Name: Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Keşfedin, rat kortikal nöronlarda F-aktin puncta nicelendirme yöntemiyle sinaptik bütünlüğü ve plastisiteyi nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu protokol, immünositokimya ve görüntü analizi kullanarak sinaptik yapı değişikliklerini güvenilir şekilde ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibeleri DA013137, DA031604 ve HD043680 tarafından finanse edilmiştir. Biyomedikal-Davranış biliminde bir NIH T32 eğitim bursu ile kısmi destek sağlandı.

Tüm hayvan protokolleri gözden geçirilmiş ve Güney Carolina Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (güvence numarası: A3049-01) tarafından onaylanmıştır. 1. Düşük yoğunluklu Embriyonik Nöronal Kültür <ol><li> Primer kortikal nöron kültürü için hazırlık <ol><li> Çözümler: <ol><li> 10 ml borat tamponu Poli-L-Lizin 5 mg çözülmesiyle Poli-L-Lisin stok çözelti hazırlayın. </li><li> 49 mi borat tamponu içinde 1 ml poli-L-lizin stok seyreltilmesi ile çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> 395 mi DH 2 O ile başlayan ve daha sonra tüm maddeler (Boraks 1.24 g borik asit + 1.9 g) eklenerek borat tamponu, pH 8.4 hazırlanır. 1 M NaOH ile 8.4 pH ayarlayın. 400 ml ayarlayın ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li><li> 445 ml dH 2 O ile başlayan ve diğer tüm maddeler ekleyerek HBSS çözüm, pH 7.2 hazırlayın (50 ml 10X HBSS Stok + 1.2 g HEPES). 1 N HCI, bri tarafından pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayınng 500 ml ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li><li> % 10 fetal bovin serumu içeren DMEM / F12: Kaplama orta hazırlayın. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li><li> tam büyüme ortamı hazırlayın: 50 ml Neurobasal orta için, takviyeleri ekleyin (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glukoz antibiyotik antimikotik çözüm (100X + 1 ml B-27 (50X) + 500 ul) + 100 ul% 7.5 sodyum Bikarbonat. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li></ol></li><li> İki gün kültür öncesi: <ol><li> 2 Poli-L-Lizin çalışma solüsyonu ve kaput O / N altında tutmak ile kaplayın oniki 35 mm cam alt yemekler. </li></ol></li><li> kültür bir gün önce: <ol><li> GKD 2 O. ile boş kaplama yemekler ajan ve durulama Yemekler kaputun altında bir saat kurumaya bırakın. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (toplam çözeltinin% 10) ile kaplanmış ortamı (DMEM / F12 hazırlayın. Pipet 2 mi ortam içineher yemeğin ve 37 o C,% 5 CO 2 O / N kuluçkaya yatmaktadır. Not: kültürlerken plastik kültür kaplarına önlemek için önemlidir. cam alt (ters Mikroskop) yemekleri ya da (dik mikroskoplar) cam lamelleri kullanılması keskin ve net görüntüler verir. Bir plastik alt tabak ile karşılaştırıldığında, cam alt çanak floresan mikroskopi sırasında istenmeyen tonları veya parlamayı önler. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre kültürü protokolü: <ol><li> HBSS Buffer (100-150 ml), buzdolabında koymak 100 mm petri, forseps, makas, 50 ml tüpler ve kaputu UV ışık altında 15 ml tüpler. </li><li> kültür odası dışında başlık altında% 5 sevofluran öldürücü inhalasyon ile gebe sıçan Euthanize. </li><li> % 70 EtOH, çadır karın cavity.Open plasentayı maruz makas kullanarak rahim ortasında kuyruk yukarıya kesim sırasında forseps kullanarak alt karın derisi ile sterilize edin. </li><li> 8-10 E18 fetus çıkarın. PlaHBSS çözeltisi ihtiva eden petri çanakları 8-10 fetus ce. </li><li> forseps ile fetusun başının arkasını tutun, sonra vücuttan kafasını koparmaya makas kullanın. HBSS 5-7 ml ile dolu başka bir petri yerleştirin. kaput çanak aktarın. </li><li> Soğuk HBSS ile iki ek 100 mm petri doldurun. </li><li> Peel kenara kafatası ve HBSS ile dolu yeni bir petri içine beyin kepçe. </li><li> sonra bunun soğuk HBSS ile yeni bir petri beyin transferi, beyinden gelen keskin kavisli bir forseps, ayrı beyincik ve beyin sapı kullanın. </li><li> kavisli bir forseps ile hemisfer ayırmak, sabitlemek için cımbız kullanın. meninks çıkarın; İşaretli 15 ml santrifüj tüplerine frontal korteks ve transfer parçaları izole. </li><li> Taze 2 mi HBSS ile 15 ml tüp doldurun ve her biri 15 ml&#39;lik bir tüpe 20 ul tripsin EDTA (% 0.5 tripsin ve 5.3 mM EDTA. 10x konsantre edildi) ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkalayın. Yavaşça tüpü birkaç dakikada girdap, yerleşme izin vermez. </li><li> After 10-15 dk, kullanım cam pipet eski HBSS kaldırmak ve yeni HBSS ile iki kez durulayın. </li><li> (2 mi HBSS içinde 1 mg / ml, 2 mg tripsin inhibitörü) tripsin inhibitörü