Name: Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme Arabidopsis Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin Arabidopsis köklerinde kristalin selüloz birikimini hücresel çözünürlükte nicelemek için polarize ışık teknolojisini kullanmayı. Bu yöntem bitki hücre duvarı bileşimi ve gelişim araştırmalarında doğrudan karşılaştırmalar yapmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. M. Rosenberg'e anatomik kesit alma konusundaki tavsiyesi ve yardımı için teşekkür ederiz. Ayrıca teknik yardımı için D. Eisler'e teşekkür ederiz. Bu araştırma, FP7-PEOPLE-IRG-2008, İki Uluslu Tarım Araştırma ve Geliştirme (BARD; IS-4246-09) ve İsrail Bilim Vakfı (ISF; 592/13).

1. Bitki Büyüme <ol><li> Yüzey tohumları sterilize edin. <ol><li> Islak ya da kuru bir yöntemle (30 mg kadar) tohum sterilize edin. Bir örnek olarak, kuru bir sterilizasyon yöntemi, en az 4 saat ve gece boyunca kadar kapalı bir kurutucuda bir cam beher içinde, 50 mi ağartıcı 1 ml buzlu HCI% 37 ekleyin. Bir kimyasal kaputu bu adımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS) ortamında% 0.8 bitki agar ile plakalar üzerinde steril tohumlarını yaymak. Parafilm veya gözenekli bantla plakaları sarın ve alüminyum folyo ile kapatın. </li><li> eşit bir şekilde çimlenmesine teşvik etmek için 4 gün 1 - 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. </li><li> Arabidopsis fide yetiştirmek için uygun bir büyüme odasına plakaları aktarın. agar ortamı üstündeki kök büyümesini sürdürmek için ve penetrasyonu önlemek için dikey tabak yerleştirin. </li><li> Aktarım fidanları çimlenme (DAG) 7 gün sonra sabitleştirici için. </li></ol> 2. Sabitleme <ol><li> 50 mi Richardson Solutio hazırlanmasıiki kez damıtılmış su içinde% 1 boraks (tampon maddesi),% 1 metilen mavisi ve% 1 Azure (histolojik boyalar) eşit hacimlerde bir araya getirilmesiyle n. Kullanmadan önce 0.22 mikron PVDF Filtre Ünitesi Driven bir Şırınga süzülür. </li><li> 0.05 M Sodyum kakodilat (tamponlama ajanı)% 1.25 Glutaraldehyde: fiksatif 50 ml hazırlayın. Not: Bu malzemeler toksik olan ve kimyasal bir kaput ele alınması gerekir. </li><li> Nihai sabitleme bir çözüm elde etmek sabitleme çözeltisine Richardson çözeltisi 100 ul (2.1 bakınız) (2.2) ekleyin. </li><li> Marka, karşılık gelen Örnek adı, 6 gözlü bir plakanın her bir. </li><li> fide, bir kez transfer tamamen sıvı ele alınacaktır, böylece kuyulara (2.3 bakınız) 3 ml nihai tespit çözümü - 2 yerleştirin. </li><li> Dikkatle her kuyuya 10 fidan kadar, forseps kullanarak, aktarın. Parafilm kullanarak plakaları Seal. En az bir gece için, ve bir haftaya kadar karanlıkta 4 ° C&#39;de saklayın,. </li></ol> 3. Dehidrasyon <ol> &lt;li&gt; fidan kurutmak. Burada yer alan gibi, etanol artan konsantrasyonlarda içeren, yeni 6-delikli plakalara arasında transfer:% 10 etanol, 15 dakika boyunca; 15 dakika boyunca% 30 etanol; 15 dakika boyunca% 50 etanol; 15 dakika boyunca% 70 etanol; 15 dakika boyunca% 85 etanol; 15 dakika boyunca% 95 etanol; gece boyunca, en azından 4 ° C,% 95 etanol. dikkatle plastik forseps ile tercih onların kotiledon, onları tutarak fidan tutun. </li></ol> 4. Sızma <ol><li> infiltrasyon ortamı hazırlayın. Küçük bir cam şişeye 50 mi bazik reçine sıvı kiti ile historesin kiti aktivatör 1 torbanın içeriği karıştırın. 