İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, erken beyin tümörü mikroçevresine sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin sayısını karakterize etmek ve ölçmektir. Bu yöntem, periferik bağışıklık hücrelerinin beyin tümörü mikroçevresine kaçakçılığı için önemli faktörleri belirleyerek beyin tümörü immünolojisi alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu CNS'ye giren lökositlerin sayısı ve aktivasyon durumu hakkında zamana bağlı nicel veriler vermesidir.

Anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirdikten sonra, bir neşter bıçağı kullanarak kafatası üzerinde frontal kemikten oksipital kemiğe kadar iki santimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Daha sonra Collibra ekartörlerini kullanarak insizyondaki cildi geri çekin. Bundan sonra, 33 gauge iğne ile donatılmış bir mikrolitrelik şırıngayı doğrudan bma'nın üzerine indirin.

Tümör implantasyonu için hedef bölgeye ulaşmak için iğnenin konumunu ayarlayın. Daha sonra, bu konumu işaretlemek için 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik tüberkülin şırıngası kullanın, bundan sonra periosteuumu nazikçe ekleyerek. Delme sırasında alttaki dura mater'e ulaşana kadar 0.8 milimetre matkap ucuyla hedef bölgedeki kafatasına bir delik açın.

Aşırı ısı ve kuvveti önlemek için aralıklı basınç uygulayın ve ardından matkap ucunu kafatası yüzeyinden hızlı bir şekilde çıkarın. Ardından, iğnenin tıkanmadığından emin olmak için mikrolitre şırıngayı 1,7 mililitrelik konik polipropilen mikro tüpte% 0,9 sodyum klorür ile yıkayın. Tümör hücrelerini içeren 0.6 mililitrelik konik polipropilen mikro tüpü, hücreleri iyice askıya almak için birkaç kez hafifçe vurun.

Daha sonra mikrolitre şırıngaya iki mikrolitre hücre çekin ve şırıngaya hava kabarcığı girmediğinden emin olun. Hücrelerin bir mikrolitresini %70'lik bir izopropil alkol hazırlama pedine dağıtın ve şırıngada tam olarak bir mikrolitre tümör hücresi bırakın. Daha sonra iğneyi dura mater temas edene kadar aşağı indirin.

Daha sonra iğneyi beynin içine 3,5 milimetre indirin ve ardından iğneyi yavaş ve yumuşak bir şekilde 0,5 milimetre geri çekin. Şırınga pistonuna bir ila iki dakika boyunca bastırarak hücreleri verin. Derin anestezi uygulanmış farede trans kardiyal perfüzyon yapmak.

Kalbin sol ventrikülüne künt bir iğne sokun. Kan kaybı perfüsüne, karaciğer ve akciğerler kan eksikliğine tamamen ağrayana kadar birkaç dakika boyunca tyro solüsyonlu fare dolaşım sistemine izin vermek için sağ atriyumu kesmek için küçük bir çift diseksiyon makası kullanın. Sağ atriyumdan brüt miktarda kan çıkmaya devam etmediğinden emin olun.

20 gauge alüminyum göbek künt iğneyi sol ventrikülden çıkarmadan önce. İğneyi çıkardıktan sonra, fareyi ekstrüde polistiren köpük bloktan çıkarın ve farenin ventral tarafını aşağı çevirin. Büyük bir çift diseksiyon makası kullanarak, kafayı vücudun geri kalanından ayırın.

Daha sonra, kafatasını ortaya çıkarmak için oksipital kemikten buruna doğru çalışan küçük bir çift diseksiyon makası kullanarak kafa derisini orta hatta kesin. Daha sonra, kafatasının her iki tarafındaki cildi geri çekin ve kafatasını güvenli bir şekilde tutun. Oksipital kemikten başlayarak kafatasını dikkatlice kırmak için bir çift kemik URS kullanın ve beynin sırt ve yan yüzeylerini tamamen ortaya çıkarmak için ileri doğru çalışın.

Fare beyninin kafatasına zarar vermeden toplanması başlangıçta zor olabilir. Teknikle ilgili deneyimsiz olanlar, uygun deneyleri yapmadan önce birkaç kez denemek isteyebilirler. Kafatası kemikleri çıkarıldıktan sonra, farenin başını ventral tarafı yukarı çevirin.

