Name: İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Öğrenin glioma sızmış periferik kan mononükleer hücrelerinin akış sitometrik analizi yöntemini. Bu teknik, erken beyin tümörü mikroçevresindeki immün hücrelerin sayısını ve aktivasyon durumunu zamana bağlı olarak nicel olarak belirler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) MGC R01-NS074387, R01-R21-NS057711 ve NS091555 hibe ve / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; NIH / NINDS PRL için R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21-NS082311 ve NS084275 verir; Leah Mutlu Kalpler gelen hibeler, MGC ve PRL layık Michigan Kapsamlı Kanser Merkezi&#39;nde Üniversitesi; Nöroşirürji Tıp Michigan Okulu Üniversitesi Anabilim Dalı; NIH hibe 2UL1-TR000433 tarafından desteklenen Klinik Michigan Enstitüsü ve Sağlık Araştırması; NIH / NCI (National Cancer Institute) hibe T32-CA009676 tarafından desteklenen Michigan Üniversitesi Kanser Biyolojisi Eğitim Hibe; NIH / NINDS tarafından desteklenen Klinik ve Temel Nörobilim Michigan Eğitim Üniversite T32-NS007222 hibe; ve NIH / NIGMS (Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü) tarafından desteklenen Michigan Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı Üniversite T32-GM007863 hibe. YazarlarDr Karin Muraszko ve Nöroşirürji Anabilim alınan akademik liderlik ve destek için müteşekkir yeniden; M. Dahlgren, D. Tomford ve mükemmel idari destek S. Napolitan için; üstün teknik yardım için, M. Dzaman için; ve bir Zeiss 3D Taramalı Elektron Mikroskobu satın alma yönünde cömert destek için Phil F. Jenkins için. Biz de beyin mononükleer hücrelerin izolasyonu için yoğunluk santrifüj medya aracılı stratejinin değiştirilmiş bir versiyonu çizilmiş olan Harvard Tıp Okulu&#39;nda Kuchroo laboratuvar kabul etmiş sayılırsınız.

<ol><li>Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+understanding+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma.</a> J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+statistical+report%3A+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523, 337-341 (2015).</li>
<li>Kennedy, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+glioma%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol.%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe?</a> J Oncol.. 2013, 486912(2013).</li>
<li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li>
<li>Kmiecik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+CD3%2B+and+CD8%2B+tumor-infiltrating+immune+cells+correlate+with+prolonged+survival+in+glioblastoma+patients+despite+integrated+immunosuppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment+and+at+the+systemic+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level.</a> J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+infiltrate+differences+in+pilocytic+astrocytoma+and+glioblastoma%3A+evidence+of+distinct+immunological+microenvironments+that+reflect+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology.</a> J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial%2Fmacrophage+expression+of+interleukin+10+in+human+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas.</a> Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).</li>
<li>El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increase+in+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+of+human+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme.</a> Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).</li>
<li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+regulation+of+human+monocytic%2Fmicroglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation.</a> J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+mediates+endogenous+TLR2+activation+and+brain+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression.</a> PLoS Med. 6, e10(2009).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+recruits+plasmacytoid+dendritic+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain.</a> J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).</li>
<li>Mineharu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+brain+tumor+microenvironment+enhances+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination%3A+implications+for+clinical+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design.</a> Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).</li>
<li>Larocque, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+overrides+brain+immune+privilege+and+facilitates+recognition+of+a+neo-antigen+without+causing+autoimmune+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+depletion+inhibits+efficacy+of+cancer+immunotherapy%3A+implications+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials.</a> PLoS One. 3, e1983(2008).</li>
<li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunostimulation+and+conditional+cytotoxic+gene+therapy+provide+long-term+survival+in+a+large+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model.</a> Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).</li>
