Name: Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin böcekleri protein işaretleyerek dağılma ve göç araştırmaları için nasıl izleneceğini. ELISA yöntemiyle işaretleri tespit edin ve doğal ortamlarda davranışları inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Harçlar Tarım ve Gıda Araştırmaları Girişimi Rekabetçi Grant hayır, kısmen, USDA CRIS 5347-22620-021-00D tarafından sağlandı ve. Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü 2011-67009-30141. Biz Johanna Nassif teknik destek için müteşekkiriz. Biz de Şekil 3&#39;te kullanılan resimlerin bazılarını sağlamak için Paul Baker, David Horton, Diego Nieto ve Frances Sivakoff teşekkür ederiz.

1. İç Mark, Tutma ve Algılama Prosedürü <ol><li> İç işaretleme prosedürü <ol><li> Yapay diyet veya alanından yetiştirilen bir laboratuvar kolonisinden (n 100 bireyleri ≈) ilgi böcekleri toplamak ve iki temiz yetiştirme kapları bölün. </li><li> Kapların birine düzenli bir 20 ml&#39;lik diyet paketi (işaretsiz negatif kontrol tedavisi) yerleştirin. , 1.0 mg / ml tavuk IgG / IgY çözeltisi 1.0 ml ile ikinci 20 mi yapay bir diyet paket Supplement iyice karıştırın ve başka bir kap içine koyun. Not: ilgi böcek yapay diyet yoksa işaretleyiniz veya normalde (örn, yeşil fasulye, güve yumurtaları, su, şeker, bal) üzerine sürekli ne olursa olsun diyet yerleştirilebilir. </li><li> Böcekler 24 saat onların beslenme etkinliğini sürdürmek için izin verin. </li></ol></li><li> İç işareti tutma işlemi <ol><li> Her kaptan diyet paketlerini çıkarın ve w böcekler kaynağıBaşka bir besin kaynağı i deney (örneğin, yeşil fasulye) süresi boyunca onları sürdürmek. </li><li> Günlük olarak (veya arzu edilen herhangi bir zaman aralığı) her tedavi için bir böcek kohort (n = 20) toplamak ve -20 ° C &#39;de hemen dondurma. </li></ol></li><li> Sandviç ELISA prosedürü <ol><li> 1 seyreltilmiş tavşan anti-tavşan IgY birincil antikor 50 ul ekle Tris 500 temiz bir ELISA mikrolevhamn her çukuruna tuz (TBS) tampon ve RT (not 1 saat en az inkübe: mikro de inkübe edilebilir, O / N), 4 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Plaka antikorun atın ve 30 dakika boyunca% 1.0 yağsız kuru süt çözeltisi 300 ul her bir blok. </li><li> Önceki İnkübasyon beklerken, TBS 1,0 ml ile ayrı ayrı 1,6 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde dondurulmuş böcek yerleştirin. </li><li> İyice homojenize edilene kadar temiz bir havan tokmağı ile her bir böcek öğütün ve ELISA iyi bir birey için her numunenin 100 ulplaka. Numuneler 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe olmasına izin verin. </li><li> Her ELISA plakasının ilk sütunda kuyulara 100 (TBS yumurta akı) negatif (TBS sadece) ve pozitif ul kontrolleri ekleyin. Ayrıca, her bir plakanın (Şekil 1) son sütununda 8 kuyu olumsuz böcek denetimleri (işaretsiz böcekler) 100 ul ekleyin. Kontrol numuneleri, 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe olmasına izin verin. Şekil 1&#39;de verilen şablon bizim standartlaşmış deneyleri için kullanmak şablon olduğunu unutmayın. Kuyularda örneklerin yerleştirme araştırmacı takdirine kalmıştır. </li><li> Her bir oyuk, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez -tween yıkayın ve daha sonra tavşan anti-tavşan IgG / IgY yaban turpu peroksidaz ile konjuge 1 seyreltilmiş 50 ul: 10.000,% 1 süt çözeltisi ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> PBS-Tween ile, her oyuğa üç kez yıkayın ve her bir tetrametilbenzidin (TMB) substrat 50 ul ekle. </li><li> 10 dakika sonra, kuyunun okunması650 nm dalga boyuna ayarlanmış bir mikroplaka spektrofotometre ile. </li></ol></li></ol><img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Şekil 1., tipik bir 96 için kullanılan standart bir sıra belirtme gösteren bir şematik diyagramdır ELISA mikrotablaya ilave edilmiştir. Her bir plaka, bir pozitif protein kontrolü (Pos Ctrl) bir de, özel Tris-tamponlu tuzlu su, negatif kontroller için adanmış 7 kuyu (TBS) içerir, işaretsiz (negatif) böcek kontrolleri adanmış recaptured böcekler (Numune 1 ... 