Kafatasından kurtarmak için beynin tabanındaki kraniyal sinirleri kesin. Bu prosedürde, temiz, tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak, beynin merkezinden sagital bir kesi yaparak beynin tümörü içeren bölgesini izole edin. İki hemisferi incelemek için, ipsilateral hemisferin medial tarafını aşağı çevirin ve tümör implantını içeren hedef dokuyu izole etmek için beyincikte bir koronal kesim ve koku alma ampulünde başka bir kesim yapın.

Ardından, hedef dokuyu bir mililitre DPBS içeren etiketli cam aşağı doku öğütücüye yerleştirin. Pistonu sonuna kadar aşağı itin ve dokuyu bozmak için yedi kez çevirin. Bundan sonra, sıvının doku öğütücünün dibine geri çökmesini sağlamak için pistonu kaldırın.

Bu adımı üç kez tekrarlayın. Ancak, pistonu sonraki iki tekrar sırasında yalnızca dört kez ve son tekrarlama sırasında üç kez çevirin. Beyin dokusunu aşırı dövmekten kaçınmak için.

Daha sonra, kalan beyin maddesini doku öğütücüye durulamak için pistonun yanlarına üç adet bir mililitre hacimde buz gibi soğuk DPBS uygulayın. Daha sonra TRID beyin maddesini yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alıyoruz ve buz üzerinde etiketli 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştiriyoruz. Aşağı doku öğütücünün kenarlarını ek bir mililitre buz gibi soğuk DPBS ile durulayın ve aynı 15 mililitrelik santrifüj tüpüne ekleyin.

Tüm numuneler işlenene kadar TRID beyin maddesi içeren tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Daha sonra TRID beyin maddesini 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde 740 kez G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca döndürün. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve peletlenmiş beyin maddesini önceden hazırlanmış bir kollajenaz ve DNA bir sindirim enzimi karışımının bir mililitresinde yeniden askıya alın

15 mililitrelik santrifüj tüplerini bir test tüpü rafına yerleştirin ve rafı 15 dakika boyunca 37 derecelik bir hücre CS su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, doku ayrışmasını kolaylaştırmak için tüpleri hafifçe vurarak inkübasyon süresi boyunca numuneleri iki kez nazikçe çalkalayın. Daha sonra, sindirim enzimlerini seyreltmek için her tüpe altı mililitre soğuk DPBS ekleyin.

Toplam hacmi steril 70 mikron naylon ağ filtrelerden buz üzerinde yeni etiketli 15 mililitrelik santrifüj tüplerine yeniden askıya almak ve filtrelemek için yukarı ve aşağı sıkın. Daha sonra, tek bir hücre peleti elde etmek için beyin hücresi süspansiyonunu dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 740 kez G'de döndürün. 15 mililitrelik tüpleri santrifüjden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, bir sonraki adıma hazırlanmak için santrifüj üzerindeki sıcaklık ayarını yaklaşık 21 santigrat dereceye yükseltin. Daha sonra, hücre snatını tamamen çıkarın ve başlangıçta hücre peletlerini bir mililitre %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamında bir P 1000 mikro pipet kullanarak yeniden süspanse edin. Ardından, her tüpe dört mililitre daha %70 yoğunluklu santrifüj ortamı ekleyin.

Kapakları güvenli bir şekilde takın ve tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu homojenize edin, ardından beyin hücrelerini içeren 15 mililitrelik santrifüj tüplerini %70 yoğunlukta yeniden süspanse edin. Buzdan oda sıcaklığında bir test tüpü rafına birer birer santrifüjleme ortamı. İki yoğunluklu santrifüj ortamı katmanı arasında temiz bir arayüz oluşturmak için iki mililitre %37 yoğunluklu santrifüj ortamı çözeltisini beş mililitrelik %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin.

Ardından, iki katman arasındaki arayüzün konumunu ince uçlu bir işaretleyici ile işaretleyin, böylece santrifüjlemeden sonra ayrım daha az belirgin hale geldiğinde kolayca tanımlanabilir. 15 mililitrelik santrifüj tüplerini 740 kez G'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ara vermeden döndürün. Daha sonra yoğunluk santrifüjleme ortamı katmanları arasındaki arayüzün bozulmasını önlemek için, tüpe bir P 200 mikro pipet sokarak iki yoğunluk santrifüjleme ortamı katmanı arasındaki arayüzde biriken pbmc'yi toplayın.