<li>Dewey, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+brain+inflammation+and+persistent+herpes+simplex+virus+1+thymidine+kinase+expression+in+survivors+of+syngeneic+glioma+treated+by+adenovirus-mediated+gene+therapy%3A+implications+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials.</a> Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).</li>
<li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+eradicate+galectin-1-deficient+glioma+in+the+absence+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity.</a> Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).</li>
<li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+glioma+formation%3A+iterative+perivascular+glioma+growth+and+invasion+leads+to+tumor+progression%2C+VEGF-independent+vascularization%2C+and+resistance+to+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy.</a> Neoplasia. 16, 543-561 (2014).</li>
<li>Ormerod, M. G., Novo, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Flow+cytometry+%3A+a+basic+introduction%22">Flow cytometry : a basic introduction</a>. , (2008).</li>
<li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li>
<li>Hirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+phenotype+of+activated+microglia%2Fmacrophages+within+the+spinal+cord+of+the+hyperostotic+mouse+%28twy%2Ftwy%29+changes+in+response+to+chronic+progressive+spinal+cord+compression%3A+implications+for+human+cervical+compressive+myelopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy.</a> PLoS One. 8, e64528(2013).</li>
<li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+%28Gr-1%29+detects+members+of+the+Ly-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69, 431-439 (2009).</li>
<li>Holland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+activation+of+Ras+and+Akt+in+neural+progenitors+induces+glioblastoma+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice.</a> Nat Genet. 25, 55-57 (2000).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-induced+high-grade+gliomas+in+rats%3A+the+effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).</li>
<li>de Vries, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+transgenic+high-grade+glioma+mouse+models+for+therapy+intervention+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies.</a> Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).</li>
<li>Uhrbom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ink4a-Arf+loss+cooperates+with+KRas+activation+in+astrocytes+and+neural+progenitors+to+generate+glioblastomas+of+various+morphologies+depending+on+activated+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt.</a> Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15, 110-116 (2009).</li>
<li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, erken fare beyin tümör mikro sızmış PBMC izole edilmesi ve akış sitometrik analiz için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Glioma hücre süspansiyonları stereotaksi fare beyninin striatumu içine aşılanan deneye ile belirtilen bir konsantrasyonda oluşturulur. Fareler daha sonra deney tasarımı ile belirtilmiş önceden belirlenmiş zaman noktalarında itlaf edilmiş ve beyinleri hasat edildi ve florokrom-eşlenik birincil antikor kombinasyonları ile immunolabeled edilir glioma süzücü PBMC izole etmek iç...

Gliomalar, merkezi sinir sistemi (CNS) dönüştürülmüş glia kaynaklanan nöroepitelyal Beyin kanserlerinin sınıfıdır. Tüm Gliomaların, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Evre IV glioma veya glioblastoma (GBM), en yaygın ve 1 ölümcül olanıdır. GBM temozolomidin 2 ile radyasyon artı eşzamanlı ve adjuvan kemoterapi takiben ölçüde mümkün tümör rezeksiyonu oluşan mevcut standart-bakım son derece dirençli olduğunu. Bu ölümcül kanserler 5 yıl sonra 3 hastalık hayatta kalan hastaların sadece% 5 ile ilk tanı anında hayatta kalma, sadece 15-18 ay kasvetli prognoz taşır. Kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı, profesyonel antijen sunan hücreler eksikliği (APC&#39;ler) ve beyin 4 içindeki niyetli lenf yapılarının daha önce tanımlanmamış varlığı ayrıcalıklı immün GBM kavramına yol açmıştır. Ancak, çok sayıda çalışmalar artık shobu beyin kanserleri gerçekten de, monositler, makrofajlar, ve miyeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSCs) 5 içerir kökenli ağırlıklı miyeloid periferal bağışıklık hücrelerinin alınmasını doğurmak bu w. GBM de 6,7 yanlısı tümörijenik olmak için beyin ikamet mikroglia aktivitesini etkilemektedir. Örneğin CD8 + T hücrelerinin CD56 + 8 ve doğal öldürücü hücrelerin 9 lenfatik hücreler de tümörün mikro-ortamı içinde mevcut olan, ancak çok daha az sayıda, düşünülen bir gerçektir (nedeniyle tümör bağlantılı makrofajlar üzerinde glioma türetilmiş faktör tarafından teşvik bağışıklık işlevine olduğu TAM) 10. CD4 + T hücreleri GBM de mevcut, ancak bu nüfusun çok da CD25 ve Foxp3, immünosupresif T regülatör (T reg) hücrelerinin 11 yapımcıları ifade eder. GBM genel bağışıklık durumu immünolojik kaçış ve tümör ilerlemesi 12. promosyon sona eriyor. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; GBM immunsupresyonun mekanizmaların daha iyi anlaşılması tümöre karşı bağışıklık sistemini uyarmak için tasarlanmış etkili immunoterapötik stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Son 15 yılda bizim laboratuvar etkili yeni bir anti-GBM immünoterapötiklerin 13-19 geliştirmek için beyin tümörü immunosuppresson mekanizmalarını aşmak için çalıştı. Bu eserin doruk noktası artık yeni teşhis GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov Identifier) ​​olan hastalar için kombine sitotoksik ve bağışıklık uyarıcı terapötik değerlendirmek için tasarlanmış bir klinik çalışmaya yol açmıştır. En son çalışmalar, fare ve sıçan CNS GL26-1 GBM hücreleri β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin-1 (gal-1), 20, büyük miktarlarda üretilmesi anti-tümör NK hücre immün gözetim bloke olduğunu göstermektedir. Bu shRNA aracılı gen demonte kullanılarak glioma hücreleri gal-1 ekspresyonunu bastırmak ile gösterilmiştir. İn vitro experiments gal-1 eksikliği glioma hücreleri kültürde normal çoğaldı gösterdi, ancak genetik olarak özdeş C57BL / 6J veya RAG1 içine intrakranial engraftment kısa bir süre sonra hızlı ret uygulandı - / - farelerin, böylece bu formda T veya B hücrelerinin bağımsızlığını kuran tümör rejeksiyon. Anti asiolo GM 1, anti-serum veya gal-1-eksikliği olan glioma reddi NK hücrelerinin rolünün oluşturulması intrakraniyal gal-1-eksikliği olan glioma büyümesinin komple restorasyonuna yol açan monoklonal NK1.1 antikorları ile NK hücre bağışıklık sistemine. Şimdi Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bu bağışıklık sistemindeki durumu göstermektedir, böylece, NK-aracılı gal yardımında miyeloid hücreleri için bir vazgeçilmez yardımcı bir rol ortaya NK hücrelerin varlığına rağmen gal-1-eksikliği olan gliom reddini önlemek için yeterli olan -1 eksik tümör lizis (yayınlanmamış veriler). Bu beklenmedik sonuç, periferik kan mononükleer hücrelerin izolasyonu ve analiz (PBMC) için kapsamlı bir protokol geliştirmek için yol olduğudaha iyi gal-1 eksik glioma reddini yüklem bağışıklık sızma olayları karakterize böylece yakında intrakranial engraftment sonra beyin tümörü mikro sızmak. Yöntem, GL26-Cit olarak adlandırılan bir şekilde eksprese mCitrine floresan protein, floresan mikroskobu 21 doğrudan tümör hücresi görüntülenmesine izin vereceği şekilde bir fare GL26 glioma hücreleri kullanılarak burada gösterilmiştir. Bu hücreler stereotaksi singeneik C57BL / 6J fareler, beyin içine aşılanan ve önceki fare ötenaziye 24, 48 ya da 72 saat boyunca büyümeye bırakılmıştır. Glioma nüfuz eden PBMC&#39;ler daha sonra anti -CD45 kullanılarak izole edilir ve imüno-edilir, -Gr-1, -CD11b ve granzim B hücre içi immunolabeling birlikte -NK1.1 hücre yüzeyi antikorlar (GzmB). Antikorların Bu özel bileşimi Bu var b tümör-süzücü Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin tanımlanması ve NK1.1 +, NK hücreleri, hücre tipleri için izin verireen gal-1 eksikliği tümör reddi karışmış. Gal-1-eksikliği olan GL26-Cit glioma bağışıklık infiltrasyonu profili, GL26-Cit-gal1i olarak anılacaktır, daha sonra, bir non-içeren gal-1 GL26-Cit-NT adı normal seviyelerini sentezleyen gliomlar ile karşılaştırılır Kontrol ShRNA hairpin hedefleme. Protokol ortotopikal singeneik C57BL / 6J fareler striatumu içine, bu hücrelerin sokmak için nasıl bir açıklama takip eder, in vitro olarak nasıl Kültür GL26-Cit glioma hücreleri üzerinde bir açıklama ile başlar. Daha sonra izolasyon ve akım sitometri analizi için glioma-infiltre PBMC&#39;lerin immunolabeling ilgili adımları saymaya devam eder. Protokol standart veri analizi ve grafik gösterimi bir açıklama ile sona eriyor. Gösteri ortaya koymaktadır hem Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri tercihen 48 içinde gal-1 eksikliği beyin tümörü mikroçevresinin içinde birikirTümör implantasyonu, bu tümörler hızla tam tümör lizis yaklaşık 1 hafta sonrası tümör melezleme 20 geçmesi açıklamaya yardımcı olan bir sonucun hr. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo olarak farklı deney tasarımları bir dizi için de uyarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat protokolü gerçekleştirebilir. Yöntem aynı zamanda, özellikle tümör mikro-ortamı tarafından uyarılan bağışıklık bastırma fenotipleri tespit etmek, böylece beyin sızmaya olanlar ile karşılaştırıldığında tümör taşıyan farelerdeki PBMC&#39;ler dolaşan profilini karakterize etmek için amaçlanmıştır deneyler ile kombine edilebilir. Bu ve benzeri yöntemlerin uygulanması beyin tümörü mikroçevresinin içine periferik bağışıklık hücrelerinin kaçakçılığıyla faktörlerin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054'ün</td><td>4.5g/L D-glikoz, L-glutamin, 25 mM HEPES ve fenol kırmızısı ile modifikasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>kalsiyum klorür veya Magnezyum klorür olmadan</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml Penisilin; 10.000 &mu; g/ml Streptomisin&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 sülfat ve nbsp;</td><td>Omega Bilimsel A.