80) ve 8 kuyu adanmış 80 ayrı kuyu (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Dış Mark, Tutma ve Algılama Prosedürü <ol><li> Dış işaretleme işlemi <ol><li> Çevrede böcekleri toplayın (n 100 ≈2.5 cm çaplı bir deliği olan bir laboratuvar kolonisinden veya iki 1,0 litrelik plastik kaplara alan ve yerden birey) her bir kabın yan kesilerek. </li><li> Tıbbi bir nebulizer kullanılarak dH 2 O (negatif kontrol tedavisi) 1,0 ml ilk kap içinde böceklerin püskürtün. Tıbbi bir nebulizer kullanılarak tavuk yumurtası akı bir% 5.0 çözeltisinin 1.0 ml&#39;si ile ikinci kabın böcekleri püskürtün. </li><li> Standart bir laboratuvar hava çıkışına nebulizatör hortumu takın ve daha sonra kabın 2.5 cm deliğine nebulizatör ağzını yerleştirin. Nebulizatör bir buhar üretir kadar Sonra yavaş yavaş hava çıkışına açın. </li><li> Yumurta akı çözeltisi (yakl. 2-5 dakika) dağıtılan kadar (işaretleme) püskürtme devam edin. </li><li> Nebulizatörü çıkarın ve plastik kabın deliğe bir mantar yerleştirin. Çözelti tamamen kuruyana kadar böcekler oda sıcaklığında bekletin. </li></ol></li><li> Dış işareti tutma işlemi<ol><li> Işareti daha maruz kalmaktan kaçınmak için ayrı bir temiz yetiştirme kabına kuru böceklerin her tedavisini yerleştirin. </li><li> Çalışmanın süresi boyunca böcekler sürdürmek için temiz kaplarda yiyecek ve su ekleyin. </li><li> Günlük olarak her tedavi için bir böcek kohort (n = 20) toplamak ve -20 ° C &#39;de hemen dondurma. </li></ol></li><li> Dolaylı ELISA prosedürü <ol><li> Bireysel 1.6 ml mikrosantrifüj tüpler içine donmuş böcekler yerleştirin ve TBS 1.0 ml ekleyin. </li><li> 120 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı sette 1 saat için numune bekletin. </li><li> Aşama 1.3.5 tarif edildiği gibi pozitif ve negatif kontroller ekleyin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi nemlendirici sonra, yeni bir 96 oyuklu ELISA levhası üzerine 80 belirlenen örnek kuyu birine her bir örnek bir 100 ul tablet pipetle numune oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona izin verin. (Not: mikro da olabilir kuluçkalanmıştır O / N 4 ° C&#39;de). </li><li> Ile wells üç kez yıkayınPBS-Tween ile yıkandı ve daha sonra% 1 de her sığır serum albümini (PBS-BSA) içeren fosfat tamponlu tuzlu su içinde 300 ul ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, PBS-Tween ile iki kez yıkanır. </li><li> Her bir oyuğa, PBS-BSA-Silwet (% 0.05) &#39;de 8.000 ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir: 1 seyreltilmiş tavşan anti-yumurta albümininin birincil antikor 50 ul ekle. </li><li> PBS-Tween ile, her oyuğa üç kez yıkayın ve daha sonra 1 seyreltilmiş bayır turbu peroksidazı ile konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG&#39;si 50 ul: oda sıcaklığında 1 saat için PBS-BSA-Silwet (% 0.05) &#39;de 2000. </li><li> PBS-Tween ile, her oyuğa üç kez yıkayın ve her bir TMB substratı 50 ul ekle. </li><li> 10 dakika sonra, 650 nm dalga boyuna ayarlanmış bir mikroplaka spektrofotometre ile kuyu okuyun. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Fro toplanmış negatif kontroller dayanarak standart sapmayı her ELISA plaka üzerinde 8 negatif kontrol böceklerin ortalama absorbans değerini hesaplayın ve daha sonra hesaplamasım, belirli bir çalışma 12 ELISA plakalar her. </li><li> ELISA pozitif eşik değerini elde etmek için her ELISA plakası için elde edilen ortalama altı kat toplanmış standart sapmayı ekleyin. Bu değere eşit ya da daha büyük bir absorbans değeri elde herhangi bir böcek Numune, protein işareti varlığı için pozitif olduğu kabul edilir. </li></ol>