20 dakika için mıknatıslı karıştırın. Sızma ortamının bir kaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Mark her gelen numune adıyla yeni bir 6-plaka kuyu ve 2 ile doldurun - infiltrasyon orta 3 ml. </li><li> forseps kullanarak sızma ortamına% 95 etanol çözeltisinden fidan aktarın. fidan fu olduğundan emin olunLly ortam ile kaplı. </li><li> Bitki dokularının içine maksimum nüfuz sağlamak için, en az 4 gün süreyle 4 ° C&#39;de depolayın. </li></ol> 5. Blok Hazırlık <ol><li> küçük etiketler, kalıp gömme her bir kuyu içinde, örnek adıyla kalem işaretli yerleştirin. </li><li> 15 ml sızma orta (4.1) 1 ml sertleştirici ekleyerek orta gömme hazırlayın. Polimerizasyon sorunları önlemek için, bir sesini daha küçük 15 ml hazırlamak için çalışmayın. </li><li> de 200 ul gömme ortamı ile kalıp içinde, her yarım doldurmak ve kalıp şekline kesilmiş bir üst filmi parçası ile kapak ama her iki tarafta, 1 mm daha büyük bir boyuta. polimerizasyonun izin vermek için, en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 5 saat aşmayın. </li><li> gömme orta ek bir toplu hazırlayın (5.2) ve kök uçları kalıp içinde düzenlenmiş edilirken polimerizasyonu önlemek için, buz üzerinde tutmak. </li><li> neşter kullanılarak bir diseksiyon kapsamında her kök ucu kesilmiş ve çok dikkatli bir i konumlandırmakT: dikey enine kesitler ya da yatay uzunlamasına kesit, yaklaşık 2 de - kalıp çeperine ile 3 mm. bir üst film ile çözelti ve kapağı bloke tamamen kalıp doldurun. o polimerize sonra engelleme çözümü biraz küçültmek unutmayın. </li><li> en azından 2 saat boyunca oda sıcaklığında saklayın. </li><li> blok kurutulması için, kuru silika jeli ile bir kutu içinde yer ve en azından, bir gece boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li></ol> 6. Kesit <ol><li> Bir bıçak makinesi ile cam çubuklar cam bıçak hazırlayın. Doku kesit cam bıçak kullanın. Bir kare içine cam çubuk kesin ve sonra bir elmas puanlama aracını kullanarak, iki bıçak üretmek için çapraz kare kesti. </li><li> Bir kesit makine kullanarak 3 mikron genişlik dilimleri, - 2 içine Bölüm blokları. su buharlaşana kadar - (60 ° C 50), yer distile su damlacıklarının üstünde bir bardak slayt dilimleri ve düşük ısı için ayarlanmış bir ısı bloğu üzerine slayt yerleştirin. </li></ol><ol><li> Orijinal çözeltisi% 0.2 Richardson çözeltisi (2.1) ile seyreltilir ve dilimleri kapsayacak şekilde 1 ml kullanın. 5 saniye için ısı bloğuna yerleştirilir ve daha sonra damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> sıcak bir plaka üzerinde slayt kurutun. Ilgi dilimleri konumunu belirtmek için mikroskop altında daha sonraki kimlik kolaylaştırmak için, bir diseksiyon kapsamında gözlemleyin ve bir işaretleyici ile slayt arka işaretleyin. </li><li> örtücü bir kılıfla montaj orta ve kapak 100 ul ekle. </li></ol> 8. Görüntü Alma <ol><li> Geciktirici bilgi ve polarize / girişim optik filtresi (Şekil 1 AD) elde etmek için uygun Polscope sistemi ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında kök bölümleri içeren kapalı slayt yerleştirin. </li><li> Numunenin tamamının açık görselleştirme sağlar seçin büyütme (örneğin, bu çalışmada 40X) ve mikroskop odakBlok bölümü ama hiçbir kök bölümü içeren boş bir alana e. Hiçbir lekeleri ile temiz bölge bulmaya çalışın. arka plan ayarlamak için bu bölgeyi kullanın. </li><li> görüntüleme sistemi ve yazılım parametreleri ayarlayın: Set aralığı 17 nm. (8.2) &quot;Otomatik Pozlama&quot; Uygula ve boş alandan arka plan görüntüsünü alın. Bir arka plan görüntüsü deney başına kullanılır. </li></ol> Selüloz Mikrofibril Oryantasyon 9. Polscope Analizi <ol><li> boyuna kesitlerin analizi. <ol><li> mikroskop altında boyuna kesitler içeren bir slayt yerleştirin ve bunun bir geciktirici görüntü elde. ilgi kök bölümünde mikroskop odaklanın. Yeni bir dosya adı sağlayın. </li><li> &quot;Canlı Abrio&quot; pencereden bir Abrio görüntüsü (retardasyon bilgilerle görüntü) yakalayın. Şekil 2C&#39;de gösterildiği gibi, hücre çevresi boyunca çalışan lekeli selüloz belirlenebilir hücre duvarı içeren bir bölümünü içine almak için edin.