Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Biyolüminesan görüntülemenin genel amacı, aktivitenin bir vekili olan in vivo fonksiyonel kalsiyum geçicisini daha uzun süreler boyunca ve derin beyin yapılarında görüntülemektir. Bu yöntem, sinek beyninin bazal aktivitesinin uyku sırasında nasıl göründüğü gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, lazerinizi kullanarak uyarma gerektirmemesidir.

Bu, klasik kalsiyum görüntülemeye kıyasla, dokuya daha derin ve fotoağartma ve toksisite olmadan daha uzun bir süre boyunca geçici kalsiyumun görüntülenmesine olanak tanır. Bu yöntem, drosophila'daki bazal beyin aktivitesi hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca fare gibi diğer model organizmalarla da kullanılabilir. Başlamak için, drosophila melanogaster ilgi hattını ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi deneysel çözeltileri hazırlayın.

Daha sonra, tek bir drosophila'yı iki dakika boyunca buz üzerinde bir cam şişeye aktararak buz anestezisi uygulayın. Daha sonra, sineği soğutulmuş bir petri kabına taşıyın ve sineği yaklaşık 35 derecelik bir açıyla kesilmiş 1000 mikrolitrelik bir pipet ucunun içine nazikçe yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Bir fırça kullanarak, her bir sineği hafifçe itin ve hizalayın, böylece kafa ucun kenarını tamamen geçecek ve sırt bölgesi kısmen açığa çıkacaktır.

Ardından, hazırlanan diş yapıştırıcısını baştan pipet ucu kenarına uygulayın. Başın tepesinden kaçınmak için ekstra özen gösterin. Başın yapıştırılması çok önemlidir, çünkü başarılı diseksiyon ve görüntüleme için doğru pozisyonda sabitlenmesi çok önemlidir.

Ek olarak, zayıf yapıştırma, zil çözeltisinin sızmasına ve görüntülemeden önce numunenin ölümüne yol açacaktır. Ardından, pipet ucunu ekli sinekle birlikte kayıt odasındaki deliğe yerleştirin ve yerine sabitlemek için hafifçe bastırın. Ardından, herhangi bir sızıntıyı önlemek için haznenin pipet ucuyla birleştiği düz tarafını sabitlemek için hazırlanmış bir silikon yapıştırıcı kullanın.

Bolluk kanalının, kısa kenarın üzerine ve haznenin arkasına uzanan bir musluk parçası yapıştırın. Daha sonra, sinek ile odayı mikroskop altına yerleştirin ve flüoresan lambayı açın. Ardından, hazneye bir mililitre zil çözeltisi pipetleyin.

İnce bir cerrahi bıçak kullanarak, sineğin başının arkasından her iki taraftaki antenal bölgeye paralel kesiler yapın. Ardından, gözün kenarı boyunca kesin ve önceki kesileri birbirine bağlayan antenin üzerinde dikey bir kesi yapın. Başın arkasında son bir kesi yapın ve ardından kütikülü çıkarmak için bir çift ince, keskin forseps kullanın.

Beyin ve floresan mantar gövdesi net bir şekilde görüntülenene kadar açıkta kalan solunum dokusunu nazikçe kavrayın ve temizleyin. Daha sonra, beyni kaplayan nöral epitel dokusunu dikkatlice kavramak ve sıkıştırmak için ultra keskin forsepsler kullanın ve onu çıkarmak için coelenterazine'nin nüfuz etmesine izin verin. Bir pipet kullanarak, diseksiyondan kalan kalıntıları temizlemek için dokuyu bir mililitre zil solüsyonu ile iki kez yıkayın ve ardından numuneyi karanlık bir kutuya yerleştirin.

Daha sonra, hazneye beş mikromolar benzil-coelenterazine içeren bir mililitre zil çözeltisi pipetleyin. Kutuyu kapatın ve numuneyi oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Bilgisayardaki mikroskobu açarak başlayın.

Ayrıca kamerayı eksi 80 santigrat dereceye kadar soğutun. Ardından, drenaj sistemini kurun ve çevresel kontrolleri 20 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, foton görüntüleyiciyi açın, yeni bir klasör oluşturun ve ilk kaydı adlandırın.

Ardından, potasyum klorür, nikotin ve zil çözeltisini ilgili rezervuarlarına ekleyerek bolluk sistemini kurun. Akışı, her bir çözelti dakikada iki mililitre deşarj olacak şekilde ayarlayın. Ardından, numuneyi mikroskop altındaki yuvaya yerleştirin ve büyütmeyi 5X'e ayarlayın.

Ardından, füzyon tüpünü delinme yoluyla kanala yerleştirin. Mikroskobu floresan moduna ayarlayın ve ardından mantar gövdelerini ortalayın ve odaklayın. Mantar gövdeleri odaklandıktan sonra büyütmeyi 20X olarak değiştirin.

Görüntüyü yeniden ortalayın ve odağı ayarlayın. Ardından, drenaj aparatını drenaj havuzunun üzerine yerleştirin ve drenaj şöntünün yüksekliğini, uç drenaj havuzunun hemen üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Ardından, yeterli drenaj olup olmadığını kontrol etmek için numuneyi 30 saniye boyunca zil solüsyonu ile yıkayın.

Son olarak, cihazı herhangi bir dış ışıktan yalıtmak için kalkanı aşağı çekin. Foton görüntüleyici programındaki otomatik sistemi kullanarak, odakta ince ayarlamalar yapın ve mantar gövdelerinin referans floresan görüntüsünü alın. Foton hızını, her 50 milisaniyede bir görüntüden saniyede bir görüntüye veya daha fazlasına kadar herhangi bir yerde olması gereken istenen kayıt hızına ayarlayın.