Bu yayındaki ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon belirli bilgi vermek amacıyla sadece ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından öneri veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.

Eklembacaklı protein immunomarking prosedürü ilk yüzyıl önce 9 neredeyse dörtte tanımlanmıştır. O zamandan beri, prosedür hem dahili ve harici uygulanan IgG / IgYs kullanarak eklembacaklıların geniş bir yelpazede dağılma modellerini incelemek için adapte edilmiştir. Bu proteinler şu ana kadar test edilen böcek türlerinin çok çeşitli kararlı işaretleri kanıtlamıştır. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, IgG / IgYs kullanmak için önemli bir sınırlama çok pahalı olmasıdır. Sonuç olarak, IgG / IgYs İİH ve böceklerin...

Doğada Eklembacaklı zararlıların doğal düşmanları (parazitoit ve predatör) ve tozlayıcı hareketini izleme ekosistem hizmetlerini geliştirmek için nasıl daha iyi anlaşılması için gereklidir. Dispersal araştırma türlerinin çoğu için temel bileşeni ilgi eklembacaklıların (ler) etiketlemek için güvenilir bir yöntem yaşıyor. Malzemelerin çeşitli (örneğin, boyalar, boya, renkli tozlar, etiketler, nadir elementler, proteinler) davranışları ve diğer ekolojik etkileşimleri 1,2 beslenme, nüfus dinamikleri, dağılma yeteneklerini değerlendirmek için eklembacaklılar işaretlemek için kullanılmıştır. Herhangi bir dağıtma araştırma için kullanılan bir marker uygunluğu çalışma tipi yürütülen bağlı olacaktır. (1) mark-release-tekrar yakalama (MRR), (2) mark-yakalama ve (3) kendi kendine mark yakalama: eklembacaklılar markalama üç geniş kategorizasyonlar vardır. Mark-release-tekrar yakalama araştırma için, araştırmacı tipik Laborato kolektif eklembacaklılar işaretlerry ve bu alanda merkezi bir noktada serbest bırakır. Eklembacaklılar daha sonra farklı toplama cihazları (örneğin, süpürme, net, vakum, yapışkan tuzak) 3,4,5 kullanarak çeşitli mekansal ve zamansal aralıklarla yeniden ele alınır. Belirli işareti yerli bireylerden serbest ayırt etmek için recaptured numuneler daha sonra incelenir. Mark-yakalama araştırma için, araştırmacı genellikle alanını kullanarak sprey ekipmanı (örneğin, sırt çantası püskürtücü, bom ve meme püskürtücü) doğrudan işareti uygular. Mark-yakalama araştırma için en iyi belirteçler ucuz ve kolay artropodun yaşam uygulanır vardır. Öz-mark-yakalama araştırma için, araştırmacı genellikle eklembacaklı yem 6,7 veya yuva girişine 8 işaretleri uygular. Buna karşılık, eklembacaklıların o yuvayı çıkarken yukarı işareti karşı &quot;fırçalama&quot; tarafından dışarıdan belirgin yem veya yiyor tarafından içten kendini gösteriyor. Yukarıda zikredildiği gibi, belirteçler, çok çeşitli bize olmuştured Artropod türlerinin çeşitli etiketlemek için. Ancak, çok az bu dağılımı araştırma kategorilerinin her üçü için yararlıdır. Protein immunomarking prosedürünün geliştirilmesi böcekleri işaretlenmesi için büyük bir atılım oldu. Immunomarking artropodları bir protein etiket koyar dahili veya harici olan da, bir anti-protein belirli bir enzim bağlantılı immunosorbent tahlil (ELISA) ile saptanır. Kullanılan bu tür ilk protein belirteçlerinin tavşan immunoglobulin (IgG) ve tavuk IgG / IgY 9,10 idi. Onlar MRR ve kendini mark-yakalama araştırma (tartışma) için çok etkili işaretler olduğunu kanıtladı. Ne yazık ki, IgG / IgY proteinleri pahalı ve bu nedenle mark-yakalama araştırma ve kendini mark-yakalama araştırma türlerinin çoğu için pratik değildir. Daha sonra, ikinci nesil protein algılama ELISA&#39;lar tavuk yumurta akı (albümin), inek sütü (kazein) ve soya sütü (tripsin inhibitörü protein) içerdiği proteinler için geliştirilmiştir. Her bir deney, yüksek ölçüde duyarlı, spesifik, ve en çokDaha da önemlisi, daha az pahalı IgG / IgY proteinleri 11 daha olan proteinleri kullanılır. Bu proteinler MRR, mark-yakalama ve kendini mark-yakalama araştırma (tartışma) için etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu yazıda tarif ve protein işareti laboratuvar tutma çalışmaları yapmak nasıl gösterilmektedir. Bu tür çalışmalar saha dağılımı çalışmasında herhangi bir türü için gerekli olan araştırmanın ilk aşaması vardır. Araştırmacılar işareti öncesinde saha dağılma çalışmalarına başlamadan hedeflenen eklembacaklı türler üzerinde muhafaza edilecektir ne kadar biliyoruz Özellikle, kritik öneme sahiptir. Burada, tarif ve dahili ve harici MRR için böcekler, mark-yakalama ve kendini mark-yakalama tipi saha çalışmaları işaretlemek için nasıl gösterilmektedir. Biz o zaman dolaylı ve sandviç ELISA ile işaretleri varlığını tespit etmek için nasıl gösterilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Gıda saklama kabı (böcek yetiştirme için)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Çeşitli boyutlar</td><td>Çeşitli üreticiler ve satıcılar. Örgü kumaş bir pencereye yapıştırılır</td></tr><tr><td>Küçük hacimli nebulizatör (Mikro Sis)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Çevrimiçi olarak ve tıbbi malzeme mağazalarında mevcuttur. Diğer markalar da işe yarayacak.