Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme Arabidopsis Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Bu anatomik kesit hazırlığının genel amacı, birincil Arabidopsis Kökündeki farklı dokular arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılmasını sağlayan hücresel çözünürlükte nispi kristal ve selüloz birikimini ölçmektir. Bu yöntem, belirli bir hücre tipinin hücresel bileşiminin tüm organların büyümesini nasıl etkilediği gibi bitki fizyolojisi ve gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Arabidopsis tohumunu metin protokolüne göre sterilize ettikten sonra, steril tohumları %0.8 bitki agar ve 0.5XM ortamı içeren plakalara yayın.

Parafilm ile plakaları sarın ve alüminyum folyo ile kaplayın. Düzgün çimlenmeyi teşvik etmek için plakaları bir ila dört gün boyunca 4 santigrat derecede saklayın. Daha sonra plakaları, agar ortamının üzerinde kök büyümesini sürdürmek için plakaları dikey olarak yönlendirerek Arabidopsis fideleri yetiştirmek için uygun bir büyüme odasına aktarın Richardson solüsyonunu metin protokolüne göre hazırlayın: Kullanmadan önce şırınga tahrikli 0,22 mikron PVD filtre ünitesinden süzün.

Daha sonra, kimyasal bir başlık altında, 38 ml 0.5M sodyum kakodilat ile 2.5 ml glutaraldehit birleştirerek 50 mililitre fiksatif hazırlayın. Daha sonra nihai fiksasyon solüsyonunu oluşturmak için fiksasyon solüsyonuna 100 mikrolitre Richardson solüsyonu ekleyin. Önceden işaretlenmiş bir plaka kullanın, ardından çözelti fideleri tamamen kaplayacak şekilde kuyucuklara 2 ila 3 ml son sabitleme çözeltisi yerleştirin.

Plastik forseps kullanarak, her bir kuyucuğa en fazla 10 fideyi dikkatlice aktarın. Karanlıkta en az bir gece ve bir haftaya kadar 4 santigrat derecede saklamadan önce plakaları kapatmak için parafilm kullanın. Sabit fideleri kurutmak için, bitkileri kendi halleriyle almak için forseps kullanın ve bunları, burada listelenen süreler için artan konsantrasyonlarda etanol içeren yeni işaretlenmiş altı kuyulu plakaların kuyularına aktarın.

Bir torba Historesin Aktivatörünün içeriğini 50 ml bazik reçine sıvısı ile karıştırarak küçük bir cam şişede infiltrasyon ortamı hazırlayın. Bir mıknatıs yerleştirin ve çözeltiyi karıştırma plakası üzerinde 20 dakika karıştırın. Altı oyuklu bir plakanın etiketli kuyucuklarını 2 ila 3 ml infiltrasyon ortamı ile doldurun.

Daha sonra, fideler tamamen susuz kaldığında, bunları %95 etanol çözeltisinden infiltrasyon ortamına aktarmak için forseps kullanın ve ortam tarafından tamamen kaplandıklarından emin olun. Bitki dokularına maksimum penetrasyonu sağlamak için numuneleri en az dört gün boyunca 4 santigrat derecede saklayın. Blokları hazırlamak için, her bir kuyu içine numune adıyla işaretlenmiş küçük etiketleri, kurşun kalemi yerleştirin ve kalıpları gömün.

15 ml sızma ortamına 1 ml sertleştirici ekleyerek gömme ortamını hazırlayın. Yaklaşık 200 mikrolitre gömme ortamı ile her bir kuyucuğun yarısını kalıpta doldurun. Ve kalıbı her iki tarafta fazladan 1 ml ile kaplamak için bir üst film parçası kullanın.

Kısmi polimerizasyona izin vermek için kalıpları oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Daha sonra, ek bir gömme ortamı partisi hazırlayın ve kök uçları kalıpta düzenlenirken polimerizasyonu önlemek için güzel bir şekilde tutun. Gömme ortamını küçük bir tabağa ekleyin ve bir fideyi bir ortama yerleştirin.

Bir diseksiyon dürbünü altında, her bir kök ucunu kesmek için bir neşter kullanın, ardından çok dikkatli bir şekilde, kalıp çevresinden yaklaşık 2 ila 3 mm uzağa, transfer bölümleri için dikey olarak veya uzunlamasına bölümler için yatay olarak kalıba yerleştirin. Dokuyu düzenledikten sonra, kalıbı tamamen doldurmak için gömme ortamı kullanın ve bir üst film ile örtün. Daha sonra oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin: Blokları kurutmak için kuru silika jel içeren bir kurutucuya koyun ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.