</li></ol></li><li> Görüntü analizi. <ol><li> görüntü yığını ilgili resmin üzerine çift tıklayın. &quot;Ekran Ayarları&quot; sekmesinde &quot;Oryantasyon Sözde rengi&quot; i seçin. </li><li> Selüloz mikrofibril açısını tahmin etmek için, renk çarkı bu hücre duvarının karşılık gelen gölge eşleşir. Not: Şekil 2C&#39;de renk çarkı mikrofibrillerin uzun ekseni boyunca yönünü gösterir mikrofibril boyunca uzanan ışık yavaş ekseni yansıtır. selüloz mikro-iplikçiklerinin açısı renk ve hücrenin uzun ekseni ile gösterilen açıdır. Örneğin, içerlek uzayan hücre hücrelerinin uzun eksenine yaklaşık 90 ° eğimli cam göbeği renkli gösterir. </li><li> Hücre duvarının ortalama mikrofibril açısını ölçmek için, yazılımın araç çubuğundan &quot;geciktirici ve Azimut Damgası&quot; aracını kullanın. aracı, noktayı seçerek ve süre elde edilen görüntüde ilgilenilen bölgeye tıklayın. NOT: Bu wilderece açı (azimut) (Şekil 2C) ekranında l sonucu. </li><li> eklenti menüsünden alternatif erişime açık polarize ışık görüntü analiz yazılımı, öğle yemeği &quot;Pol-Analyzer&quot; eklentisi. Yeni açılan pencerede, &quot;Birefringence&quot; sekmesini ve açık seçin ve ardından arka plan dosya ve resim dosyası kaydedin. </li><li> Görüntü penceresinde, &quot;Özellikleri&quot; i seçin. ve (bu çalışma için kullanılması 5 piksel) &#39;YG piksel boyutunu&#39; ayarlayın. &quot;Özelliklerin.&quot; Içinde pencere seçin &quot;Sonuç tablosunda göstermek değerler&quot;. </li><li> Görüntü penceresinde ilgi bölgeyi işaretlemek için Poligon aracını kullanın. selüloz mikrofibril yönünü elde etmek için &quot;Oryantasyon Lines&quot; seçeneğini seçin. Not: Bu derece açı (azimut) ekranında neden olur. NOT: Her iki yöntemden biri ile hesaplanan ortalama açısı daha sonra slayt üzerinde kök bölümünün konumlandırılması normalize edilmelidir. sapma düzeltmek içinslayt boyunca bütün kök bölümünün yatay konumlandırma, (o bölüme dik ve kök büyüme ekseni, Şekil 2C boyunca olduğu) uzun ekseni boyunca hücreyi kuşatan hücre duvarının ortalama mikrofibril açısını ölçmek. Kök bölümü doğru slayt boyunca yerleştirilmiş olduğunda bu açı 180 ° &#39;dir. mikrofibril açısını hesaplamak için, 180 ° &#39;den sınırdaş hücre duvarının ortalama ölçülen mikrofibril açısını çıkarın. slayt üzerine düz yatıyor hücre duvarının ortalama ölçülen mikrofibril açısına sonuçlandı farkı ekleyin. </li></ol></li></ol> Kristalin selüloz Birikimi 10. Polscope Analizi <ol><li> enine (çapraz) bölümleri kullanın. bunların selüloz mikrolitler benzer açıyla sıralanması durumunda (9 belirlenen) bu kristal selüloz birikim hücreler arasında karşılaştırılabilir okuyabilir. </li><li> görüntü yığını ilgili resmin üzerine çift tıklayın. Seç &quot;PEkran Ayarları &quot;sekmesinden&quot; in &quot;renk seudo. </li><li> geciktirici ölçmek için. Zoom-in resmin üzerine. &quot;Bölge&quot; i seçin ve ilgi tüm bölgeleri işaretleyin. Tüm değerleri &quot;Panoya kopyala&quot; &quot;ölçümleri&quot; sekmesine ve taşıyın. <ol><li> Excel&#39;e veri aktarımı ve gerekli bilgileri (geciktiricili bölgesini ortalama) ayıklayın. veri normalleştirmek. NOT: dilimler arasındaki kalınlık farklılıkları hesaba slayt belirli bir hücre duvarı kenarına göre değerlerini ifade etmek için. normalleştirmek için, aynı görüntüde farklı bir hücre duvarının ortalama geciktiricili tarafından ilgiyle hücre duvarına karşılık gelen ortalama geciktirici bölün. Örneğin dış epidermal hücre duvarı çalışmamızda iç kortikal hücre duvarı göre normalize edildi. </li></ol></li><li> Örnek başına 3 köklerinin en az, kök başına en az 3 bölümler için ölçümler tekrar edin. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li>