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, kapaklı 1,6 ml</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Benzer herhangi bir tür işe yarayacaktır. Kapakları kolay açılabilen markaları tercih ediyoruz.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri için strafor saklama kutusu (5x20 ızgara)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>Bu tasarım güzel çünkü tüpleri kalabalıklaştırmıyor.</td></tr><tr><td>Dağıtıcı, tekrarlayıcı</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Benzer herhangi bir şey, dağıtımı hızlandırmaya yardımcı olacaktır.</td></tr><tr><td>Havaneli, plastik tek kullanımlık kağıt mendil öğütücüler, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Çeşitli satıcılarda mevcuttur. Havaneli temizlenebilir ve yeniden kullanım için otoklavlanabilir.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plakaları, 96 kuyulu (düz tabanlı)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipeti, manuel (20-200 ve mikro; l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 veya 1070-0200</td><td>Benzer herhangi bir tip çalışacaktır. Bu model ergonomiktir.</td></tr><tr><td>Rezervuarlar, steril reaktif</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Benzer bir şey işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Elektronik pipet, 8 kanallı (50-1.200 & mikro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>Eğer bir elektronik model seçmek zorunda kalsaydınız, bu boyut en kullanışlı olanıdır.</td></tr><tr><td>Elektronik pipet, 8 kanallı (10-300 & mikro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Benzer herhangi bir şey işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Manifold, çok kuyulu plaka yıkayıcı (8 konumlu, düz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>Benzer herhangi bir şey manuel plaka yıkama için işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Absorbans algılamalı mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax 250</td><td>Benzer her şey işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Tavuk IgG/IgY</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik</td><td>I1903-15R</td><td>Diğer kaynaklardan da temin edilebilir</td></tr><tr><td>: Yumurta akı,</td><td>Bakkal</td><td>" Tüm Beyazlar", " Yumurta Çırpıcılar", etc.</td><td>% 5 çözelti için 95 ml dH2O ile karıştırın</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td> TBS yapmak için <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g / L</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g / L TBS yapmak için ve 8.0&nbsp; g&#8288;/&#8288; PBS için L</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td> için <td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO 4)</td> için <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0,2 g / L PBS</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> için <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0,2 g / L PBS</td></tr><tr><td>Tween 20 için, ÇED sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Tuzlar çözüldükten sonra PBS'ye L başına 0,5 ml ekleyin.</td></tr><tr><td>%1 BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Karışımı 1 L içinde 1 paket dH2O</td></tr><tr><td>Anti-Tavuk IgY (IgG) (tam molekül) antikoru tavşanda üretilen antikor (1:500)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 & l 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Kuru Süt, Toz veya Taze Süt (%1)</td><td>Bakkal</td><td></td><td>%1 çözelti için 10 g 1 L dH2O ile</td></tr> karıştırın <tr><td>Anti-Tavuk IgY (IgG) (tam molekül)-Tavşanda üretilen Peroksidaz antikoru (1:10.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &mikro; l% 1 sütte l% 1</td></tr><tr><td>tavşanda üretilen Anti-Tavuk Yumurtası Albümin antikoru (1: 8.000)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Seyreltik 125 & mikro; l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG Peroksidaz Konjugatı (1: 2.000)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>1 L PBS-BSA'da 0.5 ml seyreltin, ardından 1.3 & nbsp ekleyin; ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silikon-polieter kopolimer</td><td>Lehle Tohumları</td><td>VIS-01</td><td>Son bileşen olarak ekle</td></tr><tr><td>TMB Microwell Tek Bileşenli Peroksidaz Substrat</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