daldırın, iyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. Taze HBSS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yine bir kalibre pipet ve çok yavaş homojen hale gelene kadar azaltılmış ucu çapı ile steril bir ucunu kullanarak bubbles.Triturate önleyecek şekilde çok yavaş çiğnemek beyin parçaları, lastik ampul 10-15 kez cam pipet kullanarak. </li><li> Aktarım istenilen yoğunlukta hücreler çözülmüş kaplanmış kültür kaplarına (50 hücre / mm2) hazırlanmış ön. 37 o C,% 5 CO2 O / N inkübe edin. </li><li> 24 saat sonra, taze tam büyüme serumsuz Neurobasal orta DMEM / F12 ortamı değiştirin. </li><li> Deney için en az 12-14 gün% 5 CO 2/95% odada nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde her zaman hücreleri korumak. Taze Neurobasal orta yaşlı orta yaklaşık% 50 yerine her 5-6 gün hücreleri tamamlar. </li></ol></li></ol> 2. Floresan Etiketleme ve İmmünositokimya Not: Birincil kortikal hücre kültürleri immünofloresan markalama 1 ml&#39;lik bir çalışma hacmine sahip cam alt 35 mm&#39;lik bir hücre kültür tabaklarında gerçekleştirilmiştir. <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) ile iki defa cam alt bulaşık yıkama. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak. </li><li> PBS ile iki kez yıkanır hücreler, 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği. </li><li> F-aktine özel leke ile oda sıcaklığında 20 dakika için hücreleri tedavi, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 1 ml PBS içinde Phalloidin 25 ul). </li><li> PBS ile iki kez hücreleri durulanır ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 normal keçi serumu ile bloke eder. </li><li> % 2 normal keçi serumu ile PBS içinde 4 O ° C&#39;de O / N inkübe: Tavuk poliklonal anti-MAP2 antikoru (2.500 1) ile seyreltilir </li><li> inkübasyondan sonra, iki kez PBS ile durulayın. </li><li> ikincil antikor (Alexa R sulandırmakEd 594-konjuge keçi anti-tavşan IgG&#39;si (1: 500)% 2 normal keçi serumu ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS ile durulayın ve 10 ul / Hoescht boya çanak ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın ve iki kez PBS ile yıkayın. Not: Adım 3 (F-aktin puncta sayma) için artık etiketli hücreler hazır. </li><li> Bir Lamel Kapatma ajan olarak antifade reaktif 100 ul ile hücre örneği korumak ve uzun süreli depolama için karanlıkta 4 o C&#39;de tutun. Not: Phalloidin antifade Lamel reaktifleri ile korunabilir 1 hafta ve floresan kadar karanlıkta 4 ° C&#39;de PBS içinde nispeten kararlıdır. Phalloidin uzatılmış depolama ile difüze başlayabilir Bununla birlikte, uygun resim boyama sonrası 1-3 gün elde edilir. </li></ol> 3. F-aktin puncta Sayma <ol><li> floresan mikroskop açın ve 20 × amacı geçmek. Açık mikroskop yazılımı ve 1280 × 960 piksel görüntü boyutunda program kurmak, ve 0.11 × zum 7 mikron / piksel görüntü çözünürlüğü. </li><li> Kırmızı yeşil (495 nm) / (613 nm) floresan kanal altında eş etiketli F-aktin / map2 nöronların görüntüler elde. </li><li> 5 Yeşil (F-aktin) / Kırmızı (map2) immunolabeled / Mavi (Hoescht) açıkça tanımlanmış dendritik milleri ile bireysel nöronun floresan görüntüleri seçin. </li><li> Sürekli map2 immünofloresan ile ikinci dereceden dendritik segmentte (uzunluk aralığı 25-75 mikron) F-aktin zengin yapıları belirleyin. </li><li> yatay bir seviyeye görüntüleri seçili bölgeyi döndürün. yeni bir resim olarak Kopyala ve yapıştır. </li><li> Her yemeğin tutarlı ayarlamalar kullanarak, görüntülerin arka planını çıkarın. </li><li> Parlak yeşil F-aktin puncta saymak ve elle eğitimli bağımsız gözlemciler tarafından seçilen dendritik parçasının uzunluğunu iz. Bir tablo dosyasına veri verir. </li><li> Map2 dendrit etiketli uzunluğu (L) toplam F-aktin etiketli puncta (N) bölünmesi ile yoğunluğunu hesaplayınız. F-ac sayısı Express verilerinidendrit 10 mikron başına kalay puncta Not: puncta dendritik mili boyanma ortalama yoğunluğu en az 50% bir tepe şiddetine sahip F-aktin floresans (boyut ≤1.5 um), seçilen her bir dendritik bölümüne dahil edilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecek çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, bize bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta sıçan kortikal nöronların kültürleme açıklar. Sonra, dendritik değişiklikleri tespit etmek faloidin ve map2 boyama kullanın. Sonra, F-aktin puncta değişiklikleri ölçmek için özel yazılım kullanılır. F-aktin puncta bireysel nöronun tüm nöronal ağ açıkça görünür olmalıdır değişiklikleri belirlemek için, bu tek bir nörondan uygun ikinci dereceden dendritik segmentlerin seçilmesini sağlar....