<li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li>
<li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM%2C+XRD%2C+NMR+and+acid+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresources%22%5BJournal%5D)">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li>
<li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling%2C+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li>
<li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.+A-2%3A+Polymer+Physics%22%5BJournal%5D)">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li>
<li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li>
<li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Arabidopsis+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li>
<li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li>
<li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control%3A+brassinosteroid+activity+gets+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li>
<li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li>
<li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li>
<li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Anatomik bilgi korurken Burada, Arabidopsis kökleri oluşturan farklı dokularda kristalin selüloz birikmesine tayini için bir yöntem sunulmaktadır. Bu nedenle, bir selüler çözünürlükte bitki büyüme süreçlerinin anlaşılması yönünde bir adım içerir. Bu yöntem, aynı zamanda, ek bitki türleri ve organların çalışma için uygulanabilir. yöntemi uygulanırken noktalarının sayısı dikkate alınmalıdır. Belirli bir kök bölümü ilk, kristalin selüloz birikimi bunların selüloz mikro-iplikçiklerinin ...

bitki hücre duvarı dinamik bir yapıdır. Büyüyen hücreleri hücreler genişletmek için izin veren kuruluş olan birincil hücre duvarı ile çevrilidir. depozito bitkinin mekanik destek geliştiren bir daha sert ikincil duvar büyümeye ateşkes Hücreler. Her iki hücre duvarları, farklı gelişim aşamasında arasında değişir ve 1,2 dokular farklı yapılarda (örneğin, hemiselüloz ve pektini) polisakaridlerinin bir matris içine gömülü, selüloz mikro-iplikçiklerinin oluşmaktadır. Selüloz sıkı bir kristalin yapısının mikrofibril oluşturulması için hizalanır (1,4) -β-D-glukan zincirleri olarak sentezlenir. Amorf selüloz glukan zincirleri daha sıralanır bölgeleri belirtir. Kristalin ve amorf alan arasındaki oran, mekanik mukavemet ve viskoelastik özelliklerini sırasıyla 3 sağlayarak hücre duvarının mekanik özelliklerini etkilediği düşünülen bir parametredir. Çeşitli yöntemler olmuşturX-ışını kırınımı ve çapraz polarizasyon / solid-state NMR 4 iplik sihirli açı algılamak ve aralarında selüloz düzenlemesinin iki formlarını ölçmek için geliştirdi. X-ışını difraksiyon numunesi 5 amorf selüloz etki karşı kristalin oranını belirlemek için kullanılabilir. Alternatif bir yöntem, sırasıyla, kristalin ve amorf selüloz ya da başka polimerler arasında ayrım, asit çözünmeyen ve asit çözünür malzeme içine hücre duvarı içeriği fraksiyonasyon kullanır. Bu yaklaşımda, işaretlenmiş glukoz ([14C] glukoz) eklenmesi, selüloz, 