Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

Bu prosedürün genel amacı, merkezi sinir sistemine Stereotaktik Enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmektir. Bu yöntem, klinik öncesi ilaç testlerine olanak tanıyan normal hayvan modelleri geliştirmek için kullanılabilir ve Parkinson Hastalığının yanı sıra birçok diğer nörodejeneratif bozukluğun moleküler mekanizmalarının incelenmesinde faydalı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyin bölgelerinin spesifik olarak hedeflenmesi için kullanılabilmesidir.

Yüksek düzeyde beyin ekspresyonu sağlanabilir ve bu yöntem, spesifik hayvan suşları ve türlerinde hayvan modelleri oluşturmak için kullanılabilir. Farklı nihai vektör sistemleri geliştirilmiştir. Vektör sistemi seçimi, eksprese etmek istediğiniz genin boyutuna, gen ekspresyonunun süresine, hedeflemek istediğiniz dokulara ve biyogüvenlik konularına bağlıdır.

Prosedürü, laboratuvarımızdan teknisyen Annelies Aertgeerts uygulamalı olarak gösterecektir. Onaylanmış protokollere uygun olarak, sekiz haftalık dişi bir Wistar sıçanını uygun şekilde anestezi ederek başlayın. Her bir patiyi sıkarak ve geri çekme refleksinin olmadığını gözlemleyerek, cerrahi anestezi düzeyine ulaşıldığını kontrol edin.

Ardından, sıçanın sırtına bir MicroTransponder yerleştirmek için MicroTransponder implanterı kullanın. MicroTransponder'ın doğru konumlandırıldığını ve okuma yapılabildiğini kontrol edin. Şimdi sıçanın kafa derisindeki tüyleri kesin ve kafa derisi ile kulaklara lokal anestezik uygulayın.

Sıçağı laminer akışlı kabine transfer edin ve prosedürün geri kalanını aseptik teknikle gerçekleştirin. Kulak barlarını, ardından ağız ve burun barını sabitleyerek sıçağı stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Vücut sıcaklığının düşmesini önlemek için sıçağın gövdesini kağıt bir örtüyle kapatın.

Gözlerin kurumasını önlemek için oküler bir lubrikant uygulayın. Ardından, onaylanmış prosedürlere uygun olarak kafa derisini dezenfekte edin. Burada %70 izopropil içinde yüzde bir iyot kullanılır.

Kafatasının orta hattından küçük bir insizyon yaptıktan sonra, kafatası üzerindeki membranları nazikçe kazıyın ve salinle durulayın. Kafatasının kurumasına izin verdikten sonra, bregma ve lambda noktalarının net bir şekilde görülebildiğinden emin olun. Şimdi, 10 µL hacimli, 30 gauge 20 mm'lik bir mikroenjeksiyon şırıngasını rekombinant AAV ile doldurun ve stereotaksik cihaza bağlı motorlu mikroenjeksiyon pompasına yerleştirin.

Substantia nigranın dopaminerjik nöronlarının spesifik transdüksiyonu için, yüksek titreleri ve dopaminerjik nöronları transduse etmedeki yüksek verimlilikleri nedeniyle rekombinant AV vektörleri ilk tercihtir. Bir damla AAV bırakarak akışı test edin. Bırakılan tüm AAV'leri polivalan bir temizleme deterjanı ile imha edin.

Başın baş çerçevesine düz bir şekilde sabitlendiğini görsel olarak kontrol edin. Ardından, önce iğnenin ucunu bregma noktasına getirip iğne ucunu kafatasına değene kadar dorsal-ventral yönde indirerek bu noktadaki yüksekliği ölçün ve böylece kafatasının düz olduğunu kontrol edin. Aynı işlemi lambda noktası için tekrarlayın.

İğneyi bregmaya geri getirdikten sonra, iğneyi anterior-posterior ve medial-lateral yönlerde mikroenjeksiyon için belirlenen stereotaksik koordinatlara taşıyın. Koordinatları not edin. Enjeksiyon bölgesinde, kafatasının yüksekliğini daha önce yapıldığı gibi ölçün ve bu yüksekliğin bregma yüksekliğinden 0.3mm'den fazla farklılık göstermediğinden emin olun.

Ardından kafatasında dikkatlice iki milimetrelik bir delik açın. Delik açıldıktan sonra, dorsal-ventral koordinatın uygulanacağı referans noktasını belirlemek için dura yüksekliğini ölçün. 26 gauge bir iğne kullanarak durayı delin.