Bu çalışmanın temel amacı, nöronal dendritik ağın sinaptik bütünlüğünün ölçümü (tahmini) güvenilir bir yöntem geliştirmektir. Burada Phalloidin boyama ve uzman (NIS-Elemanları) yazılımı kullanılarak takip eden analizi ile dendritler immunositokimyasal (ICC) taramadan oluşan bir kombinasyon kullanılarak primer fare kültürlenmiş nöronlar F-aktin puncta ölçülmesini açıklar. Etiketli phallotoxins büyük ve küçük ipliklerin (F-aktin) için benzer bir yakınlığa sahip fakat bazı aktin antikor 1 farklı olarak, monomerik küresel aktin (G-aktin) bağlanmaz. Phalloidin bağlayıcı Nonspesifik böylece hücresel görüntüleme sırasında en az bir arka plan sağlayarak, ihmal edilebilir düzeydedir. Phalloidin genellikle Phalloidin F-aktin çok daha yoğun etiketleme sağlar flüoresan mikroskopi için hücresel proteinleri etiketlemek için kullanılacak antikorlar çok daha küçüktür. Böylece, nöronlarda F-aktin lokalizasyonu detaylı görüntüler olabilirişaretlenmiş falloidinle kullanılması yoluyla elde edilmiştir. Phalloidin nöronal dendritler (F-aktin) boyama olgun dikenleri olmayan dikenli sinaps 2 ve olgunlaşmamış dikenler de dahil olmak üzere dendritik yapıların, çeşitli temsil eden ayrık &quot;sıcak noktalar&quot; ya da parlak &quot;puncta&quot; oluşturur. Olgunlaşmamış dikenleri ince filopodia ve yama morfolojisi bazı formları içerir ve spinogenesis 3 başlatılmasını temsil edebilir. Olgunlaşmamış dikenleri olan ve olmayan dikenli yamalar PSD95 4 yoksundur. Sadece dikenler sonraki değişiklikler değil, aynı zamanda ek dendritik yapılara F-aktin kurşun üretiminde değişiklikler, böylece synaptodendritic bütünlüğünü 5-7 araştırmak için önemli bir araç faloidin adrestir. Genel olarak, Phalloidin-pozitif (F-aktin) puncta sayısı bir aktif sinapsların arasında bir denge (eksitatör ve inhibitör), aktin dinamiklerini ve sinaps istikrar 8 yansıtmaktadır. belirli t incelemek önemli olmasına rağmenBir tedavinin hedefi bilinmediğinde sinaps (yani, uyarıcı dikenleri) bir Dosya türleri, ilk dendritik yapıların çeşitli genel bütünlüğünü tahmin etmek için gereklidir. F-aktin önleyici sinaps bir synaptopathy gösterebilir F-aktin puncta bir değiştirilmiş sayısı dahil olmak üzere dendritik dikenler ve diğer yapıların, önemli bir bileşeni olduğu için. Bu synaptopathy daha sonra belirli değişiklikler için daha fazla araştırılması olabilir. Birden fazla sinaptik türleri / yapıların tespiti için bizim miktar yöntemi çeşitli deneysel tedaviler aşağıdaki dendritik sinaptik değişiklikler (artış ve azalışlar) genel bir tahmin verir.