6,7 ölçmek için kullanılır. Bu yöntemler, en iyi tüm organ analizi için, bitki malzemesi, büyük hacimli gerektirir ve bu nedenle, hücre duvarı yapısına, doku spesifik varyasyona yetersiz duyarlıdır. Hücresel bir çözünürlükte selüloz mikro-iplikçiklerinin Görselleştirme değişiklikleri tespit olabilir, floresan boyalar ile birlikte 8,9 canlı görüntüleme çalışmaları elde edilebilirselüloz mikro-iplikçiklerinin yönelimi. Bununla birlikte, bu boyalar, miktar tayini için kullanılır, bu selüloz, kristal halindeki özgü değildir ve hücre duvarının 8 normal yapısına müdahale edebilir. Polscope ışık ışınlarını bölünmüş ve ışığı 10 bir kısmını geciktirmek için kristalli selüloz yeteneğine dayanan bir görüntüleme tekniğidir. Işık geriliği ışığı yayılma yönüne dik yalan mikrolitlerin en güçlü olduğu. Benzer bir yönlendirme ile mikro-iplikçikler, ışık geciktirici 11 daha büyük bir kristallik derecesi artar. Bu nedenle, polscope bağıl seviyelerde ve selüloz mikro-iplikçiklerinin yönünü hem de incelemek için kullanılır. Hızla 12 genişletmek önce kökleri, hücre bölünmeleri bir dizi geçmesi, hücreler kök ucunda, kök hücre niş de kaynaklanan sırasında doğrusal bir büyüme sergilemektedir. kök içeren hücreler, bir tek yönlü (anizotropik) genişletmekşekilde, hücre duvarının 13 özelliklerini etkileyen küçük molekül sinyal hormonlar tarafından dikte edildiği gibi. Hormonlar Diferansiyel yanıtları, zaman ve mekan içinde, dengeli bir organ büyümesi 14 sağlamanın bir araç sağlar. Bu nedenle, hücre duvarı yapısının yüksek çözünürlüklü analizi daha iyi tüm organ büyümesine hücre tipine spesifik yanıtlar arasındaki bağlantıyı anlamak için gerekli önemli bilgiler sağlayabilir. Burada, yüksek kaliteli, anatomik bölümlerde görüldüğü gibi Arabidopsis kökleri kristalli selüloz dokuya özel birikmesini çalışma polscope uygulanmasını rapor etmektedir. Bu yöntem, en son hormon aktivitesi 15 uzaysal pertürbasyon yanıt olarak kristalli selüloz hücre tipine spesifik birikimi ortaya çıkardı.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Boraks</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Tahrikli 0.22 mm PVDF Filtre&nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Kakodilat</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kiti historein&nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>gömme kalıpları</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>filmi 100 & mikro; P.P.C.&nbsp;</td><td></td><td></td> www.Jolybar.com <td>tepegöz filmi</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp;</td><td>Termo</td><td>9990402</td><td>montaj ortamı</td></tr><tr><td>ışık mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio görüntüleme sistemi</td><td>CRI</td><td>Abrio görüntüleme sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 yazılımı</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2 yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Açık erişim polarize ışık görüntü analiz yazılımı &nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

kristalin selüloz birikimin yüksek Çözünürlüklü niceleme<em&gt; arabidopsis</em&gt; kökler doku spesifik hücre duvarı değişiklikler monitör