Ardından, foton modunu seçin ve deklanşörü açın. Ardından, günlük girişlerine genotipi, cinsiyeti, yaşı ve numune numarasını girin. Kaliks, hücre gövdeleri ve medial loblar üzerindeki ilgi alanı kutularının konumunu, kutulara tıklayarak ve kontrolü tutarken yerlerine sürükleyerek ayarlayın.

Şimdi, yaklaşık beş ila 10 dakika boyunca temel değerleri kaydedin. Ardından, nikotin akışını başlatmak için anahtarı çevirin. Aynı zamanda, enter tuşuna basın ve nikotin akışının başladığını belirtmek için bir not ekleyin.

Bir dakika sonra akışı durdurun ve günlüğe akışın durdurulduğunu belirten başka bir not alın. Ardından, numuneyi beş dakika boyunca zil çözeltisi ile yıkayın. Numune iyileşirken, yıkamayı kapatın, zamanlayıcıyı beş dakika daha ayarlayın ve potasyum klorür akışını başlatmaya hazırlanın.

Başlamaya hazır olduğunuzda, potasyum klorür akışını başlatın ve numune günlüğüne 100 milimolar potasyum klorür başlangıcı "girin. Bir dakika sonra akışı durdurun ve numune günlüğüne "potasyum klorür kapatma" girin. Ardından, numuneyi bir dakika boyunca zil çözeltisiyle yıkayın ve mikroskobu floresan moduna geçirin.

Son bir floresan görüntü alın ve ardından zil çözeltisini kapatın ve numuneyi çıkarın. Analiz programında ilk dosyayı açın, ekran kontrolü" sekmesini seçin ve ROI'ye tıklayın. Ardından, kontrolü elinize alın ve ilgilendiğiniz bir bölge seçin.

Ardından, ROI'lerin boyutunu, yönünü ve şeklini GFP aydınlatmalı kaliks ve hücre gövdelerini ve medial lobları kapsayacak şekilde ayarlayın. İlgilenilen tüm bölgeler eklendikten sonra, foton videosunu oynatmak için filmi "sekmesini seçin. İkinci genişliği ve ikinci adımları istediğiniz gibi ayarlayın.

Ardından, YG yerleşimini gerektiği gibi yeniden ayarlayın, böylece videodaki etkin bölgeler içinde kalır. GFP floresansının, nikotin tepkisinin ve potasyum-klorür tepkisinin bazı temsili ekran görüntülerini seçin. Ardından ekran görüntülerini kırpın ve temsili görüntüleri geç analiz ve karşılaştırma için bir sunum slaydına yapıştırın.

Hem ikinci genişliği hem de ikinci adımı saniye cinsinden kayıt hızına ayarlayın. Ayrıca, üst paneldeki gri işaretçileri parantez içindeki bölgeye, uyaran başlatmadan önce ve yanıt bitiminden hemen sonra hareket ettirerek analizin uzunluğunu seçin. Ardından, oynatırken "askıya al görünümleri" seçin ve ardından video oynatmayı başa sıfırlamak için geri sarma düğmesine ve ardından oynat düğmesine basın.

Ardından, birimleri ayarlamak ve ayrıca ilgilenilen bölgelerin rengini ve çizgi renklerini istediğiniz gibi ayarlamak için sekme sayısı oranı grafiğini "seçin. Analiz tamamlandığında sayım oranı verilerini dışarı aktar'ı seçin. Ardından, kaliks ve hücre gövdelerinin birleşik kayıtlarının yanı sıra her iki taraftaki medial lob bölgelerinden gelen kayıtları seçin ve bu görüntüleri yanıt görüntüleriyle birlikte bir slayta yapıştırın.

Mantar cisimlerini uyarmanın en basit yollarından biri, iyonotropik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin aktivasyonudur. Burada gösterilen 25 mikromolar nikotine tipik yanıt, hem kaliks hem de hücre gövdelerinin ve medial lobların hızlı aktivasyonu ile başlar ve kalsiyuma bağlanan ve ışık yayan kaynaşmış GFP-aequorin yapısını kullanır. Genel olarak, kaliks ve hücre gövdelerindeki yanıt daha uzun sürer ve yanıtın sıralı panellerinde gösterildiği gibi, loblardan daha büyük bir biyolüminesan yanıtı sergiler.

Zaman içinde nikotinik aktivasyona biyolüminesan yanıtın örnek bir kaydı, kaliks ve hücre gövdelerini içeren ilgili bölgedeki fotonların sayısının siyah olarak grafiklendirildiği ve medial lob bölgesindeki fotonların sayısının kırmızı ile gösterildiği bu grafikle açıklanmaktadır. Bu grafikten, yanıtın uzunluğu, yanıt sırasındaki tepe foton değeri ve her eğrinin altındaki toplam alanın tümü belirlenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, hazırlık aşaması, sinek sayısına bağlı olarak kuluçkadan sadece iki saat önce sürmelidir.

Ek olarak, her kayıt, düzgün bir şekilde yapıldığı takdirde yirmi dakika gibi kısa bir sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, numuneler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için sinek stoğunu uygun şekilde yaşlandırmayı ve tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, yapının aktivitesinin belirli davranış üzerinde ne gibi etkileri olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için daha fazla davranış testi yapılabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesi, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların drosophila beynindeki uzun vadeli nöral aktiviteyi keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, sinek beyninde biyolüminesan görüntüleme için örneklerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Nikotinin sağlığınız için tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedürden solüsyon hazırlarken veya temizlik yaparken eldiven gibi önlemler alınmalıdır.