Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Kültür nöronlarda Filamentöz Aktin Punktalarının Nicelendirilmesi işleminin genel amacı, sinaptik yapıların bütünlüğünü ve bilişselliğini incelemek için yararlı bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem; spinogenez, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilite hakkında nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, F-aktin punkta tanımlaması ve nicelendirmesinin ardından primer nöronal kültür için ayrıntılı bir protokol sağlamasıdır.

Başarı hedefi bilinmediğinde, ratia fundantric yapılarının genel bütünlüğünün tahmin edilmesi gerekir. Bu yöntem fikri ilk olarak, kokain gibi kötüye kullanılan ilaçların ve tat ile JP 120 gibi HIV toksik proteinlerinin neden olduğu nöron hasarını incelerken ortaya çıkmıştır. Kültür kurulumundan iki gün önce, 12 adet 35 mm cam tabanlı kabı, iki ml Poly-L lysine çalışma çözeltisi ile kaplayın. Sterilitelerini korumak için kapları gece boyunca steril kabinde saklayın.

Ertesi gün, kaplama ajanını dökün ve kapları çift distile su ile durulayın. Kapların davambil altında bir saat boyunca kurumasına izin verin. Ardından, her bir kaba iki mililitre ekim besiyeri aktarın.

Kapları 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Kültür gününde, hasat edilen beyni soğuk HBSS içeren bir petri kabına yerleştirin. Ardından, beyni pensetle sabitleyerek, hemisferleri ayırmak ve meningesleri uzaklaştırmak için kavisli forseps kullanın.

Frontal korteksleri izole edin ve parçaları steril bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe iki milliliters taze HBSS ve 20 microliters tripsin EDTA ekleyin ve nöral dokuları oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin. Birkaç dakikada bir hafifçe çalkalayın.

İnkübasyonun sonunda, eski HBSS'nin tamamını aspire etmek için bir cam pipet kullanın. Ardından korteksleri iki kez taze HBSS ile durulayın. İkinci yıkamadan sonra, dokuyu tripsin inhibitörüne daldırın.

İyice karıştırın ve örneği oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Ardından dokuları taze HBSS ile iki kez yıkayın. Şimdi, beyin parçalarını çok yavaş bir şekilde 10 ila 15 kez tritüre etmek için kauçuk ampullü bir cam pipet kullanın.

Ardından, düşük çaplı steril uçlu kalibre edilmiş bir pipet kullanarak, doku bulamacını çok yavaş bir şekilde tekrar tritüre edin. Çözelti homojen hale geldiğinde, hücreleri uygun yoğunlukta önceden kaplanmış kültür kaplarına, hücre kültürü inkübatöründe gece boyu inkübe edilmek üzere ekim yapın. 24 saat sonra, ekim ortamını yeni hazırlanmış tamamlayıcı büyüme serumsuz dar bazal ortam ile değiştirin.

Ardından hücreleri en az 12 ila 14 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Münferit nöronların görselleştirilebilmesi için düşük yoğunlukta ekim yapılması önemlidir. Ayrıca, nöron bazal medyum, hücre kültürleri içindeki astrositlerin proliferasyonunu minimize etmek açısından kritiktir.

Hücreleri immünositokimya için işaretlemek amacıyla, öncelikle cam tabanlı hücre kültürü kabını iki kez PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin. Bunu iki kez PBS yıkaması ile takip edin.

Ardından, hücreleri beş dakika boyunca PBS içinde %0,1 Triton X 100 ile geçirgenleştirin ve oda sıcaklığında F-aktine özgü bir boya ile işaretleyin. 20 dakika sonra hücreleri iki kez PBS ile durulayın ve hücre yüzeyindeki spesifik olmayan boyamaları %10 normal keçi serumu ile bloke edin. İnkübasyon sonunda, hücreleri dört santigrat derecede gece boyunca tavuk poliklonal anti-map iki antikoru ile işaretleyin.

Ertesi sabah, hücreleri iki kez PBS ile durulayın ve uygun sekonder antikor ile markalayın. Oda sıcaklığında iki saat bekledikten sonra, hücreleri tekrar PBS ile durulayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 10 µL huxs ile markalayın. Ardından hücreleri son iki kez PBS ile yıkayın ve 100 µL anti-fade re-agent ile koruma altına alın.

