Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Kültürlenmiş nöronlarda Filamentli Aktin Punta'nın bu Miktar Tayininin genel amacı, sinaptik yapıların bütünlüğünü ve bilişselliğini incelemek için yararlı bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, sinirbilim alanındaki spinojenizis, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilite ile ilgili temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, F-aktin punkta tanımlaması ve miktar tayinini takiben primer nöronal kültür için ayrıntılı bir protokol sağlamasıdır.

Başarı hedefi bilinmediğinde, ratia fundantrik yapıların genel bütünlüğünü tahmin etmek gerekir. Bu yöntem için ilk olarak, kokain gibi kötüye kullanım ilaçlarının neden olduğu nöron hasarını ve tat ve JP 120 gibi HIV toksik proteinlerini incelerken aklımıza geldi. Kültür kaplamasını kurmadan iki gün önce 12, 35 milimetre cam tabanlı tabaklar, iki mililitre Poly-L lizin çalışma çözeltisi ile. Ve sterilitelerini korumak için bulaşıkları gece boyunca davlumbazda saklayın.

Ertesi gün, kaplama maddesini atın ve bulaşıkları çift damıtılmış suyla durulayın. Bulaşıkların davlumbazın altında bir saat kurumasını bekleyin. Daha sonra her yemeğe iki mililitre kaplama ortamı aktarın.

Ve bulaşıkları gece boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. Kültürün bir günü, hasat edilen beyni soğuk HBSS içeren bir petri kabına koyun. Daha sonra, bir beyni cımbızla sabitleyin, hemisferleri ayırmak ve meninksleri çıkarmak için kavisli forsepsleri kullanın.

Frontal korteksleri izole edin ve parçaları steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe iki mililitre taze HBSS ve 20 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve nöral dokuları oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Birkaç dakikada bir hafifçe dönme ile.

İnkübasyonun sonunda, eski HBSS'nin tamamını aspire etmek için bir cam pipet kullanın. Ve korteksleri taze HBSS ile iki kez durulayın. İkinci yıkamadan sonra, dokuyu tripsin inhibitörüne batırın.

İyice karıştırın ve numuneyi oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Daha sonra dokuları taze HBSS ile iki kez yıkayın. Şimdi beyin parçalarını 10 ila 15 kez çok yavaş bir şekilde ezmek için lastik ampullü bir cam pipet kullanın.

Daha sonra, çapı küçültülmüş steril bir uçla donatılmış kalibre edilmiş bir pipet kullanarak, doku bulamacını tekrar çok yavaş bir şekilde ezin. Çözelti homojen olduğunda, hücre kültürü inkübatöründe bir gece inkübasyon için hücreleri önceden kaplanmış kültür kaplarında uygun yoğunlukta plakalayın. 24 saat sonra, kaplama ortamını yeni hazırlanmış tam büyüme serumu içermeyen dar bazal ortamla değiştirin.

Ve hücreleri en az 12 ila 14 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Düşük yoğunluklu kaplama, tek tek nöronları görselleştirmek için önemlidir. Ve nöron bazal ortamı, hücre kültürleri içindeki astrosis delinmesini en aza indirmede kritik öneme sahiptir.

Hücreleri immünositokimya için etiketlemek için, önce cam alt hücre kültürü kabını PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin. Ardından iki PBS yıkaması yapılır.

Daha sonra, hücreleri PBS'de yüzde 0.1 Triton X 100 ile beş dakika boyunca geçirgen hale getirin ve bunları oda sıcaklığında F-aktin spesifik bir boya ile etiketleyin. 20 dakika sonra, hücreleri PBS ile iki kez durulayın ve spesifik olmayan hücre yüzeyi lekelenmesini %10 normal keçi serumu ile bloke edin. Kuluçka süresinin sonunda, gece boyunca hücreleri tavuk poliklonal anti-map iki antikoru ile dört santigrat derecede etiketleyin.

Ertesi sabah, hücreleri PBS ile iki kez durulayın ve uygun ikincil antikor ile etiketleyin. Oda sıcaklığında iki saat sonra, hücreleri tekrar PBS ile durulayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 10 mikrolitre huxs ile etiketleyin. Daha sonra hücreleri PBS ile son iki kez yıkayın ve 100 mikrolitre anti-solma önleyici reaktif ile koruyun.

