Name: İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Öğrenin, dondurulmuş gastrointestinal dokulardan CD90+ miyofibroblast ve fibroblast izolasyon yöntemini. Bu protokol, doku onarımı ve fibrozis araştırmalarında fonksiyonel analizler için canlı hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) ve Texas Üniversitesi Tıp Şubesi Translasyonel Bilimler Enstitüsü ve Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülü (8UL1TR000071) tarafından desteklenmiştir.

Atılan insan cerrahi hastaların doku ve primer kültürlerinde kurulmasını elde etmek için protokol Texas Medical Branch ve New Mexico Kurumsal İnceleme Kurulları Üniversitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. İnsan doku örneklerinin alımı için genel şartlar aşağıda açıklanmıştır. MFS donmuş dokunun, biyobankalar ve ticari satıcılardan izole edilebilir çünkü bu da uygun bir seçenek olduğuna dikkat edin. 1. İnsan Dokusu edinin <ol><li> Onay için kurumsal inceleme kuruluna insan kolon dokusu elde etmek için bir protokol gönderin. </li><li> Araştırma için insan dokusu elde etmek amacıyla, genel cerrahlar ve / veya kolorektal cerrah ile işbirliği kurmak. Onlar tanı için gerekli değildir ve araştırma için belirlenmiş olabilir doku belirleyici olacak gibi patoloji bölümü ile işbirliği de zorunludur. </li><li> Grossl sonra neoplazma doku sağlamak ve patolog önerintümörden y, normal mukoza en az 5 cm. Hemen buz soğukluğunda yıkama ortamı örnekleri yerleştirin ve buz üzerine yerleştirin. Patolog güvenli araştırma için verilebilir doku miktarını belirleyecektir. MF izolasyonu için gerekli olan minimum doku 1,5 mm 2 &#39;dir. </li><li> Gelecekteki izolasyonu için -80 ° C &#39;de primer kültürler ya da dondurma ve yeri oluşturmak için elde edilen doku ya hemen kullanın. <ol><li> -80 ° C&#39;de dondurularak ortam (aşağıya bakınız), ve mağaza 1 ml kriyojenik bir tüp içine yerleştirin 2 mm 2 adet - daha sonra izole edilmesi için dondurma ise, yaklaşık 1 doku kesmek. Not: Bu protokol kullanarak, 4 yılı aşkın süredir donmuş dokudan MFS başarılı izolasyon gözlenmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Reaktifler hazırlayın <ol><li> Kollajenaz çözümü için: Ca2 + ile Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 100 U / ml kollajenaz I, II ve IV Hazırlama / Mg2 + (Malzeme bakınız Tablo </strong&gt;). DİKKAT: Kollajenaz aktif ünite konsantrasyon ve saflık olabilir mukozal hücre yüzeyinde epitop doku sindirim ve / veya korunması etkinliğini engelleyebilir satıcıdan satıcıya, değişir. Bu potansiyel tuzaklar önlemek için, saflık (≥95%) en yüksek derecesi ile kollajenaz kullanımı ve etkin birimler konsantrasyonuna dayalı stok solüsyon hazırlanır. </li><li> 10 mg / ml (3.55 UA / mg) Su bazlı DNase stok çözelti hazırlayın. </li><li> Yıkama ortamı hazırlayın: (MEM: 89 ml, antibiyotik antimikotik, 100x: 1 ml ısı ile inaktive edilmiş FCS: 10 mi) </li><li> MEM: Fibroblast büyüme ortamı hazırlayın 500 ml şişe; L-glutamin (200 mM): 5 mi; MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100x çözeltisi: 5 mi; siprofloksasin HCI (10 mg / ml): 570 ul; Antibiyotik antimikotik, 100x çözeltisi: 10 mi; sodyum piruvat (100 mM): 5 mi; ısı ile inaktive edilmiş FCS: 50 mi </li><li> Dondurulmuş ortamı hazırlayın: Fibroblast büyüme ortamı,% 10 ilave Dimetil Sülfoksit (DMSO) ile (reaktif 2.4), daha sonra filtre edilir-ster0.22 um filtre ile ilize. </li></ol> 3. enzimatik Digest İnsan Doku <ol><li> Doku ılık (~ 37 ° C) suda donma medya, yer cryovial donmuş ise doku ve medya çözülmüş kadar. </li><li> 4 için - doku 2 mm 2 adet 5, Ca2 + / Mg2 + olmaksızın iki kez HBSS 10 ml doku yıkayın. </li><li> Doku yerçekimi tarafından yerleşmiş sonra, dikkatlice numuneyi sıkma yapmadan süpernatant atın. </li><li> Örnek