yönetme ve dağılma araştırma arthropodlara protein marks algılama

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

İzleme eklembacaklı hareketi genellikle daha iyi ilişkili popülasyon dinamikleri, dağılma şekilleri, konukçu bitki tercihleri ​​ve diğer ekolojik etkileşimleri anlamak için gereklidir. Eklembacaklılar genellikle benzersiz bir işareti ile etiketleyerek doğada izlenir ve daha sonra yeniden toplayarak onların dağılma yeteneklerini belirlemek için zaman ve mekan onları edilir. Bu tür renkli toz veya boya gibi gerçek fiziksel etiketler, ilave olarak, proteinler çeşitli ekolojik araştırmaları için eklembacaklıları işaretlenmesi için oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır. Proteinler dahili ve / veya harici olarak tatbik edilebilir. Bu proteinler daha sonra bir proteine ​​özgü enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yeniden ele artropodları tespit edilebilir. Burada harici ve dahili protein ile eklembacaklılar etiketleme için protokolleri açıklar. İki basit deney örnekleri gösterilmiştir: haricen bir protein açısından zengin bir diyet ve (2) bir dış proteini işareti sağlayarak bir böcek kişiye (1), bir iç bir protein işaretiTıbbi nebulizer kullanarak bir böceğe pplied. Daha sonra sandviç ve böcekler üzerinde protein işaretleri algılamak için kullanılan dolaylı ELISA yöntemlerinin bir adım-adım rehber ilgilidir. Bu gösteri, mark-release-alınışında, mark-yakalama ve araştırma öz-mark-yakalama türleri için eklembacaklılar üzerinde edinimi ve protein belirteçlerinin tespiti çeşitli yönleri immunomarking yöntem olmuştur çeşitli yollarla birlikte, tartışılır Araştırma hedeflerinin geniş bir yelpazede uyacak şekilde adapte.

İç işaretleme: İç işareti tutma testi sonuçları Şekil 2A&#39;da gösterilmektedir. Hesaplanan ELISA kritik eşik değeri 0,054 idi. Genel (dört örnek tarihleri ​​kombine), protein olmadan tedavi böcekler sürekli düşük ELISA değerleri (X = 0.038 ± 0.002, n = 80) vermiştir. Tersine, böceklerin tüm protein zenginleştirilmiş diyet sürekli güçlü ELISA değerleri (X = 0,475 ± 0,221, n ...

