SALVI ve TOF-SIMS tarafından Su Sönmüş Proteinlerin In Situ Karakterizasyonu içinde

Bu prosedürün genel amacı, Sıvı Vakum Arayüzünde Analiz Sistemini ve uçuş süresi ikincil iyon kütle spektrometresini kullanarak sulu çözeltilerde adsorbe edilmiş protein filmlerini karakterize etmektir. Bu yöntem, biyomoleküller ve biyoarayüz ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, katı bir yüzeyde adsorbe edilen proteinlerin karakterizasyonu.

Bu tekniğin temel avantajları, biyomoleküllerin sıvı ortamda yerinde ve moleküler haritalama ile kombinasyon halinde başlatılabilmesidir. Bu yöntem, katı-sıvı arayüzündeki biyomoleküller hakkında bilgi sağlayabilse de, tek kanser hücrelerinin araştırılması, ilaç etkileşimleri ve biyofilmlerin bağlanması dahil olmak üzere diğer sistemlere de uygulanabilir. Beş mililitrelik bir şırıngaya,% 70'lik bir etanol çözeltisinden iki mililitre çekin.

Şırıngayı SALVI cihazının giriş ucuna bağlayın ve 10 dakika boyunca bir mililitre sıvıyı yavaşça enjekte edin. Enjeksiyonun sonunda, şırıngayı çıkarın ve bir polieter-eter-keton birleşimi kullanarak SALVI'nin giriş ve çıkışını bağlayın. %70 etanol çözeltisi ile doldurulmuş SALVI mikro kanalını oda sıcaklığında dört saat tutun.

Ardından, ikinci bir şırıngayı steril deiyonize su ile doldurun. SALVI'nin girişine bağlayın ve deiyonize suyu 10 dakika boyunca cihaza yavaşça enjekte edin. Şırıngayı çıkarın ve cihazın giriş ve çıkışını yeniden bağlayın.

Bir protein filmini hareketsiz hale getirmek için, iki mililitre fibronektin çözeltisini bir şırıngaya çekerek başlayın. Şırıngayı SALVI cihazının girişine bağlayın ve 10 dakika boyunca bir mililitre sıvıyı yavaşça enjekte edin. Ardından, şırıngayı çıkarın ve girişi ve çıkışı tekrar bağlayın.

Kurulumu temiz bir kültür kabında oda sıcaklığında 12 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 10 dakika boyunca bir mililitre steril deiyonize suyu yavaşça enjekte edin ve ardından girişi prize yeniden bağlayın. Başlamak için ToF-SIMS sahnesini düz ve temiz bir yüzeye yerleştirin.

SALVI cihazını, silikon gofret ve silisyum nitrür membran yukarı bakacak şekilde sahneye koyun. Dört metal sıkıştırma parçası kullanarak SALVI cihazını sahneye sabitleyin ve cihazın köşesini tutan metal parçaları dört vidayla metal plakaya vidalayın. Ardından, mikroakışkan kanala bağlı PFTE tüpünü yavaşça sarın.

Sert parçayı aşağıda tutmak için dört metal parça ve dört vida kullanın. Cihazın, analiz sırasında birincil iyon ışınına müdahale etmemesi için sahne alanındaki açık alana yerleştirildiğinden emin olun. Ardından, Faraday bardağını bir vida kullanarak sahneye monte edin.

Ardından, ToF-SIMS yük kilidi kapısını açın ve kapıyı kapatmadan önce sahneyi yükleme platformuna yatay olarak ayarlayın. Vakum pompasını açın ve yük kilidi odasının yaklaşık 10 ila eksi altıncı milibara kadar pompalanmasına izin verin. Ardından, vakum stabilize edildikten sonra SALVI cihazını yaklaşık 30 dakika sonra ana hazneye taşıyın.

Üreticinin önerdiği protokolü izleyerek yaklaşık 400 nanometrelik bir uzamsal çözünürlük elde etmek için ToF-SIMS'in birincil iyon ışınını ve analizörünü ayarlayın. Ardından, optik mikroskobu kullanarak mikroakışkan kanalı bulun. Optik görüntü merkezini referans olarak kullanın ve ikincil iyon görüntü merkeziyle tutarlı olacak şekilde hizalayın.

Bu adımın görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü öğrenmesi zordur, çünkü numune normal katı numunelerden daha kalındır ve kanalın en iyi odağını bulmak için ayarları yapmak zordur. Her ölçümden önce, yüzey kirlenmesini gidermek için silikon nitrür penceresini yaklaşık 15 saniye taramak için bir kiloelektronvolt oksijen ışını kullanın. Ayrıca, tüm ölçümler sırasında yüzey şarjını telafi etmek için bir elektron sel tabancası kullanın.

Ardından, veri toplamaya başlamadan önce pozitif veya negatif modu seçin. Tüm ölçümlerde birincil iyon ışını olarak 25 kiloelektronvolt bizmut üç artı kullanın. Derinlik profili oluşturma için, birincil iyon ışınını 32 piksele 32 piksel çözünürlüğe sahip yaklaşık iki mikrometre çapında yuvarlak bir alanda tarayın.

Silisyum nitrür membranı delmek için gereken süreyi en aza indirmek için, uzun darbe genişliğinde bir birincil iyon ışını kullanın. Silisyum nitrür membran delindikten sonra, iki boyutlu görüntü rekonstrüksiyonları için yeterli veri elde etmek için aynı akımı yaklaşık 200 saniye tutun. Veri toplama için, daha iyi kütle çözünürlüğüne sahip spektrumlar elde etmek için darbe genişliğini 80 nanosaniyeye düşürün.

Bu satın alma işlemine yaklaşık 200 saniye daha devam edin. SALVI mikroakışkan arayüzünü kullanarak, birincil iyon ışını doğrudan hidratlı fibronektin filmi üzerinde bombardıman edebilir. Bir dizi su kümesi ve amino asit fragmanı, ToF-SIMS kütle spesifikasyon verileri ile gösterilir.

Bu, hidratlı protein moleküllerini çevreleyen ve içindeki su moleküllerinin özelliğine dair doğrudan kanıt sağlar. Burada, hidratlı fibronektin filmin ve deiyonize suyun derinlik profili zaman serileri görülebilir. Seçilen ikinci iyonların yoğunlukları, silisyum nitrür membran delinmeden önce ihmal edilebilir düzeydedir.

Silisyum nitrür membran delindiğinde, ikincil iyonların yoğunlukları önemli ölçüde artar. Kısa darbe genişliği işlemi, görüntü ve spektrum rekonstrüksiyonları için daha iyi kütle çözünürlüğüne sahip veriler elde etmek için kullanılır. Hidratlanmış fibronektin filminden ve deiyonize sudan alınan 2 boyutlu görüntüler, numuneden seçilen ikincil iyonların sayımlarını temsil eder.

Görüntü ne kadar parlaksa, ikincil iyon sayısı o kadar yüksek olur. Bu sezgisel görüntüler, veri analizinde yardımcı olan farklı numuneler arasında seçilen ikincil iyonların net bir karşılaştırmasını sağlar. Bu prosedürü denerken, bir mikroreaktörün vakum odasına monte edilmeden önce sızdırmaz olması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu teknik, biyoloji ve biyoarayüzler alanındaki araştırmacıların protein adsorpsiyonu, biyofilm bağlanması, yüzeye monte tek tabakalar ve diğer birçok fenomeni keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, SALVI ve sıvı ToF-SIMS kullanarak çeşitli sıvı örneklerini nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.