kolajenaz çözeltisi 10 ml ilave edilir ve steril bir DNase / RNase içermeyen bir tüp içine doku çözelti karışımı transferi yerleşik örnek ayrılması için rotorlar. Epitel hücrelerinin bazal yönünü çevreleyen ve mukozal lamina propria hücresel olmayan kısmını oluşturan hücre dışı matriks ayırmak için kollajenaz kullanın. </li><li> Sıkıca kapatın tüp ve dissociator (örneğin, gentleMACS) koluna üzerine baş aşağı ekleyin. Laboratuar t erişimi yoksaO, ekipman yukarıda değindiğimiz karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için her sindirim aşamasının süresini artırın. </li><li> Program h_tumor_01 çalıştırın önceden ayarlanmış profil makinesi (- vadede başına 268 mermi ile 4000 rpm, değişen aralıklı darbeleri ile 36 saniyelik toplam süresi, 1000 dan itibaren) ile birlikte. </li><li> Programın sona ermesinden sonra, dissociator tüp ayırın. </li><li> 140 rpm&#39;de çalkalayıcı üzerinde sürekli dönme altında 37 ° C &#39;de 45 dakika boyunca örnek inkübe edin. Not: doku örnekleri değişen miktarlarda için, sindirim zaman orantılı olarak azaltılabilir veya arttırılabilir (yani, doku daha fazla miktarlar ise ek süre gerektirebilir). </li><li> Dissociator koluna üzerine baş aşağı tüp takın. </li><li> (- Vadede başına 235 mermi ile, 4000 rpm 1000 arasında değişen aralıklı darbeleri ile, 37 sn toplam süresini) seçin ve Program h_tumor_02 çalıştırın. </li><li> Programın sona ermesinden sonra, dissociator tüp ayırın. </li><li> DNaz stok solüsyonu 50 ul ekleyin. / Ayırmak ölü hücreleri ve topaklanma hücre açan hücresel enkaz DNA kısmını kaldırmak için DNAz kullanın. </li><li> 60 rpm&#39;de çalkalayıcı üzerinde sürekli dönme altında 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> Yine dissociator koluna üzerine baş aşağı tüp takın. </li><li> (- Vadede başına 168 mermi ile, 4000 rpm 1000 arasında değişen aralıklı darbeleri ile, 37 sn toplam süresini) seçin ve Program h_tumor_03 çalıştırın. Not: doku tamamen sindirilmiş değilse, 20 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj hücre ayrışma çözeltisi 2 ml süpernatant, tekrar süspansiyon atmak ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Steril 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. </li><li> 20 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje hücre süspansiyonu. Aspire tamamen süpernatanlarına. </li><li> Yıkama hücresi Ca2 + / Mg2 + olmaksızın iki kez HBSS 25 ml pelet ve supernatant atın. </li><li> Son öncesinde olduh laboratuvarda mevcut otomatik hücre sayım sistemi kullanılarak ya da elle hemasitometre kullanarak hücre sayısını. MF primer kültür nesil için analiz için adım 3.19.1 sürmesine veya adım 3.19.2 sürmesine akım sitometri kullanılarak MFS sıralama. <ol><li> Izolasyon ve saf MF kültürünün büyüme (Şekil 1) için, ortam 3 ml 4 x 10 6 hücre kadar tohum için gerekli fibroblast izolasyon ortamının uygun miktarda Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon hücre topağından süpernatan atılır well başına 6 de, hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar. 3.20 adıma geçin. </li><li> Analizi için veya flow sitometri 24 fibroblast izolasyon medyanın 2 ml 2 x 10 6 yerleştirebilirsiniz iyi, düşük bağlama plakası ve% 5 CO 2 ile 37 ° C O / N inkübe kullanarak MFS sıralama. Bu enzimatik prosedür ile etkilenebilir hücre yüzey epitoplarını sağlamaktır. Sonra hücre süspansiyonu toplamak ve kurtarılan hücrelerin sayısı ve devamve immün analiz 8 akım sitometri. </li></ol></li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de hücreler büyütün. % 80 confluent MF tek tabaka ~ oluşumu (Şekil 1D-E) kadar 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. </li><li> Passage 6 plaka dan oranını 1 ile T25 matara hücreleri: 1 ve ~ 10 büyümeye -% 100 confluency - fibroblast büyüme medyada 14 gün 80 elde etmek. </li><li> 2: 1 oranında at T75 hücreleri T25 hücreleri Pasajlanması kültür genişletin. Hücreler konfluense ulaştıktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi 5 akış sitometresi ile kullanılarak izole edilmiş MF saflık analizi için bir şişesi kullanın. 