Ş.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür ve nbsp; &nbsp;</td><td>Streptomyces alboniger</td>HyClone HyQTase'den <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td></tr>, <tr><td>memeli olmayan tripsin alternatifi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>DPBS'de EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Faz kontrastlı hemositometre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0,1 mm derinliğinde</td></tr><tr><td>Tripan mavisi leke</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Steril% 0.9 NaCl enjeksiyonu, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>10 ml şişeler</td></tr><tr><td>0.6 ml konik polipropilen mikrotüpler</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol hidroklorür enjeksiyonu</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>5 mg / ml çözelti</td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür enjeksiyonu</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051</td><td>100 mg / ml çözelti</td></tr><tr><td>Deksmedetomidin hidroklorür enjeksiyonu</td><td>Zoetis</td><td>NDC: 54771-2805</td><td>0.5 mg / ml çözelti</td></tr><tr><td>Ksilazin hidroklorür enjeksiyonu</td><td>Lloyd</td><td>NDC: 61311-481</td><td>100 mg / ml çözelti</td></tr><tr><td>Carprofen enjeksiyonu</td><td>Pfizer</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>50 mg / ml çözelti</td></tr><tr><td>Buprenorfin hidroklorür enjeksiyonu</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td><td>0.3 mg / ml ampul</td></tr><tr><td>1 ml tüberkülin şırıngaları ve nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; (0,45 mm x 13 mm) şırınga iğneleri&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makaslar</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Providon-iyot çözeltisi</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>Steril vazelin oftalmik merhem&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>%70 izopropil alkol hazırlama pedleri</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Steril gazlı bez</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>dokumasız, 4" x 4", 4 katlı&nbsp;</td></tr><tr><td>1.7 ml konik polipropilen mikrotüpler</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Fare stereotaktik çerçevesi</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi lamba</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II Değişken Spot Işığı</td></tr><tr><td>Kavisli diseksiyon forseps</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Colibri ekartörleri&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Akülü hassas elektrikli matkap</td><td>Dremel&nbsp;</td><td>1100-01</td><td>Stylus modeli; 7,2 Volt Lityum-İyon Bağlantı İstasyonu</td></tr><tr><td>Gravür Kesici</td><td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32" veya 0,8 mm uç çapı</td></tr><tr><td>Mikrolitre şırınga</td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Hamilton Mikrolitre Şırıngalar 700 serisi; 5 & mu; l hacim</td></tr><tr><td>Mikrolitre şırınga iğneleri</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, küçük göbek RN NDL, 1.5 inç, nokta stili 3, 6 / PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 siyah monofilament naylon sütürler ve nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma çubuğu</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7,9 mm çap x 50 mm uzunluk (5/16" çap x 2" uzunluk)</td></tr><tr><td>1 L cam vidalı kapaklı saklama şişesi</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Tip 1, Sınıf A borosilikat cam</td></tr><tr><td>Heparin sodyum&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>1.000 U/ml çözelti</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II konsol sürücüsü</td></tr><tr><td>sıkıştırılmış karbojen (%95 O2 %5 CO2)</td> <td>yerel satıcıdan temin edilebilir</td><td>N/A</td><td>tipi, büyük silindir&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 ve frak12; » alüminyum göbek künt iğneler</td><td>Kendall</td><td>8881202363</td><td>0,9 mm x 38,1 mm</td></tr><tr><td>Poliüretan buz kovası</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Kapasite: 0.152 oz. (4.5L)</td></tr> <tr><td>Kollajenaz (Tip I-S)</td> <td>Clostridium histolyticum'dan</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td>&nbsp;</tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I</td><td>Worthington Biyokimya A.Ş.