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Bitki hücreleri, bileşimi nihai boyutlarını ve şekillerini belirleyen bir hücre duvarı ile çevrilidir. Hücre duvarı, hem kristal yapıları hem de amorf organizasyonun selüloz zincirlerini oluşturan selüloz mikrofibrillerini içeren polisakkaritler içeren karmaşık bir matristen oluşur. Selüloz liflerinin oryantasyonu ve konsantrasyonları, hücrenin mekanik özelliklerini belirler. Kristalli selüloz seviyelerini belirlemek için her biri hem avantajlar hem de sınırlamalar getiren çeşitli yöntemler kullanılır. Bazıları, toplam selüloz içindeki kristal bölgelerin oranını ayırt edebilir. Bununla birlikte, uzay-zamansal bilgide eksik olan tüm organ analizleriyle sınırlıdırlar. Canlı görüntülemeye dayanan diğerleri, kesin olmayan boyaların kullanımıyla sınırlıdır. Burada, Arabidopsis thaliana köklerinin enine kesitlerinde kristalin selüloz birikimini temsil eden, bağıl ışık geciktiricinin spesifik miktar tayini için hassas bir polarize ışık tabanlı sistem rapor ediyoruz. Bu yöntemde, hücresel çözünürlük ve anatomik veriler korunur ve büyüyen kökü oluşturan farklı dokular arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılır. Bu yaklaşım, hücre duvarı bileşimi, hücresel davranış ve tüm organ büyümesi arasındaki bağlantıya ışık tutan yeni bir analitik boyut açar.

Bir model, bir organ 15-17 olarak Arabidopsis kök kullanılarak brassinosteroidlerin (BR) için hücre tipine spesifik yanıtların etkisini incelemek. BR reseptör BRI1 hedeflendiğinde, olmayan saç hücreleri olarak adlandırılan epidermal hücrelerin bir alt kümesi (Şekil 2A, B), bu tek yönlü bir komşu hücrelerin hücre genişlemesi ve bütün kök büyüme 15 inhibe etmek bri1 mutantının arka bölgesi. Polscope analizi bu inhibisyonu altında yat...

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur. Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Bu anatomik kesit hazırlığının genel amacı, primer Arabidopsis kökündeki farklı dokular arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılmasına olanak tanıyan hücre çözünürlüğünde göreli kristal ve selüloz birikimini miktarlaştırmaktır. Bu yöntem, belirli bir hücre tipinin hücresel kompozisyonunun tüm organın büyümesini nasıl etkilediği gibi bitki fizyolojisi ve gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Arabidopsis tohumlarını metin protokolüne göre sterilize ettikten sonra, steril tohumları %0,8 bitki agarı ve 0,5X M ortamı içeren plakalara yayın.Plakaları parafilm ile sarın ve alüminyum folyo ile kapatın. Germinasyonun tekdüzeliğini sağlamak için plakaları 4 °C'de bir ila dört gün boyunca saklayın. Ardından, kök büyümesinin agar besiyeri üzerinde devam etmesini sağlamak için plakaları dikey olarak konumlandırarak, Arabidopsis fidelerini yetiştirmeye uygun bir büyüme odasına aktarın. Richardson çözeltisini metin protokolüne göre hazırlayın. Kullanmadan önce şırınga yardımıyla 0,22 micron PVD filtre ünitesinden süzün.Ardından bir kimyasal çeker ocuk altında, 38 ml 0.5M sodyum kakodilat ile 2,5 ml glutaraldehiti birleştirerek 50 mililitre fiksatif hazırlayın. Daha sonra, nihai fiksasyon solüsyonunu oluşturmak için fiksasyon solüsyonuna 100 mikrolitre Richardson çözeltisi ekleyin. Önceden işaretlenmiş bir plaka kullanın ve solüsyonun fideleri tamamen kaplamasını sağlamak için kuyucuklara 2 ila 3 ml nihai fiksasyon solüsyonu yerleştirin.Plastik pens kullanarak her bir kuyucuğa dikkatlice 10 adede kadar fide aktarın. Plakaları, en az bir gece ve bir haftaya kadar 4 °C'de karanlıkta saklamadan önce mühürlemek için parafilm kullanın. Tespit edilen fideleriyehidrate etmek için, bitkileri pensle gövdelerinden tutarak alın ve burada belirtilen süreler boyunca artan konsantrasyonlarda etanol içeren yeni işaretlenmiş altı kuyucuklu plakaların kuyucuklarına aktarın.Bir paket Historesin Aktivatör içeriğini 50ml temel