3: 1 oranında MF kültürünün başka T75 balon dondurmak veya geçit. Not: EpCAM-, CD31, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +: flow sitometri ile incelendiğinde, mezenkimal kökenli GI mukoza stromal MF kültüründe büyüyen aşağıdaki fenotip olacak o zaman bekleniyor. </li></ol>

<ol><li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+Mediate+Extracellular+Matrix+Remodeling+and+Invasion+of+Scirrhous+Gastric+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells.</a> PLoS ONE. 9, e85485(2014).</li>
<li>Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Colonic+Myofibroblasts+Are+Resistant+to+Clostridium+difficile+Toxin+A-Induced%2C+but+Not+Toxin+B-Induced%2C+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death.</a> Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Cells+of+the+Intestinal+Lamina+Propria.+Annu+Rev+Physiol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol+%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol.</a> Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+prevent%2C+reduce+or+reverse+intestinal+fibrosis+in+IBD%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Rev+Med+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD?</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li>
<li>Roncoroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+fibroblasts+from+endoscopic+duodenal+biopsies+of+celiac+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients.</a> J Transl Med. 7 (40), (2009).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cells+Induce+Th17+during+Helicobacter+pylori+Infection+and+in+the+Gastric+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment.</a> PLoS ONE. 8, e53798(2013).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemoattractant+protein-1+production+by+intestinal+myofibroblasts+in+response+to+staphylococcal+enterotoxin+a%3A+relevance+to+staphylococcal+enterotoxigenic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease.</a> J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+carcinoma-associated+fibroblast-derived+proteins+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology.</a> J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).</li>
<li>Minonzio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+maintain+high+capability+to+grow+and+differentiate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate.</a> Cryobiology. 69, 211-216 (2014).</li>
<li>Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Myofibroblasts+from+Mouse+and+Human+Esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus.</a> J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).</li>
<li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro%2C+but+not+in+Vivo%2C+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines%3A+Possible+Role+of+an+%CE%B15%2F%CE%B21-Integrin-Fibronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li>
<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, potansiyel bir kanserli prognostik biyolojik ve terapötik bir hedef olarak stromal hücrelerin kritik önemi giderek artan ışığında, sadece araştırma uygulamaları için geliştirilen birlikte, daha sonra kullanılmak üzere &quot;işlevsel&quot; biospecimens dondurma kabiliyeti önemli bir avantaj sunmaktadır. Bu kişiselleştirilmiş tıp 10, 11 gelişimini ilerletmek için hizmet olarak ek araçlar hizmet edebilir, hangi klinik biorepository yaratılması için benzersiz bir avantaj oluşturmaktadır. Daha önce do...