Proteinler genellikle dağılım araştırmaları için eklembacaklıları işaretlemek için kullanılır. Eklembacaklılarda iç ve dış protein işaretlerinin uygulanması için yöntemler gösterilmiştir. Dolaylı veya sandviç enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA'lar) yoluyla protein işareti tespit teknikleri de gösterilmiştir.

Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Bu gösterinin genel amacı, dağılma veya göç araştırması için böceklerin protein ile nasıl işaretleneceğini açıklamaktır. Bu gösterime, bir sandviç veya dolaylı bir enzime bağlı immünosorbent testi ile işaretlerin nasıl tespit edileceğine ilişkin yöntemler dahildir. Bu yöntem, böcek dağılım araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Böcek göç modellerini, böcek konakçı bitki tercihlerini ve istilacı türlerin yayılmasını incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajları, tespit yönteminin basit ve ucuz olmasıdır. Yüksek verim için uygundur ve hayvanlar doğrudan doğal ortamlarında kolayca işaretlenebilir.Genellikle bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü olduğundan daha zor görünmektedir, çünkü çoğu alan araştırmacısı bu basit teknikle ilgili deneyime sahip değildir. Bu yöntem fikri ilk olarak 1989'da aklıma geldi. Yapay bir diyetle iri gözlü böcek avcıları yetiştiriyorduk.Bu böceklerin, doğal olmayan bir diyetle uzun süre esaret altında yetiştirildikten sonra bir Lygus böcek zararlısı üzerinde etkili avcılar olmayacağından endişe duyduk. Başka bir deyişle, evcilleştirileceklerdi. Onları sahaya sürüldükten sonra yerli muadillerinden ayırt etmek için güvenli, etkili ve ucuz bir yönteme ihtiyacımız vardı.Mevcut işaretleme yöntemlerinin hiçbiri bu kriterlere uymuyor. Lygus'a özgü protein kalıntıları için yırtıcı bağırsak içeriği analizleri yapmak için ELISA prosedürünü kullanarak yaşadığım önceki bir deneyim, bana laboratuvarda yetiştirilen yırtıcıya yabancı bir protein işareti uygulama fikrini verdi. Buna karşılık, Lygus kalıntıları ve yabancı protein kalıntıları için toplanan büyük gözlü böcekleri analiz edebildik.Başlamak için, bir laboratuvar kolonisinden veya tarladan yaklaşık 100 ilgi çekici böcek toplayın ve bunları iki temiz yetiştirme kabına bölün. Negatif kontrol görevi görmesi için bir kabı normal 20 mililitrelik bir diyet paketi ile doldurun. Diğeri için, bir miligram tavuk IgG-IgY içeren bir diyet paketi bağlayın.Bir mililitre çözelti ekleyin ve iyice karıştırın. Gerekirse, paketin yerine böceklerin normalde beslendiği her şeyi kullanın. Bu diyet paketlerinde yetiştirildikten 24 saat sonra, her iki böcek grubuna da normal işaretsiz yiyecekler verin.İstenilen zaman aralıklarında, her kohorttan 20 ayrı böcek toplayın. Deney için gerekli tüm kohortlar toplanana kadar eksi 20 santigrat derecede dondurun. ELISA için 96 oyuklu bir plaka hazırlamak için, her bir oyuğa Tris-Tamponlu Salin veya TBS içinde 500'de bir oranında seyreltilmiş 50 mikrolitre tavşan anti-tavuk IgY primer antikoru ekleyin.Yüklenen plakayı oda sıcaklığında en az bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kuyuları boşaltın ve her kuyucuğa 300 mikrolitre blok çözeltisi ekleyin. Bu, yüzde bir yağsız kuru süt çözeltisidir.Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Blok inkübasyon sırasında, tek tek donmuş böcekleri bir mililitre TBS ile yüklü mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ardından, her böceği temiz bir havaneli ile iyice homojenize edin.Plaka hazır olduğunda, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre homojenize böcek numunesi yükleyin. Her 96 kuyulu plaka 80 numune barındırır. Kontroller için plakanın ilk ve son sütununu boş bırakın.İlk sütunda, tek başına yedi adet 100 mikrolitre TBS alikotu yükleyin ve yumurta akı pozitif kontrollü 100 mikrolitre TBS ile bir kuyu yükleyin. Son sütunda, 100 mikrolitre sekiz ayrı işaretsiz böcek preparatı yükleyin. Numunelerin oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edilmesine izin verin.