<table><tbody><tr><td>35 mm Cam Alt Tabaklar No. 1.5 kapak camı</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Boraks</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik çözüm</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forseps Dünyası</td><td> Hassas Aletler</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Teknolojileri</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Normal at serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk poliklonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Kırmızı 594 konjuge keçi anti-tavuk IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Canlı hücre lekesi ReadyProbes Reaktif Hoescht 33342</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements yazılım paketi</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E ters floresan bilgisayar kontrollü mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 & m Nalgene naylon membran filtre</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

rat kortikal nöronlar filamentli aktin (f-aktin) puncta niceleme

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

(F-aktin) İpliksi aktin proteini spinogenesis, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitesinde önemli bir rol oynar. dendritik F-aktin zengin yapılardaki değişiklikler sinaptik bütünlük ve bağlantı değişiklikleri göstermektedir. Burada F-aktin puncta ve sonraki ölçümü teknikleri için birincil sıçan kortikal nöronların, Phalloidin boyama kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. İlk olarak, E18 fare embriyonlarının frontal korteks, daha sonra, düşük yoğunluklu, hücre kültürü içine en az 12-14 gün boyunca in vitro yetiştirilen nöronlar ayrışmış. Deneysel tedaviden sonra, kortikal nöronlar AlexaFluor 488 falloidinle boyanır ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (dendritik F-aktin puncta etiket) (MAP2; nöronal hücreleri ve dendritik bütünlüğünü doğrulamak için). Son olarak, özel yazılım analiz ve rastgele seçilen nöronal dendrite ölçmek için kullanılır. F-aktin zengin yapılar ikinci mertebe dendritik dalları (uzunluk aralığı 25-75 ve tespit edilir# 181; sürekli map2 immünofloresan ile m). Burada sunulan protokol deneysel tedaviler sonrasında dendritik sinaps yapılarında değişiklikler araştırmak için faydalı bir yöntem olacaktır.

Mevcut yöntemlerle, biz ilk kültür sıçan bizi bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta, kortikal nöronlar. Şekil 1 &#39;de, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve görüntüler gün 4, 6, 10, in vitro olarak 14, 21 ve 27 fetal sıçan kortikal nöronlar geliştirmek morfolojik değişiklikleri gösterir. uzunluk ve Dentritlerin sayısı kültürlü sıçan primer nöronlar olgunlaşması ile artış olduğunu unutmayın. Nöronlar, sadece ...

