Name: Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Keşfedin fare omuriliğindeki serotonerjik liflerin 3 boyutlu dağılımını CLARITY/CUBIC protokolü ile. Bu yöntem geleneksel histolojinin gözlemleyemediği yapıları ortaya çıkararak ağrı algısı mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, bir NHMRC proje hibesi (#1086643) olan Avustralya Araştırma Konseyi Bütünleştirici Beyin Fonksiyonu Mükemmeliyet Merkezi (ARC Center Grant CE140100007) tarafından desteklenmiştir. Prof. George Paxinos, Kıdemli Baş Araştırma Görevlisi NHMRC hibesi (#1043626) tarafından desteklenmektedir.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri tüm işlemler (onaylı ACEC numarası 14 / 94A ise) New South Wales Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakım ve Etik Komitesi (ACEC) yönergeleri izleyin. Şeffaf Fare Omurilik 1. Hazırlık <ol><li> Buz Hidrojel Çözüm hazırlanması <ol><li> % 16 paraformaldehit solüsyonunun hazırlanması (PFA) <ol><li> 70 ml önceden ısıtılmış damıtılmış su (50-55 ° C) içine 16 g paraformaldehit tozu eklenir ve paraformaldehit çözünene kadar ısıtılmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırılmıştır. Not: çözüm üzerinde 55 ° C ısı ve paraformaldehit zehirli olduğunu unutmayın izin vermeyin. </li><li> bir silindir paraformaldehit çözeltisini ve 100 ml damıtılmış su ilave edilir. 4 ° C buzdolabı kullanarak paraformaldehit çözümü soğutun. </li></ol></li><li> su distile 26.25 ml 125 mg VA-044 başlatıcı eritin ve 4 çözümü serinC buzdolabı °. </li><li> Serin 5 mi akrilamid çözeltisi (% 40), 1.25 ml bis çözeltisi (% 2) (DİKKAT: Bis ve akrilamid çözeltiler genetik bozukluklar veya kanser neden olabilir, toksik), 5 mi 10x PBS, 12.5 mi% 16 PFA çözeltisi ve buz üzerinde VA-044 başlatıcı çözeltisi. </li><li> buz üzerinde yukarıdaki çözümler karıştırın. Not: toplam hacim 50 ml. </li></ol></li><li> Fare Omurilik Perfüzyon ve Koleksiyon <ol><li> % 0.9 normal serum fizyolojik içinde seyreltildi ketamin (80 mg / kg) ve xyzaline (5 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezi uygulayın. Fare dozaj fareler için daha düşük olabilir. </li><li> Fare ayak derisine bir tutam yanıt vermiyor bir kez davlumbaz uygun bir plastik yüzeyde, (yapışkan bant etkilidir) vücuttan uzak fare uzuvlarını düzeltmek. </li><li> göğüs üzerine fare deri kesme ve daha sonra kemik göğüs makas ile kalp maruz. </li><li> 25 G iğne th bağlanmış olan, bir peristaltik pompa kullanılarakboru e ucu, kalbin sol ventrikül içine iğneyi yaklaşık olarak 10 ml / dk bir oranda kan için bir çıkış noktası ve daha sonra 40 ml% 0.9 normal serum fizyolojik ile yıkanarak başlatmak için sağ atrium makasla kesme. </li><li> Tamamlandığında, 35 ml buzlu soğuk hidrojel solüsyonu ile fare serpmek. Not: 10 ml&#39;lik bir hızda serpmek / dakika sinir dokusunun şişmesini önlemek için. </li><li> Bir bıçak ile arka üzerindeki deriyi insizyon ve daha sonra omurgalı yanındaki kasları kaldırın. Bir tarafta vertebra kemerler kesme ve diğer tarafa, onları saygısız sonra, ince bir makas ile vertebral kolonun dışına omurilik alır. </li></ol></li><li> Fare Omurilik Takas <ol><li> gece boyunca 4 ° C &#39;de hidrojel çözeltisi 15 ml omurilik yerleştirin. </li><li> Hidrojel çözeltisi 10 ml çıkarın ve 5 ml tüp omurilik segmentleri ile çözeltinin geri kalanı dökün. tamamen dolana kadar hidrojel çözeltisi ile 5 ml tüp doldurun. </li><li> 5 ml tüp üstünden parafilm küçük bir parça gerin ve sonra tüpün boynuna parafilm sarın. Not: parafilm kontaklar hidrojel çözümü sağlayın ve hidrojel çözüm ve parafilm arasında hiçbir kabarcıkları vardır. </li><li> 37 5 ml tüp koymak &#160; ° C fırın gece boyunca karıştırılmıştır. Bir jel olana dek hidrojel çözümü gözlemleyin. </li><li> fırın dışına 5 ml tüpü alın ve (örneğin bir shoveled 1 ml&#39;lik pipet gibi) bir anahtarla tüpten jel çıkarın. jele kaba doku yapışmasını tarafından omurilik dokusu jel çıkarın ve sonra (jel dokusuna sadık olacaktır ve bu nedenle doku tarafından silinecektir) uzakta kaba doku alır. </li><li> omurilik dokusu jelin çıkarılmasından sonra, bir çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca 1 x PBS (pH 7.4) ile Omurilik 4 kez yıkayın. </li><li> 3.85 gr üre ve 3.85 g N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis- (2-hidroksipropil), etilendiamintetraasetat eritilmesi kübik temizleme çözeltisi hazırlayın5.38 ml ine damıtılmış su. Not: Bir sıcak karıştırıcı kullanılır. açık ve oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra solüsyona 2.31 g polietilen glikol mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 ilave edin. Not: Bu, üç kimyasal 10 g bir fare için geçerlidir. </li><li> bir jilet ile 2-3 mm uzunluğunda bölümler halinde koronal fare omurilik kesin ve yukarıda KÜP temizleme çözeltisi, 5 ml içine koydu. 37 ° C&#39;de bir fırında, bir karıştırıcı üzerine yerleştirin &#160; 3 gün boyunca ° C. </li><li> Üç gün sonra, yeni bir birine takas çözümü değiştirin. Not: Yukarıdaki çözelti, kullanımdan önce hazırlanmıştır. </li><li> İki üç gün sonra KÜBİK takas çözümü ferahlatıcı sonra, yazı 8 harflerle bir kağıda karşı doku şeffaflık kontrol edin. şeffaf ise, harfler temizlenir doku yoluyla görülebilir. (% 0.1 Triton-X100) Doku günde 4 kez (her 6 saatte bir) yıkamak için temizleme çözeltisini çıkarın ve PBST 4 ml. </li></ol></li></ol><ol><li> 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde 3 gün: Primer antikor solüsyonu omurilik segmentleri inkübe (PBST içinde 100, anti-serotonin, tavşan içinde yetiştirilmiş, 1 seyreltilmiş). </li><li> Antikor çözeltisi çıkarın ve PBST 4 ml (% 0.1 Triton-X100) 37 ° C bir fırında spinal kord günde 4 kez (her 6 saat) yıkayın. </li><li> 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde, 3 gün boyunca doku inkübe etmek: PBST solüsyonu çıkarın ve ikincil antikor solüsyonu (PBST içinde 100 594 konjuge keçi anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş). </li><li> ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde günde spinal kord 4 kez yıkama (her 6 saatte bir) PBST 4 ml. Ertesi gün doku görüntüleme için hazırdır. </li></ol> 3. Görüntüleme <ol><li> PBST solüsyonu çıkartın ve doku kırılma indeksi yapmak için% 85 gliserol 4 ml. </li><li&gt; doku netlik kontrol edin. yaklaşık 1 saat açık olduğunda, çoklu fotoğraf floresan mikroskop tutma çerçevesini uyan bir büyük, ince cam slayt üzerine doku koydu. </li><li> Omurilik dokusu yanında% 85 gliserol birkaç damla koyun ve bir 22 x 50 mm, 2 lamel camının ile lamel. Not: omurilik oryantasyon görüntü benziyor nasıl karar verir. </li><li> çoklu foton floresan mikroskop tutma çerçevesi üzerine cam slayt koyun ve hafif yolun içine doku taşıyın. </li><li> Helyum Neon lazer hattı 594 nm seçin ve canlı görüntüde olumlu bir sinyal parlaklığını kontrol ederek optimum seviyeye lazer yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> (Suda, NA 0.7) 20X objektif kullanılarak omurilik dokusu tarama alanı seçin ve z-yığını oluşturmak için hazırlamak, ve 3 mikron ayarlanmış her adımda derinliği. </li><li> 20X objec altında z yığının alt üst doku tarayıntif ve (yağda, NA 1.4) sonra 63X objektif sırasıyla (adım büyüklüğü 1 mikron idi). 3D yazılımını 28 kullanarak 3D videoları yeniden yapılandırma. </li></ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
<li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation%2C+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li>
<li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat%27s+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li>
<li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li>
<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
<li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord%3A+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li>
<li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li>
<li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li>
<li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum%3A+evidence+for+connectional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li>
<li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li>
<li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats%3A+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