Elmas puanlama aleti ile donatılmış bir bıçak yapıcı kullanarak, cam yolu bir kare şeklinde keserek ve ardından iki bıçak üretmek için kareyi çapraz olarak keserek cam çubuklardan cam bıçaklar hazırlayın. Her iki bıçağın da keskin kenarlara sahip olduğunu doğrulayın. Bir bloğu bir tutucuya monte edin.

Daha sonra, tek kenarlı bir endüstriyel bıçakla, bir piramit şekli elde etmek için kök ucundan bir mm'ye kadar fazla blok malzemesini çıkarın. Şekillendirilmiş bloğu 2 ila 3 mikron genişliğinde dilimler halinde bölümlere ayırın ve dilimleri işaretli bir cam slayta aktarın. Sonra dilimlerin üzerine su damlacıkları ekleyin.

Analiz edilen verilerin değişkenliğini en aza indirmek için genişlik olarak tek tip bölümler hazırlamak önemlidir. Cam kaydırakları, su buharlaşana kadar kısık ısıya ayarlanmış ısı bloklarının üzerine yerleştirin. Polarize mikroskop altında görüntülenmek üzere slaytlar hazırlamak için, Richardson solüsyonunu orijinal solüsyonun %2'sine kadar seyreltin ve dilimleri kaplamak için yaklaşık 1 ml kullanın.

Ardından numuneleri 5 saniye boyunca ısı bloğuna yerleştirin ve yıkamak için damıtılmış su kullanın. Slaytları sıcak plaka üzerinde kuruttuktan sonra, dilimleri diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin ve ilgilenilen dilimlerin konumunu belirtmek için bir slaytın arkasını işaretlemek için bir işaretleyici kullanın. Kapak kızağı ile kaplamadan önce 100 mikrolitre montaj ortamı ekleyin.

Metin protokolüne göre görüntüleyin ve analiz edin. Burada, saç dışı hücreler, saç hücreleri ve korteks dahil olmak üzere kurucu hücrelerinin ve dokularının radyal organizasyonu ile Arabidopsis birincil kökünün bir kesiti gösterilmektedir. Bu konfokal görüntü, komşu hücrelerin tek yönlü genişlemesini ve tüm kök büyümesini inhibe eden bir BRI1 mutant arka planında tüylü olmayan hücrelerde BRI1-GFP ekspresyonunu göstermektedir.

Burada görüldüğü gibi, yabani tipten ve tüysüz hücrelerde BRI1 eksprese eden çizgilerden elde edilen köklerin uzunlamasına kesitleri, geçiş bölgesindeki hücrelere kıyasla meristematik hücrelerde bulunan yüksek açı değişkenliğine sahip selüloz mikrofibrillerinin benzer bir yönelimini sergilemiştir. Bu, burada enine kesitlerde gösterildiği gibi, iki genetik arka planın karşılık gelen meristematik ve uzayan hücrelerinde selülozdaki nispi kristal birikiminin karşılaştırılmasını sağlar ve tüylü olmayan hücrelerdeki BRI1 ekspresyonu ile selülozdaki yüksek yerel kristal birikimi arasında bir korelasyon olduğunu ortaya çıkarır. Genellikle videolarda bu yönteme yeni başlayanlar zorlanacaktır çünkü gömme işlemi sırasında iyi yönlendirilmiş kökler elde etmek zordur.

Bu nedenle, kesit için birkaç blok hazırlanmalıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, 2 ila 3 saat içinde tek bir blok bölümü yapılabilir. Bu prosedürü denerken, selülozdaki kristal birikiminin, uzunlamasına bölümler tarafından belirlendiği gibi, selüloz mikrofibrillerinin benzer oryantasyonuna sahip olmaları durumunda hücreler arasında karşılaştırılabilir olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, Arabidopsis fidelerinin nasıl düzeltileceğini ve bunların bloklara nasıl yerleştirileceğini ve daha sonra uzunlamasına ve enine kök kesitlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamalısınız. Ayrıca polarize ışık mikroskobu kullanılarak elde edilebilecek veriler hakkında iyi bir fikir sahibi olmalısınız.