</td><td>LS002007</td><td>>mg kuru ağırlık başına 2.000 Kunitz birimi</td></tr><tr><td>Antistatik polistiren altıgen tartı kapları</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>20157-3</td><td>üst iç çap 115 mm, taban iç çapı 85 mm, 203 ml hacim&nbsp;</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik tek kenarlı tıraş bıçakları&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Kemik rongeurları</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Büyük diseksiyon makası</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Küçük diseksiyon makası</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu forseps</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml cam Dounce doku öğütücü</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Yoğunluk Santrifüj Ortamı&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serolojik pipetler</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>tek kullanımlık; steril</td></tr><tr><td>70 & mu; M Steril Naylon Mesh Hücre Süzgeçleri&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 konjuge sıçan anti-fare CD45 (klon: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>APC konjuge fare anti-fare NK1.1 (klon: PK136)</td> <td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>PE konjuge sıçan anti-fare Gr-1 (klon: RB6-8C5)</td> <td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5-konjuge sıçan anti-fare CD11b (klon: M1 / 70)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 konjuge sıçan IgG2b, &kappa; (klon: RTK4530) izotip kontrolü&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>APC konjuge fare IgG2a, &kappa; (klon: eBM2a) izotip kontrolü&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>PE konjuge sıçan IgG2b, &kappa; (klon: eB149/10H5) izotip kontrolü&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5 konjuge sıçan IgG2b, &kappa; (klon: RTK4530) izotip kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>Pasifik Mavisi konjuge fare anti-fare granzim B (Klon: GB11)&nbsp;</td><td>Pasifik</td><td>Mavisi</td> konjuge fare IgG1, &kappa 515403 <td></td>Biolegend</tr><tr><td>; (Klon: MOPC-21) izotip kontrolü&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropilen santrifüj tüpleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>konik tabanlı&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml polipropilen santrifüj tüpleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td>konik tabanlı</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm yuvarlak tabanlı polipropilen FACS tüpleri&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Özel Sipariş Araştırma Ürün akış sitometresi/hücre sıralayıcı</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>The Baker Company</td><td>SG603</td><td>modeli: SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin akışı sitometrik analizi

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Laboratuvar son doğal katil (NK) hücreler, kanser hücrelerinin β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin salgılamasında eksiklik kılınmış halinde intrakranial engraftment sonra merkezi sinir sistemi 1 malign gliomalar yakında ortotopikal implante fare ve sıçanı GL26 yok etme kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamaktadır -1 (gal-1). Daha yeni iş artık Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bir popülasyonu bu yönde önemli olduğunu göstermektedir. Daha NK ve miyeloid hücrelerin, izolasyon ve glioma infiltre periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) analizi için geniş kapsamlı bir protokol geliştirilmiştir gal-1-eksikliği olan tümör reddinin kazandırmak için ortak olarak kullanmaktadırlar mekanizmalarının anlaşılması. Yöntem tümörün mikro içine PBMC sızmasını karşılaştırarak burada gösterilmiştir ShRNA demonte aracılığıyla gal-1 eksikliği hale olanlarla GL26 gliomalarda gal-1 ifade. Protokol bir bilgi ile başlar nasıl kültürü ve GL26 ce hazırlamaksingeneik C57BL / 6J fare beyin aşılama için lls. Daha sonra erken beyin tümörü mikroçevresinin gelen glioma-infiltre PBMC&#39;lerin izolasyon ve akım sitometri analizi yer alan adımları açıklar. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo deney tasarımları bir dizi uyarlanabilir. Glioma süzücü PBMC&#39;ler bağımsız deneyler boyunca zaman noktası eşleşen tümörlerden gözlenen benzer hücre sayısı ile 24 saat sonrası tümör melezleme olan en kısa sürede, kafatası tümörlerinden izole edilebilir bir yöntem, hassas ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat yöntemi gerçekleştirebilir. Alternatif glioma modeller ve / veya hücre spesifik saptama antikorları ayrıca birçok Immun süzülmesini değerlendirmek için deneysel çalışan takdirine kullanılabilirGenel prosedüre değişiklikler gerektirmeden ilgi e hücre tipleri.

Aşağıdaki yolluk strateji tipik bir deney için kullanılır: FSC-A SSC-A vs → SSC-H vs SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 vs vs sayım → Gr-1 vs CD11b → saymak vs NK1.1. Kapıları daha sonra GzmB ekspresyonu (Şekil 5A) göre tabakalı Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri yerleştirilir. NK1.1 + NK hücreleri ve Gr-1 + / CD11 b SSC-A NK hücrelerinin küçük lenfoid ve miyeloid hücreler boyutu nispeten büyük boyutu teyit edin FSC A üzerine deneyl...