protokol kombine CLARITY ve KÜP teknikleri ile fare omurilik görüntü serotonerjik lifleri nasıl gösterir nitelendirdi. Bu Cheung vd. 14 ve TÖMER&#39;ler ve ark., 15 tarafından geliştirilen pasif temizleme protokolüne göre daha hızlı bir temizleme işlemi sunar ve omurilik dokusu de temizleme esnasında hidrojel tarafından desteklenmesi sağlar. Cheung ve ark., 14 ve Tomer ark. 15 tarafından bildirilen fare omurilik ...

Supraspinal projeksiyonlar, ağrı algısı gibi çeşitli davranışların modülasyonundan sorumludur. Nosiseptif bilgi taşıyan projeksiyonlardan biri, arka beyin rafesinden ve bitişik retiküler çekirdeklerden1,2 kaynaklanan serotoninerjik lifler içerir. Fizyolojik ve farmakolojik çalışmalar, arka beyindeki raphe çekirdeklerinin elektriksel stimülasyonundan sonra omuriliğin dorsal boynuzunda serotonin salınımının arttığını göstermiştir3-5. Sıçan ve keseli sıçanda, serotonerjik raphespinal lifler sadece dorsal boynuz6-8'de değil, aynı zamanda ara bölge7,9,10, ventral boynuz7,11 ve hatta lamina 1012,13'te de yoğun terminallere sahiptir. Farede benzer bir çalışma yoktur. Bu çalışma, fare omuriliğindeki arka beyin raphe çekirdeklerinden ve bunların bitişik retiküler çekirdeklerinden kaynaklanan serotonerjik liflerin sonlandırma paternini, yakın zamanda yayınlanan CLARITY14 yöntemi ve modifikasyonu olan CUBIC15 kullanarak haritalamayı amaçladı. 
Omuriliğin konvansiyonel floresan veya peroksidaz immünohistokimyası, omuriliğin gri cevherindeki serotonerjik liflerin 30-40 μm kalınlığındaki kesitlerdeki dağılımını açıkça göstermektedir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, beyaz maddedeki serotonerjik lif yollarının ve gri maddedeki teminatlarının sürekliliğini göstermez. Histolojik kesitlerin 3 boyutlu rekonstrüksiyonu, lif yolları hakkındaki bilgimizi ilerletmiş olsa da, histologlar ve anatomistler için dokuda kesmenin neden olduğu küçük bozulmalar nedeniyle tek bir yolu takip etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu engeli aşmak için, bir dizi araştırmacı tüm doku yapısını şeffaf hale getirmek ve değiştirilmemiş dokunun görüntüsünü tek bir video dosyasında toplamak için çeşitli protokoller geliştirmiştir17-21. Şimdiye kadar, Deisseroth'un grubu14,15 tarafından geliştirilen berrak, lipid değişimli, akrilamid hibritleştirilmiş sert, görüntüleme/immün boyama uyumlu, doku hidrojeli (CLARITY) tekniği ve Susaki ve ark.16 tarafından geliştirilen CUBIC en başarılı olanlardır. Protokollerin yayınlanmasından bu yana, birçok araştırmacı bu teknikleri sadece beyin22-25 değil, aynı zamanda kalp, böbrekler, bağırsak ve akciğerler26,27 dahil olmak üzere biyolojik dokuların çeşitli yönlerini araştırmak için kullanmaya başlamıştır. 
Fare omuriliğini hidrojel solüsyonu (CLARITY) ile sabitleyerek ve CUBIC reaktifleri ile temizleyerek (bu, orijinal CLARITY protokolü14,15 tarafından tarif edilenden çok daha hızlı bir yöntemdir), 2-3 mm uzunluğunda bir omurilik dokusu bloğu iki hafta içinde temizlendi ve serotonin için immünofloresan boyama sekiz gün içinde tamamlandı. Sadece kimyasal ajanların bir kombinasyonu ile konvansiyonel immünohistokimya, yaklaşık bir ay içinde bir 3D video dosyasında tek tek lif yollarının bir görüntüsünü oluşturmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Foto başlatıcı VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>%40 akrilamid çözeltisi</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>%2 Bis çözeltisi</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>üre</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N, N, N', N'-tetra-2-propanol, MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sakaroz</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>serotonin antikoru</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>keçi anti tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor & reg; 594 konjuge</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>çoklu foton mikroskobu</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

kullanımı netlik fare omurilik içinde serotonerjik elyaf görüntüleme / kÜbİk tekniği