reçine sıvısı ile karıştırarak küçük bir cam şişede infiltrasyon ortamını hazırlayın. Bir mıknatıs yerleştirin ve çözeltiyi karıştırıcı plaka üzerinde 20 dakika boyunca karıştırın. Altılı kuyucuklu bir plakanın etiketlenmiş kuyucuklarını 2 ila 3 ml infiltrasyon ortamı ile doldurun.Ardından, fideler tamamen dehidre olduğunda, bir pens yardımıyla onları %95 etanol çözeltisinden infiltrasyon ortamına aktarın ve ortam tarafından tamamen kaplandıklarından emin olun. Bitki dokularına maksimum penetrasyonun sağlanması için numuneleri en az dört gün boyunca 4 °C'de saklayın. Blokları hazırlamak için, her bir gömme kalıbının içine numune adı kurşun kalemle yazılmış küçük etiketler yerleştirin.15 ml infiltrasyon ortamına 1 ml sertleştirici ekleyerek gömme ortamını hazırlayın. Kalıptaki her bir kuyucuğun yarısını yaklaşık 200 mikrolitre gömme ortamı ile doldurun. Ardından, her iki yanına fazladan 1 ml ekleyerek kalıbı üstten bir film parçasıyla kapatın.Kısmi polimerizasyonun gerçekleşmesi için kalıpları oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Ardından, kök uçları kalıba yerleştirilirken polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tutarak ek bir gömme ortamı serisi hazırlayın. Küçük bir plakaya gömme ortamı ekleyin ve her bir ortama bir adet fide yerleştirin.Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir skalpel kullanarak her bir kök ucunu kesin; ardından, transfer kesitleri için dikey veya boyuna kesitler için yatay olacak şekilde, kalıp çevresinden yaklaşık 2 ila 3 mm uzağa çok dikkatli bir şekilde yerleştirin. Dokuyu yerleştirdikten sonra, kalıbı tamamen doldurmak için gömme ortamı kullanın ve üzerini bir üst filmle kapatın. Ardından, en az iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Blokları kurutmak için, kuru silika jel içeren bir desikatöre yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.Elmas çizme uca sahip bir bıçak hazırlayıcı kullanarak, cam çubukları önce kare şeklinde kesip ardından bu kareyi çaprazlamasına ikiye bölerek cam bıçaklar hazırlayın. Her iki bıçağın da kenarlarının keskin olduğunu doğrulayın. Bir bloğu tutucuya yerleştirin.Ardından, piramit şeklinde bir form elde etmek için tek ağızlı endüstriyel bir bıçakla, kök ucundan bir mm uzağa kadar olan fazla blok materyalini temizleyin. Şekillendirilmiş bloğu 2 ila 3 mikron genişliğinde dilimlere ayırın ve dilimleri işaretlenmiş bir cam lame üzerine aktarın. Daha sonra dilimlerin üzerine su damlacıkları ekleyin.Analiz edilen verilerdeki değişkenliği en aza indirmek için genişlikleri tekdüze olan kesitler hazırlamak önemlidir. Su buharlaşana kadar cam lamları düşük ısıya ayarlanmış ısıtıcı blokların üzerine yerleştirin. Polarize mikroskop altında incelemek üzere lamlar hazırlamak için Richardson solüsyonunu orijinal solüsyonun %2'si olacak şekilde seyreltin ve kesitleri kaplamak için yaklaşık 1ml kullanın.Ardından örnekleri 5 saniye boyunca ısıtma bloğuna yerleştirin ve yıkamak için distile su kullanın. Lamlar sıcak plakada kuruduktan sonra kesitleri bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin ve ilgilenilen kesitlerin konumunu belirtmek için lamın arka tarafını bir markörle işaretleyin. Lamel ile kapatmadan önce 100 microliters kaplama ortamı ekleyin.Metin protokolüne göre görüntüleme ve analiz yapın. Burada, tüy hücresi olmayan hücreler, tüy hücreleri ve korteks dahil olmak üzere bileşen hücrelerinin ve dokularının radyall organizasyonuna sahip bir Arabidopsis birincil kökünün kesit gösterilmiştir. Bu