Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra

Bu tekniğin genel amacı, hücre kültürü ortamında in vivo hipoksik iskemiyi taklit etmek amacıyla, oksijen ve glikoz yoksunluğu ve yeniden oksijenasyon sonrası astrositlerin cinsiyete özgü rollerini incelemek için bir araç olarak, yeni doğmuş farelerden zenginleştirilmiş cinsiyete özgü hipokampal astrosit kültürleri hazırlamaktır. Bu yöntem, gelişmekte olan erkek ve dişi beyinlerde hipoksik iskemi sonrası hipokampal astrositlerin cinsiyete özgü rolüne ilişkin temel mekanistik ve translasyonel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kafatasını açığa çıkarmak için deriden posterior'dan anterior'a doğru orta hat kesisi yapmak üzere küçük makaslar kullanarak yeni doğmuş bir fare yavrusunun kafasından beyni çıkarın.

Kraniumu boyundan buruna kadar orta hat boyunca dikkatlice kesin. Kafatasını soyarak ayırmak için steril düz uçlu pensler kullanın. Beyin sapını kavisli pens yardımıyla çıkarın ve beynin geri kalanını bir disseksiyon kabına yerleştirin.

Kavisli pensler kullanarak beyni, ventral yüzey yukarı bakacak şekilde çevirin ve ardından hemisferleri keskin, steril bir cerrahi bıçakla ayırın. Düz kavisli pensler yardımıyla serebral hemisferleri geri çekin ve medial temporal lobda bulunan denizatı şeklindeki küçük bir yapı olan hipokampusu ortaya çıkarmak için dışa doğru çıkıntılı olan orta beyin ve talamik dokuyu dikkatlice çıkarın. Her iki hipokampal lobu da çıkarın ve ince penslerle çekerek lobların yüzeyindeki meninges ve fibroblastları dikkatlice temizleyin.

Tek bir fareden alınan her iki hipokampal lobu da yaklaşık 5 mililitre HBSS ile dolu ikinci bir kaba aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Lobları, keskin ve steril bir cerrahi bıçak kullanarak yaklaşık 4 kez ince kıyın. HBSS ve dokuyu 50 mililitrelik steril konik bir tüpe aktarmak için 1 mililitrelik steril bir pipet kullanın ve ardından 300 ×g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra süpernatantı aspire edin. 3 mililitre %0,25 tripsin ekleyin, karıştırın ve dokuyu hafifçe sallayarak 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından tüpü 300 ×g'de 5 dakika santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire etmek için steril bir cam pipet kullanın ve ardından 10 mililitre önceden ısıtılmış astrosit ekim besiyeri ekleyin. Ateşte uçları düzeltilmiş bir cam pipet kullanarak 20 ila 30 kez tritüre edin. 300 ×g'de 5 dakikalık başka bir santrifüj işleminin ardından, süpernatanı aspire edin ve 2 mililitre astrosit ekim besiyeri ekleyin.

Hücre süspansiyonunu 70 micron gözenekli filtreden geçirerek yeni bir 50 milliliter konik tüpe aktarın. Tüm hücre süspansiyonunu, 3 milliliters astrosit ekim medyası içeren kaplamalı steril bir T-25 kültür flaskına ekleyin. Flaskı %5 carbon dioxide inkübatöründe 37 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin.

Ertesi gün, astrositik konfluensleşim ilerlemesini bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin, medyumu aspire edin ve 2 mililitre taze astrosit ekim medyumu ile değiştirin. İn vitro ortamda yaklaşık 11. günde, medyumu aspire ederek ve ardından 2 mililitre %0,25 tripsin ekleyerek konfluen astrositleri hasat edin. Balonu birkaç kez hafifçe döndürün ve ardından tripsini steril bir cam pipet kullanarak aspire edin.

2 ml daha %0,25 trypsin ekleyin ve balonu oda sıcaklığında 4-5 dakika bekletin. Trypsin'i uzaklaştırdıktan sonra, balonu %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de 10 dakika bekletin. İnkübasyonun ardından, 5 ml astrosit ekim medyumu ekleyin ve balona 3 ila 4 kez hafifçe vurarak astrositik tabakayı ayırın.

Tam ayrılmayı sağlamak için hücre süspansiyonunu balonun tabanında nazikçe triture edin ve ardından astrositleri 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Tüpü 300 ×g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve ardından 1 mililitre taze astrosit ekim medyumu ekleyin.

Hemositometreye 10 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve büyük merkezi ızgaralı alandaki hücreleri saymak için 10x objektifli bir ters faz kontrast mikroskobu kullanın. Hücreleri, 2 mL astrosit ekim ortamında yaklaşık 1 × 10⁵ hücre olacak şekilde dilüe edin. Hücre süspansiyonundan 2 mL'yi, 24 kuyucuklu bir kültür kabının kuyucuğundaki poli-D-lizini kaplı cam lamelin üzerine pipetle aktarın.

%5 karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. Oksijen ve glikoz yoksunluğunu başlatmak için, yapışkan astrositlerin bulunduğu lam üzerindeki medyumu aspire edin ve 1 mL izotonik OGD çözeltisi ile bir kez durulayın. Kuyucuğa 0,2 mL OGD çözeltisi ekleyin ve hipoksik inkübatöre yerleştirin.

Hipoksiniyi başlangıcındaki ilk 30 dakika boyunca 50 rpm hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı ile nazikçe karıştırın. Reoksijenasyon için, OGD solüsyonunu 2 mililitre astrosit ekim medyumu ile değiştirin ve 37 °C'de, %5 karbondioksit ve atmosferik hava ortamında 5 saat boyunca inkübe edin. Bu immünofloresan görüntü, primer fare hipokampal astrosit kültürünün saflığını göstermektedir.

Astrosit kültürü, nöronal dendrit belirteci MAP2'yi kırmızıda ve mikroglia belirteci IBA1'i yeşilde gösterecek şekilde immünboyandı. Çekirdekler, mavi renkte görünen DAPI ile boyanmıştır. Ok, mikroglia kontaminasyonunu göstermektedir.

Normoksik koşullar altındaki kültürlenmiş hipokampal astrositlerin bu temsili immünofloresan görüntüsü, kırmızı renkte GFAP immünoreaktivitesini ve yeşil renkte HIF1-alpha işaretlemesini göstermektedir. Yine, çekirdekler mavi renkte görünen DAPI ile boyanmıştır. Ok, düşük HIF1-alpha ekspresyonunu göstermektedir.

2 saatlik oksijen ve glikoz yoksunluğu ile 5 saatlik reoksijenasyonun ardından, artmış HIF1-alpha nükleer ekspresyonunu belirten ok ucu ile gösterildiği üzere, kültürlenmiş hipokampal astrositlerde HIF1-alpha ekspresyonu artmıştır. Erkek farelerden elde edilen hipokampal astrosit kültürlerinde, oksijen ve glikoz yoksunluğu ve reoksijenasyon sonrası GFAP ekspresyonu ve S100b ekspresyonu yukarı regüle olmuştur. S100b ve GFAP'nin yukarı regülasyonu, dişi farelerden elde edilen astrositlerde de görülmüştür.

Bu prosedürün ardından; in vitro iskemi sonrası belirli gen ve protein ekspresyonlarındaki cinsiyete özgü değişiklikler gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla kantitatif PCR, western blotting, siRNA ve immünohistokimyasal boyamalar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların kültürdeki astrositleri inceleyerek hipokampustaki inmenin etkilerini ve sonuçlarını keşfetmelerine yol açabilir.