Miyofibroblastlar / fibroblastlar (MFS), gastrointestinal (Gİ) mukoza hücrelerinin bol nüfusu temsil etmektedir. Bu stromal hücreler sadece epiteli altında bulunan ve bağırsaktaki mukozal lamina propria içinde birbirine bir ağ oluştururlar. MFS olmayan hücre dışı matrisin birikmesine sadece sorumludur, ancak parakrin düzenleme içinden geçen bitişik epitel 1, 2 elektrolit taşıma, iadesini ve bariyer işlevini etkileyebilir. Dahası, MFS enflamasyon ve doku önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 3, 4 biçimlenme. miyofibroblastlar onlar da kanserle ilişkili fibroblastlar olarak bilinir tümör mikro, kritik bir parçası olan ve tümör hücre büyümesine katkı ve kanser kök hücreleri 3 için niş olarak hizmet vermektedir. Ortaya çıkan veriler, MFS ayrıca yerel antijen sunan hücreler hizmet olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, MFS işlevi doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin önemli düzenleyiciler, süredensitokinler ve büyüme faktörleri 5 çeşitli dans ediyorum. Sağlıklı bireylerde, MFS hücreleri Bu hücreler aynı zamanda vimentin için pozitif. Mezenkimal kök hücrelerinden ayırt ve hücre yüzeyinde, mezenkimal marker, CD90 3, 5 tarihinde ifade inanılmaktadır, ancak epitelyal ve hematopoetik hücre belirteci, EpCAM ve CD45 negatif sırasıyla. Miyofibroblastların fibroblastlar aktive edilmiş bir şekli olması önerilmektedir ve α-SMA 5 ifadesi ile aktif olmayan fibroblastlardan ayırt edilebilir. Geçtiğimiz on yıl içinde, insan kolon mukozasının gelen miyofibroblastlar izolasyonu için birden yaklaşımlar yayınlanan-çoğunlukla başlangıçta Mahida ve ark., 5-8 açıklanan yönteme dayalı olarak oylandı. Bireysel çalışmalar, çeşitli bağırsak mukozasında, çoklu gastrointestinal alanlar (yani, mide, küçük ve l&#39;den MFS izolasyonu için hiçbir evrensel protokolü izolasyon prosedürleri rapor ederkenARGE intestinal mukoza) yayınlanmıştır. Bu tarifnamede sunulan protokol test edilmiş ve başarılı bir şekilde, yukarıda belirtilen dokuların her üç tip kullanılmaktadır. . Ayrıca, dondurulmuş GI mukozasından MF oranı pratisyen izole edilmesi için prosedürlerin rapor edilmemiştir. Burada, enzimatik sindirimi dayalı optimize edilmiş bir yöntem sunmak ve aynı zamanda kültür için insan bağırsak mukozal MFS izolasyonu sağlar ve taze sindirilmiş, tek hücre, mukozal hazırlıkları analiz akım sitometri. Bu teknik, güvenilir bir şekilde bir MF fenotipi olan primer kültürleri elde edilir. Bundan başka, aynı yöntemler yanı sıra, mide ve ince bağırsak dokularının dondurulmuş örneklerden MF oranı pratisyen izole etmek için kullanılabilir. Taze GI dokusundan rolü in izole edilmesi, daha önce tarif edilmiştir; Bununla birlikte, dondurulmuş örneklerin kullanımı birçok avantaj sunar. Yani, araştırmacılar capabi sahip dünya çapında işbirlikçileri herhangi bir sayıda toplamak ve depolamak dokuları mümkün olacaktırlity dondurulmuş doku örnekleri gemi. Ayrıca, araştırmacılar, mevcut deney programı ile çatışmaya izolasyon doku işleme ameliyathane ve / veya endoskopi paketi ve acil atılır doku toplama bulabilirsiniz. Ayrıca, cerrahi öngörülemeyen doğası nedeniyle, doku tedarik işleme doku için kalan süre sınırı, hangi çok geç gün oluşabilir. Daha sonra işlenmek için doku Donma bu zorlukları hafifleten. Son olarak, bu yöntemler, başarılı şekilde kolorektal karsinom ve iltihaplı bağırsak hastalıkları gibi hastalık durumlarında, kolon, mide ve ince bağırsak rolü in izolasyon kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Siprofloksasin HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol çözeltisi (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz&nbsp; Clostridium histolyticum, Tip I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz&nbsp; Clostridium histolyticum, Tip II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum'dan kollajenaz, Tip IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Accumax hücre ayrışma çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tüpleri</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci (70 & mikro; m)</td> <td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Klon RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Klon 1A4</td></tr><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Klon 5E10</td></tr></tbody></table>