konfokal görüntü, komşu hücrelerin tek yönlü genişlemesini ve tüm kök büyümesini inhibe eden bir BRI1 mutant arka planında, tüy hücresi olmayan hücrelerdeki BRI1-GFP ekspresyonunu göstermektedir.Burada görüldüğü üzere, yabani tip ve tüy hücresi olmayan hücrelerde BRI1 eksprese eden hatlardan elde edilen köklerin boyuna kesitleri, meristematik hücrelerde geçiş bölgesindeki hücrelere kıyasla mevcut olan yüksek açı değişkenliği ile benzer bir selüloz mikrofibril yönelimi sergilemiştir. Bu durum, burada enine kesitlerde gösterildiği gibi, iki genetik arka planın karşılıklı meristematik ve uzayan hücrelerinde kristal selülozun göreceli birikiminin karşılaştırılmasına olanak tanır ve tüy hücresi olmayan hücrelerdeki BRI1 ekspresyonu ile yüksek yerel kristal selüloz birikimi arasında bir korelasyon olduğunu ortaya koyar. Genel olarak videolarda, gömme prosedürü sırasında iyi yönlendirilmiş kökler elde etmek zor olduğu için bu yönteme yeni başlayanlar zorluk yaşayacaktır.Bu nedenle, kesit alma işlemi için birkaç blok hazırlanmalıdır. Yöntem uzmanlaşmış olduğunda, tek bir blok kesiti 2 ila 3 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, boyuna kesitlerle belirlendiği üzere, selüloz mikrofibrillerinin yönelimleri benzer olan hücrelerde selüloz içindeki kristal birikiminin karşılaştırılabilir olduğunu hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra Arabidopsis fidelerinin nasıl fikse edileceği, bloklara nasıl gömüleceği ve ardından boylamsal ile enine kök kesitlerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca polarize ışık mikroskobunun kullanımından elde edilebilecek veriler hakkında kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Etiket lignin bitki hücre duvarlarında görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması sağladığını konfokal Raman mikroskobu dayalı bir yöntem sunulmaktadır.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Bu videoda, bir dikot bitkisi olan Arabidopsis thaliana'nın hücre duvarlarında selüloz birikimini görselleştirmek için, UV ışığı altında floresan sergileyen ve β bağlı glukanlara özel olarak bağlanan kalkoflor beyazı kullanarak bir boyama prosedürünü açıklıyoruz.

Calcofluor Beyaz Boyama: Dikot Bitki Gövdesi Bölümlerinin Hücre Duvarlarındaki Selüloz Birikintilerinin UV Kaynaklı Floresan Görselleştirmesi için Basit Bir Yöntem

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bitki dokularının mekanik özelliklerini haritalamak için bir yöntem açıklıyoruz. Bitki gelişimi sırasında hücre duvarlarında meydana gelen mekanik değişikliklerin geniş alan orta ölçeğinde nasıl kaydedileceğine odaklanıyoruz ve bu değişikliklerin büyüme ve morfogenez ile ilişkilendirilmesini sağlıyoruz.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

Bitki hücre duvarı bileşimi doku tipleri arasında farklılık gösterir ve lignin, selüloz, hemiselülozlar ve pektin içerebilir. Hücre tipi düzeyindeki farklılıkları görselleştirmek için çeşitli boyama teknikleri geliştirilmiştir. Bu makale, yaygın olarak kullanılan hücre duvarı boyama tekniklerinin bir derlemesidir.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.

Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Öğrenin Arabidopsis köklerinde kristalin selüloz birikimini hücresel çözünürlükte nicelemek için polarize ışık teknolojisini kullanmayı. Bu yöntem bitki hücre duvarı bileşimi ve gelişim araştırmalarında doğrudan karşılaştırmalar yapmayı sağlar.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme

Daha fazla video keşfet