Bu boyamadan sonraki üç gün içinde floresan mikroskobu açın ve 20 X objektifi seçin. Ardından, mikroskop yazılımında piksel görüntü boyutunu 1600 x 1200 ve piksel başına 0,17 mikron görüntü çözünürlüğünü 1 X yakınlaştırma olarak ayarlayın. Hücre tabağını mikroskop aşamasına aktarın.

Ve yeşil ve kırmızı floresan kanalların altındaki ortak etiketli F-aktin haritası 2 nöronlarının görüntülerini elde edin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, açıkça tanımlanmış dendritik arborslara sahip yeşil, kırmızı ve mavi kanallardaki bireysel nöronların beş görüntüsünü seçin. Ve ikinci sıradaki dendritik segmentlerdeki F-aktin açısından zengin yapıları tanımlamak için sürekli harita iki immünofloresan kullanın.

Görüntülerin seçili bölgesini yatay olarak döndürün. Ve bölgeyi kopyalayıp yeni bir görüntü olarak yapıştırın. Ardından görüntü arka plan floresansını çıkarın ve parlak yeşil F-aktin punkta sayısını saymak için yazılımı kullanın.

Seçilen dendritik segmentlerin uzunluğunu ölçmek için eğitimli bağımsız gözlemciler kullanın. Ardından puncta sayılarını ve dendritik segment uzunluğu verilerini bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Gözlemcilerin, seçilen her segmentte dendritik şaftta ortalama lekelenme yoğunluğunun en az% 50 üzerinde pembe floresan yoğunluğuna sahip F-aktin duruş puncta'sını içerdiğinden emin olun.

Son olarak, yoğunluğu formüle göre hesaplayın ve verileri on mikron dendrit başına F-aktin puncta sayısı olarak ifade edin. Burada, diferansiyel girişim kontrast görüntüleri, gelişmekte olan fetal sıçan kortikal nöronlarında 4 ila 27. günlerde en vitro olarak gözlenen morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Kültürlenmiş sıçan birincil nöronları olgunlaştıkça dendritlerin uzunluğundaki ve sayısındaki artışa dikkat edin.

F-aktinin falloidin etiketlemesi çok hızlı olduğundan, immünositokimyasal anti-kor etiketlemesine devam etmeden önce sinapto-dendritik ağın bütünlüğünü görsel olarak tahmin etmek mümkündür. Map2, bozulmamış dendritleri boyayarak, F-aktin punktasının nöronal dendritler üzerinde bulunduğunu ve astrositler gibi diğer hücrelere lokalize olmadığını doğrular. Yüksek çözünürlüklü görüntülerde phi filopodia içeren F-aktin açısından zengin yapılar, omurga çıkıntıları ve F-aktin yamaları gözlenebilir.

HIV 1 tat'ın sinapto-dendritik hasarı indüklediğini değerlendirmek için yapılan bu deneyde, Map2 boyama, HIV 1 tat tedavisini takiben sıçan kortikal nöronlarında daha az dendritik dal ve azalmış F-aktin ortaya çıkardı. Gerçekten de, F-aktin punkta deneysel tedaviye yanıt olarak artar veya azalır. Örneğin, bu deneyde, kültürlenmiş nöronlar rekabetçi olmayan NMDA reseptör antagonisti memantin ile tedavi edildiğinde, F-aktin pozitif punkta yoğunlukta önemli bir artış yaşadı.

Buna karşılık, metamfetamin artı HIV1 tat kombinasyonu ile tedavi, F-aktin punkta'da önemli bir kayba neden oldu. F-aktin Map2 nöronları olarak etiketlenmiş kömürün yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde ettikten sonra, punkta yoğunluklarının analizi için iki eğitimli gözlemcinin ikinci dereceden dendritlerin segmentlerini seçmesini unutmayın. Geliştirildikten sonra bu teknik, sinirbilim araştırmaları alanındaki araştırmacıların önünü açtı.

Sadece acutes sinaptopatisinin izlenmesi için değil, aynı zamanda sinaptik iyileşme ve deneysel nöral restorasyon süreçlerinin incelenmesi için de. Bu videoyu izledikten sonra, nöral dendritik ağın sinaptik bütünlüğünü ölçen güvenilir bir yöntemin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.