Lipid tabakasını PBMC bandı seviyesinde bir kez dikkatlice atlayarak, %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamı tabakasının yüzeyinden 200 mikrolitreyi yavaşça çıkarın ve buz üzerinde sırasıyla etiketlenmiş bir polipropilen faks tüpüne aktarın. Numune başına toplam 400 mikrolitre hacim elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın. İki yoğunluk santrifüjleme ortamı katmanı arasında temiz bir arayüz oluşturmaya yönelik deneysel yetenek, p BMC'lerin tekrarlanabilir izolasyonu için çok önemlidir.

Tüpü tezgah üstünden 20 ila 30 derece açı verirken %37 yoğunluklu santrifüj ortamı yavaşça dökülmelidir. Bu şekil, beşinci adımda ve NK 1.1'de gösterilen GR bir pozitif CD 11 B pozitif miyeloid hücrelere yerleştirilen tipik bir deney kapısı için geçit stratejisini göstermektedir. Altıncı adımda gösterilen pozitif doğal öldürücü hücreler daha sonra sırasıyla beşinci ve altıncı asal adımlarda GZMB ekspresyonuna dayalı olarak tabakalandırılır.

Bu şekilde, SSCA'ya karşı FSCA'ya GR bir pozitif CD 11 B pozitif miyeloid hücresi ve NK 1.1 pozitif doğal öldürücü hücrelerin geri çekilmesi, nispeten daha büyük boyutlu miyeloid popülasyona kıyasla doğal öldürücü hücrelerin daha küçük lenfoid boyutunu gösterir, böylece bu iki pbmc alt popülasyonunun kimliğinin daha fazla doğrulanmasını sağlar. Buradaki veriler, GL 26 sital one I glioma hücrelerinin singen içine aşılandığını göstermektedir. Bir XC 57 siyah altı J fare beyni, GL 26 sit GAL bir I eğrisi boyunca her bir veri noktasıyla ilişkili olarak gösterilen CD 45 pozitif PBMC numaralarının alımını hızla indükler, kontrolün üzerinde pbmc'ye sızan tümörün kıvrım indüksiyonunu temsil eder.

GGL 26, gösteride kullanılan spesifik antikor kokteyline dayalı olarak tümör implantasyonu veya HPI'den sonra belirtilen saatte NT tümörleri, GR bir pozitif CD 11 B pozitif miyeloid hücreleri ve NK 1.1 Pozitif doğal öldürücü hücrelerin, tümör engraftasyonundan sonraki 48 saat içinde GAL bir eksik tümör mikroçevresine spesifik olarak girdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, miyeloid hücrelere sızan gliomaların toplam sayısı, doğal öldürücü hücrelerinkinden çok daha ağır bastı. Bir kez ustalaştıktan sonra, metodoloji beyin hasadından akışa kadar ana hatlarıyla belirtilir.

Sitometrik analiz, bir deneyci tarafından yaklaşık altı saat içinde gerçekleştirilebilir. PBMC tamamlayıcı deneylerine sızan toplam glioma sayısının adil bir karşılaştırmasını elde etmek için her bir PBMC örneğinin tüm hacminin akış sitometresi tarafından analiz edilmesi zorunludur. Bu tür immünohistokimyasal analiz, bağışıklık hücresi infiltratları hakkında mekansal veriler elde etmek ve bu prosedür kullanılarak değerlendirilenlere karşılık gelen zaman noktalarında genel tümör boyutunun ve mikroanatominin ölçülmesine izin vermek için gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, genel prosedürde önemli değişiklikler olmaksızın plazma DNA'sını kodlayan onkogen kullanılarak de novo üretilenler de dahil olmak üzere çeşitli beyin tümörü modellerinin çalışmasına uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, stereotaktik ve greftman için glioma hücre süspansiyonlarının bir fare beynine nasıl hazırlanacağını, bol miktarda tümörün, beyin taşıyan farelerin nasıl geçirileceğini ve sito'nun metrik olarak nasıl izole edileceğini ve akıtacağız, periferik kan mononükleer hücrelerine sızan gliomu analiz etmeyi iyi anlamalısınız.