Fare Beyin Dilim Hazırlık içinde nöbet benzeri Faaliyet doğrudan akım Stimülasyon ve Multi-elektrot Dizi Kaydı

Bu deneysel prosedürün genel amacı, bir beyin kesitinin doğrudan akım stimülasyonu için kayıt odasındaki elektrot düzenlemesine ve bunun çok elektrotlu bir dizi ile kaydedilen nöbet benzeri aktivite üzerindeki etkisine erişmektir. Bu, doğrudan akım stimülasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına ve fare beyin kesitinde çok elektrotlu bir dizi ile kaydedilen nöbet benzeri aktivitenin anlaşılmasına daha iyi yardımcı olabilir. Bu tekniğin bir avantajı, doğrudan akım stimülasyonunun etkilerinin fare beyin kesitinin spesifik yolaklarında değerlendirilebilmesidir.

Prosedürü, laboratuvarımdan teknisyenler Hsiang Chin ve Wei-Jen Chang uygulamalı olarak gösterecekler. Bu prosedürde, deneyden önce tüm cerrahi aletleri %75 etanol çözeltisi ile sterilize edin. Ardından, hayvanın kafatasını açığa çıkarın ve kalan kas dokularını temizleyin.

Ardından, rongeur kullanarak kafatasının dorsal yüzeyini soyun ve yan kısımları kesin. Sonrasında, bir spatula yardımıyla, beyni çıkarmadan önce olfaktör bulbları ve beynin ventral yüzeyi boyunca uzanan sinir bağlantılarını kesin. Beyni hızla, buz gibi soğuk, oksijenlendirilmiş ACSF ile dolu bir behere aktarın.

MT-ACC yolunu içeren kesitler hazırlamak için, subkortikal anatomiyi göstermek amacıyla her bir hemisferde orta hattın 2 mm lateralinden sagittal bir kesi yapın. Ardından, striatumdaki görünür lif demetine paralel, açılı bir çapraz kesi yapın. İkinci açılı çapraz kesiyi, serebellum ile görsel korteks arasındaki bağlantıdan, talamus singulat yolunun ventralinde ve ona paralel olan anterior komissür ile optik traktus arasındaki orta noktaya doğru yapın.

Ardından, beyin bloğunu bir siyanoakrilat yapıştırıcı ile açılı bir plakaya sabitleyin. Yolun dönüş noktasının hemen üzerinden bir kesik atın. Daha sonra plakayı açın, düzleştirin ve bir vibratomun hazne tablasına yapıştırın.

Ardından, beyin kesitlerini 500 micrometers kalınlığında dilimleyin ve buz gibi soğuk, oksijenlendirilmiş ACSF içinde tutun. Bir kesiti, bir saat boyunca oksijenlendirilmiş ACSF'nin sürekli perfüzyonuyla 32 degrees Celsius sıcaklıktaki kayıt haznesine aktarın. Çok kanallı sistem üzerindeki MEA probunun yerleşimini doğrulayın.

Bir tüpü ACSF'yi MEA haznesine yönlendirmek için, diğer tüpü ise ACSF'yi hazne dışına aktarmak için kullanın. Hazırlığı, 30 °C'de ısıtılmış ve oksijenle zenginleştirilmiş ACSF ile sürekli perfüze edin. Islak bir pamuklu çubuk yardımıyla bir beyin dilimini MEA üzerine transfer edin.

Beyin kesitini, ACC'yi elektrotların üzerine gelecek şekilde dikkatle hareket ettirin; ardından, kesit ile elektrotlar arasında iyi bir elektriksel bağlantı sağlamak için beyin kesitini bir kesit sabitleyici ile sabitleyin. Sonrasında, anot elektrodunu ACC'ye proksimal, katot elektrodunu ise ACC'ye distal olarak yerleştirin. MEA'nın iki alan yönelimiyle alan şiddetini kaydedin.

Ardından, bir stimülatör kullanarak elektrik akımlarını uygulayın. İki gümüş klorür elektrot arasındaki mesafeyi yaklaşık 1,5 ila 2 cm olacak şekilde ayarlayın ve stimülatörün akım şiddetini, DCS'yi 0,5 ile 2 miliamper arasında tutacak şekilde ayarlayın. Bu prosedürde, MT'ye bir tungsten elektrot yerleştirin ve stimülatörden kesitin talamik bölgesine darbeler gönderin.