Bu boyamadan sonraki üç gün içinde, floresan mikroskobunu açın ve 20 X objektifi seçin. Ardından, mikroskop yazılımında piksel görüntü boyutunu 1600 x 1200'e ve piksel başına 0.17 mikron görüntü çözünürlüğünü 1 X zoom değerine ayarlayın. Hücrelerin bulunduğu kabı mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından, yeşil ve kırmızı floresan kanalları altında çift etiketli F-aktin map 2 nöronlarının görüntülerini elde edin. Tüm görüntüler alındığında, yeşil, kırmızı ve mavi kanallarda belirgin dendritik ağaçlara sahip beş bireysel nöron görüntüsü seçin. İkinci derece dendritik segmentlerdeki F-aktin bakımından zengin yapıları belirlemek için sürekli map 2 immünofloresan yöntemini kullanın.

Görüntülerin seçilen bölgesini yatay olarak döndürün. Ardından bu bölgeyi kopyalayıp yeni bir görüntü olarak yapıştırın. Sonrasında görüntü arka plan floresanını çıkarın ve parlak yeşil F-actin puncta sayısını belirlemek için yazılımı kullanın.

Seçilen dendritik segmentlerin uzunluğunu ölçmek için eğitimli bağımsız gözlemciler kullanın. Ardından puncta sayılarını ve dendritik segment uzunluğu verilerini bir hesap tablosu dosyasına aktarın. Gözlemcilerin, her seçilen segmentteki dendritik şaft boyama ortalama yoğunluğunun en az %50 üzerinde pembe floresan yoğunluğuna sahip F-aktin postür punctalarını dahil ettiğinden emin olun.

Son olarak, verileri dendrit başına on mikronda düşen F-aktin puncta sayısı olarak ifade ederek formüle göre yoğunluğu hesaplayın. Burada, diferansiyel interferans kontrast görüntüleri, in vitro ortamda 4 ila 27. günlerdeki gelişmekte olan fetal sıçan kortikal nöronlarında gözlemlenen morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Kültürlenen birincil sıçan nöronları olgunlaştıkça dendritlerin uzunluğundaki ve sayısındaki artışa dikkat edin.

F-aktin'in falloidin ile etiketlenmesi çok hızlı gerçekleştiği için, immünositokimyasal antikor etiketlemesine geçmeden önce sinapto-dendritik ağın bütünlüğünü görsel olarak tahmin etmek mümkündür. Map2, bozulmamış dendritleri boyayarak F-aktin punktalarının astrositler gibi diğer hücrelerde değil, nöronal dendritler üzerinde yerleştiğini doğrular. Yüksek çözünürlüklü görüntülerde, filopodlar, spine çıkıntıları ve F-aktin yamalarını içeren F-aktin bakımından zengin yapılar gözlemlenebilir.

HIV 1 tat kaynaklı sinapto-dendritik hasarın değerlendirildiği bu deneyde, Map2 boyaması, HIV 1 tat tedavisi sonrası sıçan kortikal nöronlarında daha az dendritik dal ve azalmış F-aktin olduğunu ortaya koymuştur. Nitekim, deneysel tedaviye yanıt olarak F-aktin punktaları artış veya azalış göstermektedir. Örneğin, bu deneyde kültürlenmiş nöronlar rekabetçi olmayan NMDA reseptör antagonisti memantin ile tedavi edildiğinde, F-aktin pozitif punktaların yoğunluğunda belirgin bir artış gözlemlenmiştir.

Buna karşılık, metamfetamin ve HIV1 tat kombinasyonu ile tedavi, F-aktin punctalarının önemli ölçüde kaybıyla sonuçlanmıştır. Ko-etiketli F-aktin Map2 nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edildikten sonra, puncta yoğunluklarının analizi için iki eğitimli gözlemcinin ikinci derece dendrit segmentlerini seçtiğinden emin olun. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim araştırmaları alanındaki araştırmacılara yol açmıştır.

Sadece akut sinaptopati izlemi için değil, aynı zamanda sinaptik iyileşmenin ve deneysel nöral restorasyon süreçlerinin incelenmesi için de uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, nöral dendritik ağın sinaptik bütünlüğünü ölçen güvenilir bir yöntemin nasıl geliştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.