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Bu prosedürün genel amacı, erken beyin tümörü mikroçevresine sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin sayısını karakterize etmek ve ölçmektir. Bu yöntem, periferik bağışıklık hücrelerinin beyin tümörü mikroçevresine kaçakçılığı için önemli faktörleri belirleyerek beyin tümörü immünolojisi alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu CNS'ye giren lökositlerin sayısı ve aktivasyon durumu hakkında zamana bağlı nicel veriler vermesidir.Anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirdikten sonra, bir neşter bıçağı kullanarak kafatası üzerinde frontal kemikten oksipital kemiğe kadar iki santimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Daha sonra Collibra ekartörlerini kullanarak insizyondaki cildi geri çekin. Bundan sonra, 33 gauge iğne ile donatılmış bir mikrolitrelik şırıngayı doğrudan bma'nın üzerine indirin.Tümör implantasyonu için hedef bölgeye ulaşmak için iğnenin konumunu ayarlayın. Daha sonra, bu konumu işaretlemek için 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik tüberkülin şırıngası kullanın, bundan sonra periosteuumu nazikçe ekleyerek. Delme sırasında alttaki dura mater'e ulaşana kadar 0.8 milimetre matkap ucuyla hedef bölgedeki kafatasına bir delik açın.Aşırı ısı ve kuvveti önlemek için aralıklı basınç uygulayın ve ardından matkap ucunu kafatası yüzeyinden hızlı bir şekilde çıkarın. Ardından, iğnenin tıkanmadığından emin olmak için mikrolitre şırıngayı 1,7 mililitrelik konik polipropilen mikro tüpte% 0,9 sodyum klorür ile yıkayın. Tümör hücrelerini içeren 0.6 mililitrelik konik polipropilen mikro tüpü, hücreleri iyice askıya almak için birkaç kez hafifçe vurun.Daha sonra mikrolitre şırıngaya iki mikrolitre hücre çekin ve şırıngaya hava kabarcığı girmediğinden emin olun. Hücrelerin bir mikrolitresini %70'lik bir izopropil alkol hazırlama pedine dağıtın ve şırıngada tam olarak bir mikrolitre tümör hücresi bırakın. Daha sonra iğneyi dura mater temas edene kadar aşağı indirin.Daha sonra iğneyi beynin içine 3,5 milimetre indirin ve ardından iğneyi yavaş ve yumuşak bir şekilde 0,5 milimetre geri çekin. Şırınga pistonuna bir ila iki dakika boyunca bastırarak hücreleri verin. Derin anestezi uygulanmış farede trans kardiyal perfüzyon yapmak.Kalbin sol ventrikülüne künt bir iğne sokun. Kan kaybı perfüsüne, karaciğer ve akciğerler kan eksikliğine tamamen ağrayana kadar birkaç dakika boyunca tyro solüsyonlu fare dolaşım sistemine izin vermek için sağ atriyumu kesmek için küçük bir çift diseksiyon makası kullanın. Sağ atriyumdan brüt miktarda kan çıkmaya devam etmediğinden emin olun.20 gauge alüminyum göbek künt iğneyi sol ventrikülden çıkarmadan önce. İğneyi çıkardıktan sonra, fareyi ekstrüde polistiren köpük bloktan çıkarın ve farenin ventral tarafını aşağı çevirin. Büyük bir çift diseksiyon makası kullanarak, kafayı vücudun geri kalanından ayırın.Daha sonra, kafatasını ortaya çıkarmak için oksipital kemikten buruna doğru çalışan küçük bir çift diseksiyon makası kullanarak kafa derisini orta hatta kesin. Daha sonra, kafatasının her iki tarafındaki cildi geri çekin ve kafatasını güvenli bir şekilde tutun. Oksipital kemikten başlayarak kafatasını dikkatlice kırmak için bir çift kemik URS kullanın ve beynin sırt ve yan yüzeylerini tamamen ortaya çıkarmak için ileri doğru çalışın.Fare beyninin kafatasına zarar vermeden toplanması başlangıçta zor olabilir. Teknikle ilgili deneyimsiz olanlar, uygun deneyleri yapmadan önce birkaç kez denemek isteyebilirler. Kafatası kemikleri çıkarıldıktan sonra, farenin başını ventral tarafı yukarı çevirin.Kafatasından kurtarmak için beynin tabanındaki kraniyal sinirleri kesin. Bu prosedürde, temiz, tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak, beynin merkezinden sagital bir kesi yaparak beynin tümörü içeren bölgesini izole edin. İki hemisferi incelemek için, ipsilateral hemisferin medial tarafını aşağı çevirin ve tümör implantını içeren hedef dokuyu izole etmek için beyincikte bir koronal kesim ve koku alma ampulünde başka bir kesim yapın.Ardından, hedef dokuyu bir mililitre DPBS içeren etiketli cam aşağı doku öğütücüye yerleştirin. Pistonu sonuna kadar aşağı itin ve dokuyu bozmak için yedi kez çevirin. Bundan sonra, sıvının doku öğütücünün dibine geri çökmesini sağlamak için pistonu kaldırın.Bu adımı üç kez tekrarlayın. Ancak, pistonu sonraki iki tekrar sırasında