İnsan frozen gastrointestinal örneklerden cd 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblastlar / miyofibroblastlar (MFS) patogenezinde rolleri ve tümör mikro hem yara iyileşmesi ve promosyon katkıları için artan ilgi kazanmaktadır. Şu anda mide-bağırsak (GI) dokulardan MFS izolasyonu için bir çok teknik vardır, ancak bu protokol, dondurulmuş dokudan bu stromal hücrelerin izolasyonu için yeni bir elemanı getirmektedir. GI doku örneklerinin Donma sadece dünya işbirlikçileri, biyobankalar ve ticari satıcılardan örnekleri elde etmek için araştırmacı, aynı zamanda taze örneklerin gecikmeli işleme izin verir. Açıklanan protokol sürekli belirteçleri CD90, α-SMA ve vimentin ifade MF fenotip ile karakteristik iğ şekilli hücreler verecektir. Bu hücreler, hasta örneklerinden türetilmiş olarak, pil kullanımı aynı zamanda hastalık durumlarında-, yani kanser ve enflamatuar barsak hastalıkları arasından yakın taklit MFS&#39;de yararı kazandırmaktadır. Bu teknik arı vardırn mide, ince bağırsak, kolon ve MF primer kültür nesil valide. Birincil MF kültürleri pasaj bir dizi üzerinden deney geniş bir dizi de kullanılabilir ve bunların saflığı hem immünositokimya değerlendirilmiş ve akış sitometri analizine.

Bu enzimatik sindirim protokolü kullanarak, sürekli izole ve GI cerrahi örneklerin ve biyopsi (Şekil 1) MF nüfus gut CD90 + mukozal stromal hücreler büyümeye mümkün olmuştur. 6 yuvalı plakalar (Şekil 1A-B) tek çekirdekli hücre süspansiyonları tohumlama sonra 5 - Görünür MF koloni proliferasyon günde 2 gözlenebilir. MF primer kültürlerinde ulaşmak ~ 50-11 (Şekil 1C-D) - 7. günde% 70 izdiham. <p class="jove_content" fo:keep-...

Burada, MF fenotipine sahip donmuş mide, ince bağırsak ve kolon dokusu oluşum hücrelerinden primer fibroblast/miyofibroblast (MF) kültürlerinin izole edilmesi ve oluşturulması için bir protokol sunulmaktadır. Bu hücreler CD90, α-SMA ve vimentin eksprese eder. MF'ler, enzimatik aktivite ve sitokin üretimi dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler için kullanılabilir.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Bu yöntemin genel amacı, orijinal olarak biyopsilerden veya cerrahi örneklerden elde edilen donmuş gastrointestinal doku örneklerinden canlı mukozal miyofibroblastları ve fibroblastları izole etmektir. Miyofibroblastların ve fibroblastların uygun şekilde donmuş gastrointestinal dokudan izole edilmesi, taze örneklerin işlenmesinin geciktirilmesine izin verir. Bu, dünya çapında farklı kaynaklardan alınan örneklerin kullanımını kolaylaştırır.Doku donmuş ortamda korunmuşsa, doku ve ortam çözülene kadar kriyoviali 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Dört ila beş iki milimetre kare doku parçası için, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 mililitre HBSS ekleyin, kapağı sıkıca kapatın ve tüpü bir kez hafifçe ters çevirerek dokuyu yıkayın. Doku yerçekimi ile yerleştikten sonra, süpernatanı dikkatlice atın ve dokuları tekrar yıkayın.Daha sonra, tüpe 10 mililit kollajenaz çözeltisi ekleyin ve doku süspansiyonunu yerleşik rotorlara sahip steril bir DNase / RNaz içermeyen tüpe aktarın. Rotor borusunu sıkıca kapatın ve bir ayırıcının manşonuna baş aşağı takın. Ardından, önceden ayarlanmış H-tümör sıfır bir programını çalıştırın.Programın sonunda, doku bulamacını bir çalkalayıcı üzerinde sürekli 140 RPM dönüşü altında, 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Ardından, tüpü ayrıştırıcıya geri koyun ve H-tümör sıfır iki programını çalıştırın. İkinci ayrışmadan sonra, çalkalayıcı üzerinde sürekli 60 RPM dönüşü altında, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca hücre çözeltisine 50 mikrolitre DNA stok çözeltisi ekleyin.