Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Bu prosedürün genel amacı, ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör hücreleri iç kulak hücresi tiplerine ayırmaktır. Dolayısıyla bu yöntem, otik progenitörlerin nasıl koklear saç hücreleri veya işitsel nöronlar haline gelebileceği gibi işitsel rejenerasyondaki temel soruları ele almamıza yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, bu teknik, in vivo memeli hayvan model sistemlerine paralel olarak kullanılabilecek bir in vitro hücresel sistem sağlar.

Bugün prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Azadeh Jadali'nin yanı sıra laboratuvardaki iki yüksek lisans öğrencisi olan Zhichao Song ve Alejandra Laureano olacak. Kültür ortamını metin protokolünde tarif edildiği gibi hazırladıktan sonra, bu sıvının üç mililitresini 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına altıncı ölümsüzleştirilmiş multipotent progenitöre veya IMOP hücrelerine bir kez on kez plakalamak için kullanın. Hücreleri yüzde beş karbondioksit ile 37 santigrat derecede beş ila yedi gün inkübe edin.

Her gün, taze ortam ekleyerek kültürdeki sıvı hacmini iki katına çıkarın. Hücreleri geçirmek için önce onları kültür kabından 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ve sonra tüpü 37 santigrat derecede beş ila on dakika boyunca yerleştirin.

Bu süre zarfında, koloni oluşturan otosferlerin yerçekimi sedimantasyonu yoluyla koninin dibinde toplanmasını bekleyin. Ardından, paleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı aspire edin. 0,5 mililitre önceden hazırlanmış önceden ısıtılmış, bir milimolar EDTA ile zenginleştirilmiş dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ekleyerek ve ardından iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek otosferleri yeniden askıya alın.

Otosferlerin tek hücrelere ayrılmasını kolaylaştırmak için, konikliği 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Çözeltiyi periyodik olarak döndürün ve tüpün dibinde tortu olarak hiçbir otosfer gözlenmediğinde, oda sıcaklığına getirin. EDTA'yı nötralize etmek için hücrelere iki mililitre kültür ortamı eklemeye devam edin.

Ve onları oda sıcaklığında 200 g'da beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra seyreltilmiş EDTA çözeltisini aspire edin ve hücreleri beş mililitre 1x PBS'de yıkayın. Aynı ayarları kullanarak hücreleri döndürdükten sonra 1x PBS'yi aspire edin.

Daha sonra, konik üzerine 0,5 mililitre kültür ortamı ekleyin. Ve hücre paletini yeniden askıya alın. Saymak için, IMOP hücrelerini kültür ortamında bir ila yüz oranında seyreltin.

Daha sonra bu çözeltiden 75 mikrolitreyi bir mikroakışkan parçacık sayacına yerleştirilmiş bir kasete ekleyin ve hücre numarasını belirleyin. Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi 60 milimetrelik bir doku kültürü kabında on ila altıncı IMOP hücrelerini bir kez plakalayın ve bu geçiş prosedürünü her beş ila yedi günde bir tekrarlayın. Kaplamadan üç gün sonra, daha önce gösterildiği gibi otosferleri toplamak için yerçekimi sedimantasyonunu kullanın.

Süpernatanı aspire etmeye devam edin. Ve hücreleri iki mililitre duyusal epitelyal farklılaşma ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Ardından, otosferleri 60 milimetrelik yeni bir tabağa aktarmak için on mililitrelik geniş gözenekli bir pipet kullanın.

Otosferleri on gün boyunca ayırt edin. Kültüre her gün iki mililitre taze farklılaştırma ortamı eklemek. Daha sonra, otosferleri yerçekimi sedimantasyonu yoluyla tekrar hasat edin.

Ve harcanan ortamı aspire edin. Daha sonra, otosferleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1x PBS'de yüzde dört paraformaldehit içinde sabitleyin. Daha sonra formaldehit çözeltisini çıkarın ve hücreleri yüzde 0.1 Triton x100 içeren 1x PBS'de yıkayın.

Yüzde on keçi serumu ve yüzde 0.1 Triton x100 ile desteklenmiş 1x PBS'de otosferleri bloke ederek devam edin. Bir saat sonra, bloke edici tamponu, Cdkn1b veya CDH1 antikorunun uygun seyreltmesini içeren tamponla değiştirin. Daha sonra hücreleri birincil antikorda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ve ertesi gün, başka bir yerde tarif edildiği gibi floresan etiketli ikincil antikorlar, Phalloidin ve Hoechst kullanarak immün boyamaya devam edin. Görüntülemeye hazırlanmak için montaj ortamını bir cam slayt üzerine yerleştirin. Ve sonra lekeli otosferleri ortama sokun.

Ardından, numunenin üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Montaj ortamının gece boyunca dört santigrat derecede kurumasına izin verdikten sonra, slaytı 16 bit CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. 20x 0.75 hava objektifini kullanarak mavi, yeşil, kırmızı ve kızılötesi kanallardan veri toplayarak epifloresan görüntüler elde edin.

İlk olarak, yuvarlak cam kapak kızaklarını steril 100 milimetrelik bir plakaya yerleştirerek ve yüzde 70 etanole batırarak temizleyin. Örtüldüklerinden emin olmak için kapak fişlerini hafifçe çalkalayın ve tabağı on dakika oda sıcaklığında bırakın. Ardından, kapak fişlerini steril 1x PBS'de üç kez ve ardından steril su ile bir kez durulayın.