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

omuriliğe uzun inen lifler lokomosyon, ağrının algılanması ve diğer davranışları için çok önemlidir. Bu lif sistemlerinin çoğunluğunun omurilik fiber sonlandırma desen iyice herhangi türde araştırılmamıştır. omurilik proje serotonerjik lifler, histolojik bölümlerde sıçanlar ve opossum incelenmiştir ve fonksiyonel önemi omurilikte kendi fiber sonlandırma desen çıkarılabilir dayanmaktadır. CLARITY ve KÜBİK tekniklerinin gelişmesiyle birlikte, lif sistemi ve serotonerjik supraspinal yolların önceden bilinmeyen özelliklerini ortaya çıkarmak için büyük olasılıkla omurilik dağıtımını, araştırmak mümkündür. Burada, kombine açıklık ve KÜP teknikleri kullanarak fare omurilik serotonerjik lifler görüntüleme için ayrıntılı bir protokol sağlar. yöntem combin ile doku hidrojel solüsyonu ve aydınlatılması ile bir fare perfüzyon gerektirirreaktifler temizleme tirme. Omurilik dokusu hemen altında iki hafta içinde temizlendi ve serotonin karşı sonraki immunofluorescent boyama az on gün içinde tamamlanmıştır. Bir çoklu foton floresan mikroskop ile, doku taranmış ve bir 3D görüntü OsiriX yazılımı kullanılarak yeniden inşa edildi.

Bu bölüm, açıklık ve KÜP protokollerin bir kombinasyonu kullanılarak şeffaf bir fare omurilik serotonin antikor boyama sonuçlarını gösterir. Biz (aynı zamanda Video 1 bakınız Şekil 1) serotonerjik lifler ventral boynuz ventral kısmında üstünlüğü ile omuriliğin tüm lamina mevcut olduğunu göstermektedir. kontrol doku pozitif lifler (sonuç gösterilen değil) yoktu. Ventral boynuz olarak, yoğun dolu serotonerjik lifler ventral boynuz ventromedial kısmında bul...

