeleri kullanmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nörodejenerasyon ve nöropatoloji seviyesini belirlemek için non-invaziv PET görüntüleme, davranış analizi ve İmmünohistokimyasal analiz gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Parkinson Hastalığı için viral vektör tabanlı hayvan modelleri geliştirmek için substantia nigra'ya viral vektör enjeksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Viral vektörlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve laminer akış altında çalışma ve uygun atık dekontaminasyonu gibi önlemlerin her zaman bu prosedürü takiben alınması gerektiğini unutmayın.