Filamentli aktin (F-aktin), spinogenez, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitede önemli bir rol oynar. F-aktin punkta'nın miktar tayini bu nedenle sinaptik yapıların bütünlüğünü incelemek için yararlı bir araçtır. Bu protokol, düşük yoğunluklu primer kortikal nöronal kültürlerde Phalloidin ile etiketlenmiş F-aktin punktasının miktar tayini prosedürlerini açıklar.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Kültür nöronlarda Filamentöz Aktin Punktalarının Nicelendirilmesi işleminin genel amacı, sinaptik yapıların bütünlüğünü ve bilişselliğini incelemek için yararlı bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem; spinogenez, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilite hakkında nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, F-aktin punkta tanımlaması ve nicelendirmesinin ardından primer nöronal kültür için ayrıntılı bir protokol sağlamasıdır.Başarı hedefi bilinmediğinde, ratia fundantric yapılarının genel bütünlüğünün tahmin edilmesi gerekir. Bu yöntem fikri ilk olarak, kokain gibi kötüye kullanılan ilaçların ve tat ile JP 120 gibi HIV toksik proteinlerinin neden olduğu nöron hasarını incelerken ortaya çıkmıştır. Kültür kurulumundan iki gün önce, 12 adet 35 mm cam tabanlı kabı, iki ml Poly-L lysine çalışma çözeltisi ile kaplayın. Sterilitelerini korumak için kapları gece boyunca steril kabinde saklayın.Ertesi gün, kaplama ajanını dökün ve kapları çift distile su ile durulayın. Kapların davambil altında bir saat boyunca kurumasına izin verin. Ardından, her bir kaba iki mililitre ekim besiyeri aktarın.Kapları 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Kültür gününde, hasat edilen beyni soğuk HBSS içeren bir petri kabına yerleştirin. Ardından, beyni pensetle sabitleyerek, hemisferleri ayırmak ve meningesleri uzaklaştırmak için kavisli forseps kullanın.Frontal korteksleri izole edin ve parçaları steril bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe iki milliliters taze HBSS ve 20 microliters tripsin EDTA ekleyin ve nöral dokuları oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin. Birkaç dakikada bir hafifçe çalkalayın.İnkübasyonun sonunda, eski HBSS'nin tamamını aspire etmek için bir cam pipet kullanın. Ardından korteksleri iki kez taze HBSS ile durulayın. İkinci yıkamadan sonra, dokuyu tripsin inhibitörüne daldırın.İyice karıştırın ve örneği oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Ardından dokuları taze HBSS ile iki kez yıkayın. Şimdi, beyin parçalarını çok yavaş bir şekilde 10 ila 15 kez tritüre etmek için kauçuk ampullü bir cam pipet kullanın.Ardından, düşük çaplı steril uçlu kalibre edilmiş bir pipet kullanarak, doku bulamacını çok yavaş bir şekilde tekrar tritüre edin. Çözelti homojen hale geldiğinde, hücreleri uygun yoğunlukta önceden kaplanmış kültür kaplarına, hücre kültürü inkübatöründe gece boyu inkübe edilmek üzere ekim yapın. 24 saat sonra, ekim ortamını yeni hazırlanmış tamamlayıcı büyüme serumsuz dar bazal ortam ile değiştirin.Ardından hücreleri en az 12 ila 14 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Münferit nöronların görselleştirilebilmesi için düşük yoğunlukta ekim yapılması önemlidir. Ayrıca, nöron bazal medyum, hücre kültürleri içindeki astrositlerin proliferasyonunu minimize etmek açısından kritiktir.Hücreleri immünositokimya için işaretlemek amacıyla, öncelikle cam tabanlı hücre kültürü kabını iki kez PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin. Bunu iki kez PBS yıkaması ile takip edin.Ardından, hücreleri beş dakika boyunca PBS içinde %0,1 Triton X 100 ile geçirgenleştirin ve oda sıcaklığında F-aktine özgü bir boya ile işaretleyin. 20 dakika sonra hücreleri iki kez PBS ile durulayın ve hücre yüzeyindeki spesifik olmayan boyamaları %10 normal keçi serumu ile bloke edin. İnkübasyon sonunda, hücreleri dört santigrat derecede gece boyunca tavuk poliklonal anti-map iki antikoru ile işaretleyin.Ertesi sabah, hücreleri iki kez PBS ile durulayın ve uygun sekonder antikor ile markalayın. Oda sıcaklığında iki saat bekledikten sonra, hücreleri tekrar PBS ile durulayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 10 µL huxs ile markalayın. Ardından hücreleri son iki kez PBS ile yıkayın ve 100 µL anti-fade re-agent ile koruma altına alın.Bu boyamadan sonraki üç gün içinde, floresan mikroskobunu açın ve 20 X objektifi seçin. Ardından, mikroskop yazılımında piksel görüntü boyutunu 1600 x 1200'e ve piksel başına 0.17 mikron görüntü çözünürlüğünü 1 X zoom değerine