Daha sonra kapak kaymalarını 15 dakika boyunca bir doku kültürü başlığında UV ışığına maruz bırakarak kurumaya bırakın. Hemen kullanım için, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir steril kapak fişi yerleştirin. Ve tüm kapak kızaklarının düz durduğundan emin olmak için plakayı hafifçe sallayın.

Daha sonra, her bir oyuğa mililitre poli D lizin başına 10 mikrogam içeren 0.25 mililitre 1x PBS ekleyerek kapak fişlerini kaplayın. Plaka 37 santigrat derecede bir saat inkübe edildikten sonra, poli D lizin çözeltisini çıkarın ve kuyuları steril 1x PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan gelen sıvı aspire edildikten sonra, 24 kuyucuğun her birine mililitre Laminin başına 10 mikrogram içeren 0.25 mililitre 1x PBS ekleyin.

Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, Laminin çözeltisini aspire edin, daha sonra her bir kuyucuğu üç kez bir mililitre 1x PBS ile yıkayın, ancak hücreler kaplanmaya hazır olana kadar PBS'yi kuyucuklardaki son yıkamadan bırakın. Nöronal farklılaşmaya başlamak için, daha önce tarif edildiği gibi ayrışmış otosferlerden hücreleri sayın. Ve sonra onları önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.

Kaplanmış örtü fişlerini içeren plakanın her bir oyuğuna bir ile bir nokta arasında, beş çarpı on ila beşinci IMOP hücrelerini tohumlayarak devam edin. Plakayı yüzde beş karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Nöronal farklılaşma ortamını her gün değiştirmek.

Yedi gün sonra, ortamı aspire edin ve her bir oyuğa yüzde dört formaldehit ekleyerek kapak fişlerine takılması gereken hücreleri sabitleyin. Ve onları oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Daha sonra formaldehiti çıkarın ve hücreleri yüzde 0.1 Triton x100 içeren 1x PBS'de bir kez yıkayın.

Ardından, yıkama tamponunu çıkarın. Ve her bir oyuğa yüzde on normal keçi serumu ve yüzde 0.1 Triton x100 içeren 1x PBS'den oluşan bloke edici tampon ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat bekletin.

Daha sonra sıvıyı çıkarın ve uygun Cdkn1b veya Tubb3 antikorunun seyreltilmesini içeren bloke edici tampon ile değiştirin. Dört santigrat derecede bir gece inkübasyonun ardından, hücreleri bir kez yüzde Triton x100 içeren 1x PBS ile yıkayın. Ve sonra daha önce açıklandığı gibi immün boyama ile devam edin.

Boyama tamamlandıktan sonra, kuyucuklara 1x PBS ekleyerek son bir yıkama yapın. Bunları analize hazırlamak için, lekeli hücrelerin tutturulduğu kapak fişlerini 24 oyuklu plakadan çıkarın. Ve bunları bir cam slayt üzerindeki montaj ortamına yerleştirin.

Montaj ortamının gece boyunca dört santigrat derecede kurumasına izin verdikten sonra, daha önce açıklandığı gibi epifloresan görüntüleri elde edin. Epitelyal farklılaşma ortamında on gün boyunca kültürlenen otosferler, farklılaşmamış hücrelere kıyasla artmış Cdkn1b ekspresyonu, döngüye bağlı bir kinaz inhibitörü ve iç kulak farklılaşması için belirteç gösterir. Burada Hoechst boyaması hücre çekirdeklerini not etti.

Bu hücreler ayrıca aktin filamentlerinde ve epitelin karakteristik hücre-hücre yapışma bölgelerinde morfolojik değişiklikler sergiler. Hücre periferilerinde Phalloidin ve Cdh1 etiketlemesinin görünümü ile gösterilir. Otosferler ayrıca nöronlar oluşturmak için yönlendirilebilir.

Bu parlak alan görüntüsü, nöronal farklılaşma ortamında yedi gün geçirdikten sonra, IMOP hücrelerinin nöritler sergilediğini göstermektedir. Bu hücrelerin bir nöronal belirteç Tubb3 ile immün boyanması, farklılaşmalarını doğrular. Ve ayrıca Cdkn1b'yi sağlam bir şekilde ifade ederler.

Bu, çift Tubb3, Cdkn1b sinyalinin IMOP hücrelerinde nöronal farklılaşmanın bir göstergesi olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Cdkn1b floresan diferansiyel ve diferansiyel olmayan hücreler de Hoechst sinyaline oranı belirlenerek normalize edildi ve kantitatif sonuçlar elde edildi. Bu verilerin histogramları burada gösterilmektedir.

Normalleştirilmiş Cdkn1b'nin önceden belirlenmiş bir eşiğinin üzerindeki farklılaşmamış ve farklılaşmış IMOP hücrelerinin yüzdeleri bu grafiklerde sunulmaktadır. Her iki farklılaşmış popülasyon, farklılaşmamış kontrollere kıyasla Cdkn1b'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesinde önemli bir artış gösterir ve bu da immünofloresan tarafından önerilen farklılaşmayı doğrular. Bir kez ustalaştıktan sonra, IMOP hücrelerinin rutin kültürü ve farklılaşması, uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, IMOP hücrelerinin farklılaşmasını nasıl başlatacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz. Ve deneylerinizde iyi şanslar.