Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama

Bu gösterinin genel amacı, dağılma veya göç araştırması için böceklerin protein ile nasıl işaretleneceğini açıklamaktır. Bu gösterime, bir sandviç veya dolaylı bir enzime bağlı immünosorbent testi ile işaretlerin nasıl tespit edileceğine ilişkin yöntemler dahildir. Bu yöntem, böcek dağılım araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Böcek göç modellerini, böcek konakçı bitki tercihlerini ve istilacı türlerin yayılmasını incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajları, tespit yönteminin basit ve ucuz olmasıdır. Yüksek verim için uygundur ve hayvanlar doğrudan doğal ortamlarında kolayca işaretlenebilir.

Genellikle bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü olduğundan daha zor görünmektedir, çünkü çoğu alan araştırmacısı bu basit teknikle ilgili deneyime sahip değildir. Bu yöntem fikri ilk olarak 1989'da aklıma geldi. Yapay bir diyetle iri gözlü böcek avcıları yetiştiriyorduk.

Bu böceklerin, doğal olmayan bir diyetle uzun süre esaret altında yetiştirildikten sonra bir Lygus böcek zararlısı üzerinde etkili avcılar olmayacağından endişe duyduk. Başka bir deyişle, evcilleştirileceklerdi. Onları sahaya sürüldükten sonra yerli muadillerinden ayırt etmek için güvenli, etkili ve ucuz bir yönteme ihtiyacımız vardı.

Mevcut işaretleme yöntemlerinin hiçbiri bu kriterlere uymuyor. Lygus'a özgü protein kalıntıları için yırtıcı bağırsak içeriği analizleri yapmak için ELISA prosedürünü kullanarak yaşadığım önceki bir deneyim, bana laboratuvarda yetiştirilen yırtıcıya yabancı bir protein işareti uygulama fikrini verdi. Buna karşılık, Lygus kalıntıları ve yabancı protein kalıntıları için toplanan büyük gözlü böcekleri analiz edebildik.

Başlamak için, bir laboratuvar kolonisinden veya tarladan yaklaşık 100 ilgi çekici böcek toplayın ve bunları iki temiz yetiştirme kabına bölün. Negatif kontrol görevi görmesi için bir kabı normal 20 mililitrelik bir diyet paketi ile doldurun. Diğeri için, bir miligram tavuk IgG-IgY içeren bir diyet paketi bağlayın.

Bir mililitre çözelti ekleyin ve iyice karıştırın. Gerekirse, paketin yerine böceklerin normalde beslendiği her şeyi kullanın. Bu diyet paketlerinde yetiştirildikten 24 saat sonra, her iki böcek grubuna da normal işaretsiz yiyecekler verin.

İstenilen zaman aralıklarında, her kohorttan 20 ayrı böcek toplayın. Deney için gerekli tüm kohortlar toplanana kadar eksi 20 santigrat derecede dondurun. ELISA için 96 oyuklu bir plaka hazırlamak için, her bir oyuğa Tris-Tamponlu Salin veya TBS içinde 500'de bir oranında seyreltilmiş 50 mikrolitre tavşan anti-tavuk IgY primer antikoru ekleyin.

Yüklenen plakayı oda sıcaklığında en az bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kuyuları boşaltın ve her kuyucuğa 300 mikrolitre blok çözeltisi ekleyin. Bu, yüzde bir yağsız kuru süt çözeltisidir.

Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Blok inkübasyon sırasında, tek tek donmuş böcekleri bir mililitre TBS ile yüklü mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ardından, her böceği temiz bir havaneli ile iyice homojenize edin.

Plaka hazır olduğunda, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre homojenize böcek numunesi yükleyin. Her 96 kuyulu plaka 80 numune barındırır. Kontroller için plakanın ilk ve son sütununu boş bırakın.

İlk sütunda, tek başına yedi adet 100 mikrolitre TBS alikotu yükleyin ve yumurta akı pozitif kontrollü 100 mikrolitre TBS ile bir kuyu yükleyin. Son sütunda, 100 mikrolitre sekiz ayrı işaretsiz böcek preparatı yükleyin. Numunelerin oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edilmesine izin verin.

İnkübasyondan sonra, kuyucukları Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Arası veya PBS-Tween ile üç kez dikkatlice yıkayın. Deneyimlerimiz sayesinde, çoğu hatanın yıkama adımları sırasında meydana geldiğini öğrendik. Sıçrama, yanlış pozitif reaksiyonların yüksek oranda oluşmasına neden olabilir, bu nedenle dikkatli olun.