ayarlayın. Hücrelerin bulunduğu kabı mikroskop tablasına yerleştirin.Ardından, yeşil ve kırmızı floresan kanalları altında çift etiketli F-aktin map 2 nöronlarının görüntülerini elde edin. Tüm görüntüler alındığında, yeşil, kırmızı ve mavi kanallarda belirgin dendritik ağaçlara sahip beş bireysel nöron görüntüsü seçin. İkinci derece dendritik segmentlerdeki F-aktin bakımından zengin yapıları belirlemek için sürekli map 2 immünofloresan yöntemini kullanın.Görüntülerin seçilen bölgesini yatay olarak döndürün. Ardından bu bölgeyi kopyalayıp yeni bir görüntü olarak yapıştırın. Sonrasında görüntü arka plan floresanını çıkarın ve parlak yeşil F-actin puncta sayısını belirlemek için yazılımı kullanın.Seçilen dendritik segmentlerin uzunluğunu ölçmek için eğitimli bağımsız gözlemciler kullanın. Ardından puncta sayılarını ve dendritik segment uzunluğu verilerini bir hesap tablosu dosyasına aktarın. Gözlemcilerin, her seçilen segmentteki dendritik şaft boyama ortalama yoğunluğunun en az %50 üzerinde pembe floresan yoğunluğuna sahip F-aktin postür punctalarını dahil ettiğinden emin olun.Son olarak, verileri dendrit başına on mikronda düşen F-aktin puncta sayısı olarak ifade ederek formüle göre yoğunluğu hesaplayın. Burada, diferansiyel interferans kontrast görüntüleri, in vitro ortamda 4 ila 27. günlerdeki gelişmekte olan fetal sıçan kortikal nöronlarında gözlemlenen morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Kültürlenen birincil sıçan nöronları olgunlaştıkça dendritlerin uzunluğundaki ve sayısındaki artışa dikkat edin.F-aktin'in falloidin ile etiketlenmesi çok hızlı gerçekleştiği için, immünositokimyasal antikor etiketlemesine geçmeden önce sinapto-dendritik ağın bütünlüğünü görsel olarak tahmin etmek mümkündür. Map2, bozulmamış dendritleri boyayarak F-aktin punktalarının astrositler gibi diğer hücrelerde değil, nöronal dendritler üzerinde yerleştiğini doğrular. Yüksek çözünürlüklü görüntülerde, filopodlar, spine çıkıntıları ve F-aktin yamalarını içeren F-aktin bakımından zengin yapılar gözlemlenebilir.HIV 1 tat kaynaklı sinapto-dendritik hasarın değerlendirildiği bu deneyde, Map2 boyaması, HIV 1 tat tedavisi sonrası sıçan kortikal nöronlarında daha az dendritik dal ve azalmış F-aktin olduğunu ortaya koymuştur. Nitekim, deneysel tedaviye yanıt olarak F-aktin punktaları artış veya azalış göstermektedir. Örneğin, bu deneyde kültürlenmiş nöronlar rekabetçi olmayan NMDA reseptör antagonisti memantin ile tedavi edildiğinde, F-aktin pozitif punktaların yoğunluğunda belirgin bir artış gözlemlenmiştir.Buna karşılık, metamfetamin ve HIV1 tat kombinasyonu ile tedavi, F-aktin punctalarının önemli ölçüde kaybıyla sonuçlanmıştır. Ko-etiketli F-aktin Map2 nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edildikten sonra, puncta yoğunluklarının analizi için iki eğitimli gözlemcinin ikinci derece dendrit segmentlerini seçtiğinden emin olun. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim araştırmaları alanındaki araştırmacılara yol açmıştır.Sadece akut sinaptopati izlemi için değil, aynı zamanda sinaptik iyileşmenin ve deneysel nöral restorasyon süreçlerinin incelenmesi için de uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, nöral dendritik ağın sinaptik bütünlüğünü ölçen güvenilir bir yöntemin nasıl geliştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

Bu video, mikroskopi için sıçan kortikal nöronlarının floresan olarak boyanması prosedürünü göstermektedir. Yapısal bütünlüğü analiz etmek ve nöronal fonksiyon ve sağlığı incelemek için çok önemli olan F-aktin yoğunluğunu hesaplamak için F-aktin ve dendritik proteinleri hedefler.

Sıçan Kortikal Nöronlarında Filamentli Aktin Punktasının Miktar Tayini

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Bu protokol, kültürlü sıçan hipokampal nöronları ve 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanarak aktin halkalarını ve akson başlangıç segmentinin membran periyodik iskeletinin diğer bileşenlerini görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Akson Başlangıç Segmentinin Membran Periyodik İskeletinin 3D Yapılı Aydınlatma Mikroskobu (3D-SIM) Kullanılarak Ölçüm Özellikleri

Keşfedin, rat kortikal nöronlarda F-aktin puncta nicelendirme yöntemiyle sinaptik bütünlüğü ve plastisiteyi nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu protokol, immünositokimya ve görüntü analizi kullanarak sinaptik yapı değişikliklerini güvenilir şekilde ölçmenizi sağlar.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Daha fazla video keşfet