Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.

Bu protokolün genel amacı, pre-implantasyon sırasında fare embriyolarının iç hücre kütlesi farklılaşmasını kontrol eden evreye özgü molekülleri tanımlamak için fonksiyon kaybı ve kazancı manipülasyonlarını kullanmaktır. Bu yöntem, temel gelişim biyolojisinin yanı sıra kök hücre biyolojisi, hayvan bilimi ve hayvan klonlama gibi üreme biyoteknolojisinde erken hücre kaderi kurtuluşu ile ilgili kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel amacı, embriyo gelişimi sırasında sadece embriyonik kök hücreye özgü faktörlerin ekspresyonunu arttırmak için kullanılan evreye özgü reseptör ve ligandlardır.

Bu protokol birden fazla laboratuvar ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Bu yüzden süreci göstermek için işbirliği yaptığım Profesör Sang Jin Lee ve yüksek lisans öğrencisi Yong Il Cho olacak. Son enjeksiyondan 18 ila 20 saat sonra, hamile kadınları karbondioksit zehirlenmesi ve ardından servikal çıkık ile kurban edin.

Ardından arka tarafı açın ve iç katmanı ince bir makasla kesin. İnce forseps kullanarak rahim boynuzlarını bulun ve alın ve bunları rahim, yumurta kanalı, yumurtalık ve yağ yastıkçıkları ile birlikte yavaşça vücut boşluğundan dışarı çekin. Ardından, ince makas kullanarak yumurta kanalı ile yumurtalık arasındaki alanı kesin.

Ardından, forsepsleri yeniden konumlandırın ve uterusu yumurta kanalının yakınında kesin ve uterusun üst kısmının en az bir santimetresini bağlı bırakın. Şimdi, oviductal ampulla'yı oda sıcaklığında 35 milimetrelik bir Petri kabı üzerindeki mineral yağ kaplı M16 damla besiyerine aktarın. Birkaç farenin yumurta kanallarını aynı tabakta toplayın.

Bir CC şırınga iğnesini hazırladıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, yumurta kanalının ucunu tutmak ve girmek için ince forseps kullanın. Daha sonra, medya bırakma aşamasında kümülüs kütlesini yavaşça delin ve sıkın. Bir stereomikroskop altında, steril bir cam pipet kullanarak 2-PN embriyolarını çevreleyen kümülüs kütleleri ile birlikte kurtarın ve bunları yeni bir Petri kabına aktarın.

Daha sonra, dokuları bir mililitre hyaluronidaz çözeltisinde yıkayarak kümülüs hücrelerini ayırın. Şimdi, çanağı 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Bir sonraki adım, embriyoları yok etmektir.

Cam pipeti kullanarak, kümülüs hücrelerini çevredeki embriyolardan serbest bırakmak için banyo solüsyonunu nazikçe akıtın. Daha sonra, soyulmuş embriyoları embriyo başına 30 ila 50 mililitre taze PBS ile yıkayın. Bu yıkamayı üç kez yapın.

Şimdi, embriyoları M16 artı BSA ile 35 milimetrelik plastik bir kaba aktarın ve mikroenjeksiyondan önce dört saate kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun. Mikroenjeksiyondan önce, soyulmuş 2-PN embriyoları bir mililitre taze M16 ile kısaca yıkayın. Daha sonra, embriyoları çözelti içinde bir santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca 1.000 Gs'de döndürün.

Şimdi, her embriyoyu 20 ila 30 mikrolitre M16 ortamı içeren bir kültür kabına aktarın. Bu, pronükleusu görünür hale getirecektir. Ortamı ince bir mineral yağ tabakası ile örtün ve embriyoları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde bir ila iki saat inkübe edin.

Bu arada, mekanik bir çektirme ile enjeksiyon pipetlerini ve tutma pipetlerini borosilika cam kılcal borudan hazırlayın. Daha sonra, bir mikro öğütücü ve bir mikro öğütücü kullanarak, enjeksiyon pipetlerini kör uçlu olarak üretin ve bunları iki mikron genişliğinde açıklıklar halinde parlatın. Uç uzunluğu 500 mikrondan az olmalıdır.

Benzer şekilde, keskin olmayan uçlar yaparak ve açıklıklarını 20 mikron iç çapa ve 100 mikron dış çapa kadar parlatarak tutma pipetleri üretin. Şimdi, enjeksiyon pipetlerini mikrolitre başına bir mikrogram DNA konsantrasyonunda en az 200 nanolitre plazmit çözeltisi ile yükleyin. Ardından, enjeksiyon pipetini motorlu bir mikromanipülatöre monte edin.

Ardından, enjektörü yaklaşık 10 pikolitrelik darbeli bul-ih-ses'e ayarlayın. Mikroenjeksiyon için, tutma pipetinden negatif basınç kullanarak embriyoları sabitleyin. Ardından, enjeksiyon pipetinin ucunu ilerletin ve hücre zarının yanına pronükleuslardan birinin hemen üzerine yerleştirin.

Ardından, hücre zarını mızraklayın, pronükleusa daha fazla itin ve 10 pikolitre enjeksiyonunu yapın. Mikroenjeksiyondan sonra, enjekte edilen embriyoları toplayın ve taze M16 ortamı ile üç kez yıkayın. Her yıkamanın süresi bir dakikadan az olabilir.

Ardından, buharlaşmasını önlemek için M16 ortamını bir damla mineral yağ ile kaplayarak ve her embriyoyu bir damla M16 ortamı üzerine plastik bir kültür kabına yerleştirerek embriyoları kültürlemeye devam edin. Her 24 saatte bir, 200x büyütmede 488 nanometre veya 555 nanometre DIC optikli konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak embriyoları gözlemleyin. Neogenin, preimplantasyonun erken gelişim aşamalarında geçici olarak eksprese edilir.

2 hücreli evre kadar erken ortaya çıkar ve erken morula evresine kadar sürer. İfadesi esas olarak mekansal olarak hücrelerin dışıyla sınırlıdır. Neogenin ekspresyon seviyeleri, 2-PN zigotların neogenin cDNA vektörleri veya neojenine karşı kısa firkete RNA'sı barındıran vektörler ile mikroenjekte edilmesiyle manipüle edildi.

RFP ve GFP göstergeler olarak birlikte ifade edildi. Elde edilen neogenin ekspresyon seviyesi hem immünofloresan hem de immünoblotlama ile doğrulandı. Ne neogenin kaybı ne de neogenin kazanım embriyolarında büyük morfolojik farklılıklar yoktu ve blastosist aşamasına kadar farklı şekilde gelişmediler.

Bununla birlikte, Oct üç ve dört pozitif ICM hücresi tarafından ölçüldüğü gibi, neojenin kaybı embriyolarında ICM gelişimi daha az belirgindi. Ayrıca, neojenin kazanım embriyolarında blastosist başına daha fazla Oct üç ve dört pozitif ICM hücresi vardı. Bu gözlem rtPCR analizi ile daha da doğrulandı.

Neogenin kazanç embriyolarında, Cdx2 ve Tead4'teki ihmal edilebilir bir ekspresyon değişikliğinin aksine, Oct üç ve dört, SOX2 ve Nanog ekspresyonları önemli ölçüde artmıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokolün bu mikroenjeksiyon kısmı yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu protokolü denerken, 2-PN embriyonun dondurucu olduğunu, hasarı en aza indirmek için embriyonun optimize edilmiş izolasyon mikroenjeksiyonu ile kültüre edildiğini unutmayın.

İlaç çalışmaları gibi bu prosedürel yöntemi tamamlamak, sinyal yolu ve benzeri ile ilgili asırlık soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.