İkinci inkübasyonun sonunda, H-tümör sıfır üç programını çalıştırın. Şimdi, süspansiyonu steril bir 70 mikron hücre süzgecinden geçirerek santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Süpernatanı atın ve hücre peletini kalsiyum ve magnezyum içermeyen 25 mililitre HBSS'de iki kez yıkayın, ilk yıkamadan sonra hücreleri sayın.Miyofibroblast birincil kültür üretimi için, peleti üç mililitre ortam başına 4 x 10 ila 6. hücrelerde yeniden süspanse edin ve bunları 6 kuyulu hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalara tohumlayın. Hücreleri 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte büyütün, ortamı yüzde 80'lik bir birleşik miyofibroblast tek tabakası oluşana kadar her iki ila üç günde bir değiştirin. Hücreler daha sonra T25 kültür şişelerinde geçişe hazır hale gelir.İzole edilmiş miyofibroblastları akış sitometrisi ile analiz etmek veya sıralamak için, 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte gece boyunca inkübasyon için 24 kuyu düşük bağlayıcı plakada, iki mililitre fibroblast izolasyon ortamı başına 2 x 10 ila 6. hücrelere kadar plaka. Bu enzimatik sindirim protokolü kullanılarak, miyofibroblastlar ve fibroblastlar CD-90 pozitif mukozal stromal hücre popülasyonlarına sahip olmuş, gastrointestinal cerrahi örneklerden ve biyopsilerden tutarlı bir şekilde izole edilebilir ve büyütülebilir. Cerrahi spesimenlerin dondurulmasından sonra mukozal tek hücre preparatının canlılığında hafif bir azalma olurken, bakteri ve mantar konsantrasyonunda eşlik eden bir azalmaya bağlı olarak miyofibroblast ve fibroblast kültürü üretiminin etkinliğinde bir artış olur.İki geçişten sonra, miyofibroblastlar ve fibroblastlar, hem konfokal mikroskopi hem de akış sitometrik analizi ile belirlendiği gibi, mezenkimal belirteç soy belirteci, Vimentin ve farklılaşmış mezenkimal hücrelerin bir belirteci olan düz kas aktini olan CD90 için pozitiftir. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa, bu teknik yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, dokunun tamamen enzimatik olarak sindirilmesi için gerekli zamanı tanımayı unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, akış sitometrisi, immünositokimya ve çeşitli fonksiyonel testler gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Miyofibroblastların ve fibroblastların bağırsak mukozal homeostazına ve ayrıca akut ve kronik inflamatuar gastrointestinal hastalık patolojisine katkısını belirlemek için kullanılabilirler. Bu videoyu izledikten sonra, donmuş gastrointestinal dokudan miyofibroblastları ve fibroblastları nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.Unutmayın, sabitlenmemiş insan dokusu patojenik mikroorganizmalar tarafından kontamine olabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken insan biyolojik numuneleri ile çalışırken evrensel önlemler her zaman alınmalıdır.

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Öğrenin, dondurulmuş gastrointestinal dokulardan CD90+ miyofibroblast ve fibroblast izolasyon yöntemini. Bu protokol, doku onarımı ve fibrozis araştırmalarında fonksiyonel analizler için canlı hücre elde edilmesini sağlar.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

Daha fazla video keşfet