İnkübasyondan sonra, kuyucukları Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Arası veya PBS-Tween ile üç kez dikkatlice yıkayın. Deneyimlerimiz sayesinde, çoğu hatanın yıkama adımları sırasında meydana geldiğini öğrendik. Sıçrama, yanlış pozitif reaksiyonların yüksek oranda oluşmasına neden olabilir, bu nedenle dikkatli olun.Yıkamalardan sonra, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş 50 mikrolitre tavşan anti-tavuk IgG-IgY ekleyin ve yüzde bir süt çözeltisinde bir ila 10.000 oranında seyreltin. Çözeltinin oda sıcaklığında en az bir saat boyunca kuyucuklarda inkübe edilmesine izin verin. Daha sonra, plakayı daha önce olduğu gibi PBS-Tween ile üç kez yıkayın.Ardından, kuyucukları 50 mikrolitre TMB substratı ile yükleyin. Hemen bir renk değişikliği görmeye başlayabilirsiniz. Plakayı bir mikroplaka spektrofotometresi ile okumadan önce 10 dakika inkübe edin.Plakayı 650 nanometrede okuyun ve değerleri kaydedin. Böcekleri dışarıdan işaretlemek için, erişim delikleri olan bir litrelik plastik şişeler hazırlayın ve 100 böceği iki şişeye bölün. Daha sonra, böcekleri bir kaba bir mililitre damıtılmış su ile püskürtün, bu da negatif kontrol görevi görür.Ardından, bir hava çıkışına tıbbi bir nebulizatör takın ve hava akışını, nebulizatör buhar üretecek şekilde ayarlayın. Diğer böceklere bir mililitre yüzde beş tavuk yumurtası akı çözeltisi püskürtün. Püskürtme işleminin tamamlanması iki ila beş dakika sürmelidir.Daha sonra delikleri kapatın ve çözeltinin oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, böcekleri standart diyetleriyle normal yetiştirme kaplarına geri aktarın ve her zamanki gibi koruyun. Daha sonra, böcekleri test için önceden belirlenmiş zaman aralıklarında toplayın.Dış işaret korumasını kontrol etmek için, küçük değişikliklerle iç işaret korumasını test etmek için ELISA testine benzer bir prosedür kullanın. Böcekler TBS ile mikro santrifüj tüplerine aktarıldıktan sonra, homojenize etmek yerine bir saat boyunca 120 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bekletin. Böcekleri ıslattıktan sonra, 100 mikrolitre çözeltiyi plaka kuyucuklarına pipetleyin ve plakanın en az bir saat inkübe edilmesine izin verin.Böcek örneklerini yıkadıktan sonra, her bir oyuğa yüzde bir BSA içeren 300 mikrolitre PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, kuyuları PBS-Tween ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa, PBS-BSA siluetinde sekiz binde bir seyreltilmiş 50 mikrolitre tavşan anti-yumurta albümin birincil antikoru ekleyin.Plakayı en az bir saat inkübe edin ve kuyuları daha önce olduğu gibi yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş ve PBS-BSA siluetinde iki binde bir oranında seyreltilmiş 50 mikrolitre keçi anti-tavşan IgG ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında en az bir saat inkübe etmesine izin verin ve ardından daha önce açıklandığı gibi protokole devam edin.İç işaretin korunması dört zaman noktasında test edildi. Genel olarak, protein olmadan tedavi edilen böcekler sürekli olarak düşük ELISA değerleri verdi. Oysa, proteinle zenginleştirilmiş diyetle beslenen tüm böcekler sürekli olarak güçlü ELISA değerleri verdi.Dış işaretler de dört zaman noktasında test edildi. Topikal olarak yumurta akı ile işaretlenen böcekler sürekli olarak güçlü değerler verdi. Tahmin edilebileceği gibi, su püskürtülen negatif kontroller çok düşük ELISA değerleri kaydetti.Bu videoyu izledikten sonra, böcekleri nasıl işaretleyeceğinizi iyi anlamalı ve işaretin varlığı için analiz etmelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat 30 dakika içinde yapılabilir. Bir gün boyunca, 1000'den fazla numune içeren 16 test plakası işlenebilir.Bu prosedürü denerken, testin son derece hassas olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, tüm yüzeylerin, kapların ve ekipmanların protein kontaminasyonundan arındırılmış olması zorunludur. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların tarımsal, kentsel, orman ve diğer doğal yaşam alanlarındaki böceklerin yerel ve alan çapında dağılım modellerini keşfetmelerinin yolunu açtı.Burada küçük ölçekli bir örnek üzerinde gösterdik, ancak teknik, ticari sprey ekipmanı kullanarak böcekleri doğrudan doğal ortamlarında etiketlemek için çok daha büyük bir ölçekte kullanılmıştır. İşbirlikçilerimizin yaratıcı uygulamalarına hayran kaldık.