yalnızca dört kez ve son tekrarlama sırasında üç kez çevirin. Beyin dokusunu aşırı dövmekten kaçınmak için.Daha sonra, kalan beyin maddesini doku öğütücüye durulamak için pistonun yanlarına üç adet bir mililitre hacimde buz gibi soğuk DPBS uygulayın. Daha sonra TRID beyin maddesini yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alıyoruz ve buz üzerinde etiketli 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştiriyoruz. Aşağı doku öğütücünün kenarlarını ek bir mililitre buz gibi soğuk DPBS ile durulayın ve aynı 15 mililitrelik santrifüj tüpüne ekleyin.Tüm numuneler işlenene kadar TRID beyin maddesi içeren tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Daha sonra TRID beyin maddesini 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde 740 kez G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca döndürün. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve peletlenmiş beyin maddesini önceden hazırlanmış bir kollajenaz ve DNA bir sindirim enzimi karışımının bir mililitresinde yeniden askıya alın.15 mililitrelik santrifüj tüplerini bir test tüpü rafına yerleştirin ve rafı 15 dakika boyunca 37 derecelik bir hücre CS su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, doku ayrışmasını kolaylaştırmak için tüpleri hafifçe vurarak inkübasyon süresi boyunca numuneleri iki kez nazikçe çalkalayın. Daha sonra, sindirim enzimlerini seyreltmek için her tüpe altı mililitre soğuk DPBS ekleyin.Toplam hacmi steril 70 mikron naylon ağ filtrelerden buz üzerinde yeni etiketli 15 mililitrelik santrifüj tüplerine yeniden askıya almak ve filtrelemek için yukarı ve aşağı sıkın. Daha sonra, tek bir hücre peleti elde etmek için beyin hücresi süspansiyonunu dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 740 kez G'de döndürün. 15 mililitrelik tüpleri santrifüjden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin.Ardından, bir sonraki adıma hazırlanmak için santrifüj üzerindeki sıcaklık ayarını yaklaşık 21 santigrat dereceye yükseltin. Daha sonra, hücre snatını tamamen çıkarın ve başlangıçta hücre peletlerini bir mililitre %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamında bir P 1000 mikro pipet kullanarak yeniden süspanse edin. Ardından, her tüpe dört mililitre daha %70 yoğunluklu santrifüj ortamı ekleyin.Kapakları güvenli bir şekilde takın ve tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu homojenize edin, ardından beyin hücrelerini içeren 15 mililitrelik santrifüj tüplerini %70 yoğunlukta yeniden süspanse edin. Buzdan oda sıcaklığında bir test tüpü rafına birer birer santrifüjleme ortamı. İki yoğunluklu santrifüj ortamı katmanı arasında temiz bir arayüz oluşturmak için iki mililitre %37 yoğunluklu santrifüj ortamı çözeltisini beş mililitrelik %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin.Ardından, iki katman arasındaki arayüzün konumunu ince uçlu bir işaretleyici ile işaretleyin, böylece santrifüjlemeden sonra ayrım daha az belirgin hale geldiğinde kolayca tanımlanabilir. 15 mililitrelik santrifüj tüplerini 740 kez G'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ara vermeden döndürün. Daha sonra yoğunluk santrifüjleme ortamı katmanları arasındaki arayüzün bozulmasını önlemek için, tüpe bir P 200 mikro pipet sokarak iki yoğunluk santrifüjleme ortamı katmanı arasındaki arayüzde biriken pbmc'yi toplayın.Lipid tabakasını PBMC bandı seviyesinde bir kez dikkatlice atlayarak, %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamı tabakasının yüzeyinden 200 mikrolitreyi yavaşça çıkarın ve buz üzerinde sırasıyla etiketlenmiş bir polipropilen faks tüpüne aktarın. Numune başına toplam 400 mikrolitre hacim elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın. İki yoğunluk santrifüjleme ortamı katmanı arasında temiz bir arayüz oluşturmaya yönelik deneysel yetenek, p BMC'lerin tekrarlanabilir izolasyonu için çok önemlidir.Tüpü tezgah üstünden 20 ila 30 derece açı verirken %37 yoğunluklu santrifüj ortamı yavaşça dökülmelidir. Bu şekil, beşinci adımda ve NK 1.1'de gösterilen GR bir pozitif CD 11 B pozitif miyeloid hücrelere yerleştirilen tipik bir deney kapısı için geçit stratejisini göstermektedir. Altıncı adımda gösterilen pozitif doğal öldürücü hücreler daha sonra sırasıyla beşinci ve altıncı asal adımlarda GZMB ekspresyonuna dayalı olarak tabakalandırılır.Bu şekilde, SSCA'ya karşı FSCA'ya GR bir pozitif CD 11 B pozitif miyeloid hücresi ve NK 1.1 pozitif