Ardından, ACC yanıtını tetikleyen eşiği belirlemek için çeşitli akım şiddetleri kullanın. Optimal yanıt profilini elde etmek için tungsten elektrodu talamus singulat yolu boyunca hareket ettirin. 1-20 arası ACC yanıtı kaydedin ve MT stimülasyonu ile uyarılan tüm ACC yanıtlarının otomatik olarak ortalamasını almak için yazılımı kullanın.

Nöbet benzeri aktiviteyi indüklemek için, perfüzyon solüsyonuna 250 micromolar 48P ve 5 micromolar bikukulin ekleyin ve kesiti iki ila üç saat boyunca perfüze etmeye devam edin. pH gradyanı oluşumunu önlemeye yardımcı olması için pompayı nispeten hızlı bir perfüzyon hızında tutun. Ardından, tungsten elektrodu MT'ye yerleştirin ve bir ACC yanıt profili elde etmek için elektriksel stimülasyon uygulayın.

10-20 tarama kaydedin ve yanıtların ortalamasını alın. Ardından, ilaçları temizlemek için füzyon öncesi çözeltiyi taze ACSF ile değiştirin. Bu prosedürde, MEA odasına yerleştirilmiş iki paralel gümüş klorür kaplı gümüş tel arasından akım geçirerek homojen elektrik alanlarının oluşmasını sağlayın.

Herhangi bir sorun yoksa, DCS 0,5 ile 2 miliamper arasında kalmalıdır. Ardından, DCS'yi kapatın ve talamusu bir tungsten elektrot ile uyarın. ACC'de maksimal sinaptik yanıtlar elde etmek için 10-20 yanıt kaydedin ve ardından bunların ortalamasını alın.

Ardından, DCS'yi açın ve eş zamanlı olarak talamusu stimüle edin. DCS sırasında, talamik stimülasyonla uyarılan ACC yanıtının amplitüd değişimlerini değerlendirin. Şimdi DCS'yi kapatın, perfüzyon solüsyonuna 250 micromolar 48P ve 5 micromolar bikukulin ekleyin ve 2-3 saat bekleyin.

İlaçlar beyin kesiti üzerinde etkili olursa, kesit kortikal nöbet yanıtları üretmelidir. Ardından, 10-20 anterior singulat kortikal yanıt toplayın ve elektriksel olarak uyarılan kortikal nöbet yanıtlarının amplitüdünü ve süresini ölçün. Sonrasında, DCS'yi açın ve eş zamanlı olarak talamusu uyarın.

DCS uygulaması sırasında uyarılmış kortikal nöbet yanıtlarının amplitüdündeki ve süresindeki değişiklikleri değerlendirin. Ardından, ilaçları uzaklaştırmak için perfüzyon solüsyonunu taze ACSF ile değiştirin. Bu şekil; ACC'deki talamik stimülasyonla uyarılmış yanıtları, ilaç kaynaklı nöbet benzeri aktiviteyi ve hem talamik stimülasyon hem de ilaç kaynaklı nöbet benzeri aktiviteyi içeren farklı uyarılmış yanıtları göstermektedir.

Bu şekil, elektrik alanındaki farklı yönelimler gibi DCS'deki farklı yönelimlerin etkisini, DCS ile talamik stimülasyon tarafından uyarılan yanıtları ve katodik DCS'nin nöbet benzeri aktivite üzerindeki etkisini göstermektedir. Ayrıca bu şekilde, 15 dakikalık katodik DCS'nin uzun süreli depresyonu etkili bir şekilde indüklediği ve uyarılan yanıtları baskıladığı görülmektedir. DCS uygulaması yapılmayan duruma kıyasla, 15 dakikalık katodik DCS sonrası nöbet süresinin önemli ölçüde azaldığı belirlenmiştir.

daha hızlı; teknik olarak, uygun şekilde gerçekleştirilirse bu işlem dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, dirençli nöbetlerin kontrolü için noninvaziv yaklaşımlar sağlamak gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla transkraniyal manyetik stimülasyon gibi diğer işlemler uygulanabilir. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, noninvaziv terapi alanındaki araştırmacıların hayvan modellerinde nöbet tedavilerini keşfetmelerine yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, beyin kesitlerinde nöbet benzeri aktiviteyi değerlendirmek için akım stimülasyonunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.