Supraspinal projeksiyonlar ağrı algısı ve diğer davranışlar için önemlidir ve serotonerjik lifler bu lif sistemlerinden biridir. Bu çalışma, bu serotonerjik liflerin sonlandırılmasını araştırmak için kombine CLARITY/CUBIC protokolünün fare omuriliğine uygulanmasına odaklanmıştır.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Bu CLARITY/CUBIC deneyinin genel amacı, geleneksel histoloji ile gözlemlenemeyen fare omuriliğindeki serotonerjik liflerin 3B özelliklerini ortaya çıkarmaktır. Bu yöntem, serotonerjik liflerin omurilik boyunca nasıl dağıldığı gibi nöroanatomi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, serotonerjik liflerin in situ gözlemlenmesine ve geleneksel histoloji ile görülemeyen vektörlerin tanımlanmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem merkezi sinir sisteminin organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, kardiyovasküler sistem gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemi ilk kez, fare omuriliğindeki serotonerjik lifleri analiz etmek için geleneksel bir izleme yöntemi kullandığımızda sınırlamalara ulaştığımızda kullanmaya karar verdik. İşleme, anestezi uygulanmış bir farenin uzuvlarını bir çeker ocak içindeki plastik diseksiyon tablasına sabitleyerek başlayın.Ayak parmağı sıkıştırma işlemine yanıt verilmediğini doğrulayın ve göğüs üzerindeki deriyi açmak için bir makas kullanın. Ardından, kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini açın ve peristaltik pompa hortumuna bağlı 25 gauge bir iğneyi sol ventriküle yerleştirin. Kan için bir çıkış noktası oluşturmak amacıyla sağ atriyumu kesin.Ardından kalbi, dakikada yaklaşık 10 mL hızla 40 mL %9'luk salin ile yıkayın. Tüm kan temizlendiğinde, hayvanı aynı perfüzyon hızıyla 35 mL taze hazırlanmış, buz gibi soğuk hidrojel ile perfüze edin. Daha sonra farenin sırtındaki deriyi kesin ve vertebraların yanındaki kasları disseke edin.Bir taraftaki vertebral arklar kesilip diğer tarafa yatırıldıktan sonra, omurilik ince makasla vertebral kolondan çıkarılır. Hasat işleminin hemen ardından, omurilik taze hazırlanmış 15 mililitre hidrojel solüsyonu içine yerleştirilir ve dört santigrat derecede gece boyunca bekletilir. Ertesi gün, hidrojelin 10 mililitresi alınır ve solüsyonun geri kalanı ile omurilik beş mililitrelik bir tüpe aktarılır.Tüp dolana kadar taze hidrojel çözeltisi ekleyin ve ardından tüpün üst kısmını küçük bir parafilm parçasıyla gererek kapatın; bu sırada parafilmin hidrojelle temas ettiğinden ve çözelti ile film arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Tüpteki havayı tahliye etmek en zor aşamadır. Kabarcık oluşmadığından emin olmak için tüpü hidrojel çözeltisiyle yavaşça doldurmaya özen gösterin ve ardından jeli dökmeden parafilmi dikkatlice tüpün üst kısmına yerleştirin.Şimdi, tüpün boynuna ikinci bir parafilm parçası sarın ve spinal kordu 37 °C'lik bir fırında gece boyunca inkübe edin. Hidrojel çözeltisi jel kıvamına geldiğinde, jeli ve sinir dokusunu tüpten çıkarmak için bir spanner kullanın. Hidrojeli spinal kordun üzerinden temizlemek için, kaba bir dokuyu kısa süreliğine jelin üzerine bastırın.Jel, doku çıkarılırken ona yapışacaktır. Omurilik temizlendiğinde, sarsıntılı bir karıştırıcı üzerinde dört veya altı saatlik yıkamalar için PBS içine yerleştirin. 24 saat sonra, bir jilet kullanarak omuriliği koronal düzlemde iki ila üç milimetrelik segmentler halinde kesin ve doku parçalarını beş mililitre taze hazırlanmış CUBIC berraklaştırma solüsyonuna aktarın.Parçaları 37 °C'deki fırında 72 saat boyunca çalkalayın ve ardından üç günlük berraklaştırma solüsyonunu taze hazırlanmış berraklaştırma solüsyonu ile değiştirin. İki ila üç gün sonra, dokunun şeffaflığını 8 punto yazı boyutundaki kağıda karşı kontrol edin. Harfler berraklaşmış doku üzerinden gözlemlenebildiğinde, CUBIC berraklaştırma solüsyonunu, dört adet altışar saatlik yıkama için 4 mL taze PBST ile değiştirin.Omurilik segmentlerini floresan görüntüleme için boyamak amacıyla, dokuyu uygun primer antikor solüsyonunda, 37 °C'deki fırında bir çalkalayıcı üzerinde üç gün boyunca inkübe edin. Primer antikor boyaması tamamlandığında, dokuyu 37 °C'deki fırında altı saatlik dört ayrı yıkama için 4 mL PBST içerisine daldırın. Ardından, PBST'yi uygun sekonder antikor solüsyonu ile değiştirerek dokuyu 37 °C'deki fırında çalkalayıcı üzerinde üç gün daha inkübe edin.Dördüncü günde, az önce gösterildiği gibi, bağlanmamış ikincil antikorları PBST ile yıkayarak uzaklaştırın. Segmentleri görüntülemek için, dokunun kırılma indisini eşitlemek amacıyla son PBST yıkamasını dört mililitre %85 gliserol ile değiştirin. Yaklaşık bir saat sonra, dokunun şeffaflığını kontrol edin.Doku şeffaflaştığında, omurilik segmentlerini geniş ve ince bir lam üzerine aktarın. Ardından, omurilik dokusunun yanına birkaç damla %85 gliserol damlatın ve dokuyu 22 by 50 milimetrelik bir lamel ile kapatın. Lamı mikroskobun tutucu çerçevesine yerleştirin ve dokuyu ışık yoluna getirin.Ardından, Helium Neon lazerini seçin ve lazer yoğunluğunu ayarlamak için canlı görüntüdeki pozitif sinyalin parlaklığını kontrol edin. Lazer optimal yoğunluktayken, omurilik dokusunun tarama alanını seçmek için 20x objektif kullanın. Daha sonra, her katmanın derinliği üç mikron olacak şekilde cihazı z-yığını (z-stack) oluşturacak şekilde ayarlayın.Son olarak, dokuyu z-yığınının üstünden altına doğru önce 20x objektif altında, ardından 63x objektif altında bir z-yığını taraması ile tarayın. Uygun 3D videoları oluşturmak için daha sonra 3D yazılım kullanılabilir. Burada, omuriliğin tüm laminalarında, özellikle ventral horn'un ventral kısmında yoğunlaşacak şekilde serotonerjik liflerin varlığı gözlemlenebilir.Ventral boynuzda, ventral medial bölgede yoğun şekilde paketlenmiş serotonerjik lifler bulunur ve bunlar ventral boynuzun lateral kısmına doğru uzanır; ayrıca immünopozitif liflerin bir kısmı ventral boynuzdan dorsal boynuza veya merkezi kanala doğru uzanmaktadır. Dorsal boynuzun tüm laminalarında immünopozitif lifler mevcuttur, ancak özellikle dorsal boynuzun lateral kısmındaki ikinci ve dördüncü laminadaki pozitif lifler arasında küçük bir boşluk vardır. Yatay bir kesitte, spinal kordun boylamsal ekseni boyunca ventral boynuzda yoğun paketlenmiş serotonerjik liflerin, lif demetine dik eksen boyunca düzenli aralıklarla dallar verdiğini gözlemlemek mümkündür.Bu dallar, ventral boynuzun lateral kısmına doğru yolları boyunca daha da ayrışırlar. Bu dallarla karşılaştırıldığında, orta hatta doğru uzananlar daha düzensiz ve daha küçüktür. 63x objektif altında, dorsal boynuzdaki serotonerjik liflerin omurilik ekseni boyunca ilerlediği ve traktus yolu üzerindeki çeşitli noktalarda, ince lifler arasında seyrek olarak dağılmış kalın liflerle sonlandığı gözlemlenir.Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütülürse üç haftadan kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, serotonerjik liflerin motor nöronlarda sonlanıp sonlanmadığına dair ek soruları yanıtlamak için kolin asetiltransferaz antikoru ile çift etiketleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyomedikal görüntüleme alanındaki araştırmacıların hayvan örneklerindeki veya insan dokularındaki çeşitli hücre tipleri arasındaki karmaşık uzamsal ilişkileri keşfetmelerinin yolunu açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, immünofloresan boyama sonrası fare omurilik dokusunun 3D görüntüleme için nasıl berraklaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir...