Yıkamalardan sonra, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş 50 mikrolitre tavşan anti-tavuk IgG-IgY ekleyin ve yüzde bir süt çözeltisinde bir ila 10.000 oranında seyreltin. Çözeltinin oda sıcaklığında en az bir saat boyunca kuyucuklarda inkübe edilmesine izin verin. Daha sonra, plakayı daha önce olduğu gibi PBS-Tween ile üç kez yıkayın.

Ardından, kuyucukları 50 mikrolitre TMB substratı ile yükleyin. Hemen bir renk değişikliği görmeye başlayabilirsiniz. Plakayı bir mikroplaka spektrofotometresi ile okumadan önce 10 dakika inkübe edin.

Plakayı 650 nanometrede okuyun ve değerleri kaydedin. Böcekleri dışarıdan işaretlemek için, erişim delikleri olan bir litrelik plastik şişeler hazırlayın ve 100 böceği iki şişeye bölün. Daha sonra, böcekleri bir kaba bir mililitre damıtılmış su ile püskürtün, bu da negatif kontrol görevi görür.

Ardından, bir hava çıkışına tıbbi bir nebulizatör takın ve hava akışını, nebulizatör buhar üretecek şekilde ayarlayın. Diğer böceklere bir mililitre yüzde beş tavuk yumurtası akı çözeltisi püskürtün. Püskürtme işleminin tamamlanması iki ila beş dakika sürmelidir.

Daha sonra delikleri kapatın ve çözeltinin oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, böcekleri standart diyetleriyle normal yetiştirme kaplarına geri aktarın ve her zamanki gibi koruyun. Daha sonra, böcekleri test için önceden belirlenmiş zaman aralıklarında toplayın.

Dış işaret korumasını kontrol etmek için, küçük değişikliklerle iç işaret korumasını test etmek için ELISA testine benzer bir prosedür kullanın. Böcekler TBS ile mikro santrifüj tüplerine aktarıldıktan sonra, homojenize etmek yerine bir saat boyunca 120 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bekletin. Böcekleri ıslattıktan sonra, 100 mikrolitre çözeltiyi plaka kuyucuklarına pipetleyin ve plakanın en az bir saat inkübe edilmesine izin verin.

Böcek örneklerini yıkadıktan sonra, her bir oyuğa yüzde bir BSA içeren 300 mikrolitre PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, kuyuları PBS-Tween ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa, PBS-BSA siluetinde sekiz binde bir seyreltilmiş 50 mikrolitre tavşan anti-yumurta albümin birincil antikoru ekleyin.

Plakayı en az bir saat inkübe edin ve kuyuları daha önce olduğu gibi yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş ve PBS-BSA siluetinde iki binde bir oranında seyreltilmiş 50 mikrolitre keçi anti-tavşan IgG ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında en az bir saat inkübe etmesine izin verin ve ardından daha önce açıklandığı gibi protokole devam edin.

İç işaretin korunması dört zaman noktasında test edildi. Genel olarak, protein olmadan tedavi edilen böcekler sürekli olarak düşük ELISA değerleri verdi. Oysa, proteinle zenginleştirilmiş diyetle beslenen tüm böcekler sürekli olarak güçlü ELISA değerleri verdi.

Dış işaretler de dört zaman noktasında test edildi. Topikal olarak yumurta akı ile işaretlenen böcekler sürekli olarak güçlü değerler verdi. Tahmin edilebileceği gibi, su püskürtülen negatif kontroller çok düşük ELISA değerleri kaydetti.

Bu videoyu izledikten sonra, böcekleri nasıl işaretleyeceğinizi iyi anlamalı ve işaretin varlığı için analiz etmelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat 30 dakika içinde yapılabilir. Bir gün boyunca, 1000'den fazla numune içeren 16 test plakası işlenebilir.

Bu prosedürü denerken, testin son derece hassas olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, tüm yüzeylerin, kapların ve ekipmanların protein kontaminasyonundan arındırılmış olması zorunludur. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların tarımsal, kentsel, orman ve diğer doğal yaşam alanlarındaki böceklerin yerel ve alan çapında dağılım modellerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Burada küçük ölçekli bir örnek üzerinde gösterdik, ancak teknik, ticari sprey ekipmanı kullanarak böcekleri doğrudan doğal ortamlarında etiketlemek için çok daha büyük bir ölçekte kullanılmıştır. İşbirlikçilerimizin yaratıcı uygulamalarına hayran