doğal öldürücü hücrelerin geri çekilmesi, nispeten daha büyük boyutlu miyeloid popülasyona kıyasla doğal öldürücü hücrelerin daha küçük lenfoid boyutunu gösterir, böylece bu iki pbmc alt popülasyonunun kimliğinin daha fazla doğrulanmasını sağlar. Buradaki veriler, GL 26 sital one I glioma hücrelerinin singen içine aşılandığını göstermektedir. Bir XC 57 siyah altı J fare beyni, GL 26 sit GAL bir I eğrisi boyunca her bir veri noktasıyla ilişkili olarak gösterilen CD 45 pozitif PBMC numaralarının alımını hızla indükler, kontrolün üzerinde pbmc'ye sızan tümörün kıvrım indüksiyonunu temsil eder.GGL 26, gösteride kullanılan spesifik antikor kokteyline dayalı olarak tümör implantasyonu veya HPI'den sonra belirtilen saatte NT tümörleri, GR bir pozitif CD 11 B pozitif miyeloid hücreleri ve NK 1.1 Pozitif doğal öldürücü hücrelerin, tümör engraftasyonundan sonraki 48 saat içinde GAL bir eksik tümör mikroçevresine spesifik olarak girdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, miyeloid hücrelere sızan gliomaların toplam sayısı, doğal öldürücü hücrelerinkinden çok daha ağır bastı. Bir kez ustalaştıktan sonra, metodoloji beyin hasadından akışa kadar ana hatlarıyla belirtilir.Sitometrik analiz, bir deneyci tarafından yaklaşık altı saat içinde gerçekleştirilebilir. PBMC tamamlayıcı deneylerine sızan toplam glioma sayısının adil bir karşılaştırmasını elde etmek için her bir PBMC örneğinin tüm hacminin akış sitometresi tarafından analiz edilmesi zorunludur. Bu tür immünohistokimyasal analiz, bağışıklık hücresi infiltratları hakkında mekansal veriler elde etmek ve bu prosedür kullanılarak değerlendirilenlere karşılık gelen zaman noktalarında genel tümör boyutunun ve mikroanatominin ölçülmesine izin vermek için gerçekleştirilebilir.Bu teknik, genel prosedürde önemli değişiklikler olmaksızın plazma DNA'sını kodlayan onkogen kullanılarak de novo üretilenler de dahil olmak üzere çeşitli beyin tümörü modellerinin çalışmasına uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, stereotaktik ve greftman için glioma hücre süspansiyonlarının bir fare beynine nasıl hazırlanacağını, bol miktarda tümörün, beyin taşıyan farelerin nasıl geçirileceğini ve sito'nun metrik olarak nasıl izole edileceğini ve akıtacağız, periferik kan mononükleer hücrelerine sızan gliomu analiz etmeyi iyi anlamalısınız.

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.

Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Video, tümöre sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak bir fare beyninden izolasyonunu göstermektedir. Bunu, daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplamak için yoğunluk gradyan santrifüjlemesi takip eder.

Murin Beyninden Tümör İçeren Bağışıklık Hücrelerinin İzole Edilmesi

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP'nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

İnvaziv cephede glioma tümör mikroçevresini replike etmek için interstisyel sıvı akışını içeren bir yöntem sunuyoruz. Bu model, bir sıvı basınç başlığının uygulanabileceği bir doku kültürü ekinde bir hyaluronan-kollajen I hidrojeldir. İstila ölçülebilir ve hücreler izole edilebilir veya parçalanabilir.

İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli

Yaralı omuriliklerde mikroglia (MG) ve periferik infiltre makrofajları (Mø) tanımlamak zordur. Bu protokolde, sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø'yu tanımlamak için akış sitometrisi (FCM) kullanıldı. Bu teknoloji, MG ve Mø'nun rolünü anlamak için diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarına da uygulanabilir.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Yaralı Omurilikteki Mikroglia ve Periferik İnfiltre Makrofajların Belirlenmesi

Burada, mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak iskemik inme sonrası immün hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimlerin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar ve diğer nörodejeneratif hastalıkları incelemek için uyarlanabilir ve inme patolojisindeki immün yanıtları anlamamızı geliştirir.

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Öğrenin glioma sızmış periferik kan mononükleer hücrelerinin akış sitometrik analizi yöntemini. Bu teknik, erken beyin tümörü mikroçevresindeki immün hücrelerin sayısını ve aktivasyon durumunu zamana bağlı olarak nicel olarak belirler.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Daha fazla video keşfet