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Kaynak: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY Doku Temizleme ile Sağlam Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu videoda, konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak dendritik direkleri, omurga morfolojisini ve nöronal dağılımı incelemek için temizlenmiş bir fare beyninin hazırlanmasını, görüntülenmesini ve analizini gösteriyoruz.

Temizlenmiş Bir Fare Beyninde Sağlam Dendritik Arbors ve Omurga Morfolojisinin Konfokal Mikroskopi Görüntülemesi

Büyük dokular içindeki floresan etiketli hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için, ideal olarak, biyolojik numuneler kesitlere ayrılmadan görüntülenmelidir. 3DISCO, organik çözücülerle sıralı inkübasyona dayanan basit bir doku temizleme prosedürüdür. Temizlendikten sonra, organlar şeffaf hale gelir ve numunenin uçtan uca lazer taramasına izin verir.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü İn Vivo Fare Omurilik Görüntüleme

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Optik temizleme teknikleri, dokuların görselleştirilme biçiminde devrim yaratıyor. Bu raporda, daha tutarlı ve daha ucuz sonuçlar veren orijinal Clear Lipid değişimli Akrilamid hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) protokolünün modifikasyonlarını açıklıyoruz.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Minimal invaziv teknikler ve basit bir laboratuvar cihazı, deney hayvanlarına operatif hasarı azaltarak ve anatomik morfoloji bakımına izin vererek omurilik yaralanması modelinin tekrarlanabilirliğini arttırır. Yöntem değerlidir, çünkü güvenilir sonuçlar ve tekrarlanabilir prosedür, hastalık onarım mekanizmalarının araştırılmasını kolaylaştırır.

Minimal İnvaziv Bir Tekniğe Dayalı Bir Fare Kontüzyonu Omurilik Yaralanması Modelinin Oluşturulması

Keşfedin fare omuriliğindeki serotonerjik liflerin 3 boyutlu dağılımını CLARITY/CUBIC protokolü ile. Bu yöntem geleneksel histolojinin gözlemleyemediği yapıları ortaya çıkararak ağrı algısı mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Daha fazla video keşfet