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bu protokol klonal hücre hattı seçimi ve onların cognate GPCRs sentezlenmiş eklembacaklı nöropeptidlerin yapı-aktivite ilişkileri analiz etmek için bir kalsiyum biyoparlaklık tahlil için yönergeler sağlar. Bu testte, sentetik analog tasarım ve peptid / kurşun ilaç keşfi için reseptör deorphanization ve yapı-aktivite ilişkileri çalışmaları için kullanılabilir.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Erişkin göbek orangeworm elektrofizyolojik yanıt (ölçümü ile hızlı ekran ana bitki uçucu için bir...

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Bu video, Yakınlık Ligasyon Testi (PLA) kullanılarak Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini göstermektedir. Vücut duvarlarını izole ettikten sonra, etkileşen proteinler birincil antikorlar ve PLA ile konjuge ikincil antikorlar ile incelenir. Etkileşen proteinlerin yakınlığı, probların konektör oligonükleotidleri ile bağlanmasını kolaylaştırır, dairesel DNA oluşturur ve bu daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile amplifiye edilir.

Drosophila Larvalarında Protein-Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Bu iletişim kuralı--dan geleneksel bilgisayarları kullanan geleneksel web kamera video böcek anten ve hortum pozisyonların kare kare takibi için yeni yazılım, SwarmSight, kullanma adımları açıklar. Ücretsiz, açık kaynak yazılım çerçeveler yaklaşık 120 kez insanlar daha hızlı işler ve insan doğruluğu daha iyi at gerçekleştirir.

SwarmSight: Gerçek zamanlı izleme böcek anten hareketleri ve hortum uzantısı refleks bir ortak hazırlık ve geleneksel donanım kullanarak

Bir torbadaki dalların yapraklarını ve ucunu mühürleyerek, torbalanmış malzemeyi kırpıp dondurarak ve eklembacaklıları nicelleştirmek için alt tabakadan ayırmak için suda önceden dondurulmuş malzemeyi durulayarak yaprak lı eklembacaklıların nasıl ölçüleceklerini anlatıyoruz.

Yaprak-Konut Eklembacaklıların Ölçülme Yöntemi

Mevcut protokol, yapay bir ortam kullanarak delici emen böceklerden yeterli tükürük toplama yöntemini açıklar. Bu, böcek tükürüğü toplamak ve böcek besleme davranışı ve vektör kaynaklı virüs iletimi üzerinde tükürük fonksiyonunu incelemek için uygun bir yöntemdir.

Laodelphax striatellus Tükürük Koleksiyonu için İki Katmanlı Membran Sandviç Yöntemi

Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Culex tarsalis sivrisineklerinin insan elleri üzerindeki sondalama ve yutma davranışlarını AC-DC elektropenetrografi kullanarak incelemek için prosedürler açıklanmıştır.

Culex tarsalis sivrisineklerinin insan ellerinde sondalama ve yutma davranışlarının incelenmesi için AC-DC elektropenetrografi

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Öğrenin böcekleri protein işaretleyerek dağılma ve göç araştırmaları için nasıl izleneceğini. ELISA yöntemiyle işaretleri tespit edin ve doğal ortamlarda davranışları inceleyin.

Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama

Daha fazla video keşfet