Herhangi bir kanı steril doku ile emdirin ve yalnızca tüm kanama durduktan sonra işleme devam edin. Şimdi, önceden doldurulmuş mikroenjeksiyon şırıngasının iğnesini beyne, dorsal-ventral koordinatına kadar yavaşça indirin. Ve bir dakika boyunca bekleyin.

Ardından, dakikada 0.25 µL hızla üç µL AAV enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, iğne yolundan geri akışı önlemek için iğnenin beş dakika daha yerinde kalmasını sağlayın ve ardından yavaşça çıkarın. Saç derisini kodlu örgü polyester 3.0 ile dikin ve cildi %1 iyot ve %70 izopropil ile dezenfekte edin.

Hayvanı stereotaktik cihazdan nazikçe çıkarmak için önce ağız ve burun barını, ardından iki kulak barını gevşetin. Bu aşamada analjezik ve gerekirse anestezi geri döndürme ajanı uygulayın. Daha sonra sıçanı, 38 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerindeki temiz bir kafese yerleştirin ve uyanana kadar yakından izleyin.

Cerrahi işlem sonrası nörodejenerasyon kinetiği, canlı hayvanlarda davranışsal testler ve PET görüntüleme ile, sakrifiye sonrası ise immünohistokimyasal teknikler kullanılarak incelenebilir. Substantia nigra'ya A53T mutasyonlu alfa sinüklein eksprese eden rekombinant AAV mikroenjeksiyonunu takiben, spontan ön kol kullanımını değerlendirmek için silindir testi çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirilmiştir. Enjeksiyondan üç hafta sonra, medyan doz alan sıçanlarda anlamlı motor bozulma görülmüştür.

Enjeksiyondan dört hafta sonra, spontan kontralateral ön pençe kullanımında %50 azalma gözlemlendi. Kontrol eGFP enjekte edilen hayvanlarda ise ön pençe kullanımında herhangi bir asimetri görülmedi. Rekombinant AAV 2/7A53T alfa sinüklein'in daha yüksek dozunu alan sıçanlar, enjeksiyondan 29 gün sonra ön pençe kullanımında daha belirgin bir bozulma gösterdi.

Gözlemlenen motor bozukluğun dopamine bağımlı olduğunu kanıtlamak için tek doz L-dopa uygulandı. Silindir testi L-dopa tedavisinden 45 dakika sonra tekrarlandığında, rekombinant AAV 2/7A53T alfa sinüklein enjekte edilen hayvanlarda ön pençe kullanımının tamamen düzeldiği gözlemlendi. Nigrostriatal dopaminerjik nörodejenerasyonun kinetiğini bireysel hayvanlarda zaman içinde non-invaziv olarak takip etmek amacıyla, radyoligand olarak F-18FECT kullanılarak küçük hayvan pozitron emisyon tomografisi ile dopamin taşıyıcı bağlanması nicelendirildi.

Rekombinant AAV 2/7A53T alfa sinüklein enjekte edilen sıçanların ipsilateral kaudat çekirdeğinde DAT bağlanması zamanla önemli ölçüde azalmıştır. 32 gün sonra, DAT bağlanmasında %85'e varan bir azalma gözlemlenmiştir. Pozitif kontrol olarak, SN'ye nörotoksin 6 OHDA enjeksiyonu, yedi gün içinde DAT bağlanmasında %90 oranında kayıp oluşturmuştur.

Rekombinant AAV 2/7A53T alfa sinüklein mikroenjeksiyonu yapılan sıçanlardan zamanla alınan beyin kesitleri, dopaminerjik nöronların bir belirteci olan tirozin hidroksilaz için immün boyama ile işaretlenmiştir. Bu şekil, mikroenjeksiyondan sonraki 29 günlük süre boyunca dopaminerjik nöronların progresif kaybını göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik 45 dakikada tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, yüksek kaliteli final vektör eşleşmeleri kullanmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, nörodejenerasyon ve nöropatoloji düzeyini belirlemek amacıyla invaziv olmayan PET görüntüleme, davranış analizi ve immünohistokimyasal analiz gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Parkinson hastalığı için viral vektör tabanlı hayvan modelleri geliştirmek amacıyla substantia nigra'ya viral vektör enjeksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Viral vektörlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür boyunca her zaman laminer akış altında çalışma ve uygun atık dekontaminasyonu gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.