Name: Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Keşfedin Caenorhabditis elegans embriyonik uzamasındaki morfojenetik defektleri zaman atlamalı mikroskopi ile. Bu yöntem erken ve geç evre genlerini belirleyerek gelişimsel biyoloji araştırmalarına değerli katkılar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Yenilik Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir. let-502 (sb118ts) suşu için Dr Paul Mains'e (Calgary Üniversitesi, Calgary, Kanada) teşekkürler. Suşların bir kısmı, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlandı.

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol erken karakterize etmek roman ölçümleri ve embriyonik uzama geç evreleri açıklar. 1. bölümde, kritik bir adım pad üzerinde bakteri potansiyel varlığıdır. Embriyolar hermetik pad ve görüntü alımı sırasında lamel arasında içine alınır. slayt Sızdırmazlık iki saatten fazla süren edinimi sırasında hayvanların kuruma önlemek için gereklidir. Bildiğimiz kadarıyla, slayt ve lamel arasındaki agaroz pedleri monte etmek için kullanılan sızdırmazlık hiçbiri hava geçirgen bulunmaktadır. bakt...

Kısa yaşam döngüsü: Yaklaşık 50 yıldır nematod Caenorhabditis elegans gelişimi, nörobiyoloji, evrim, konukçu-patojen etkileşimleri, vb önemli soruları incelemek için güçlü bir model olarak kendini kabul ettirdi 1 gelişme çalışmada bu modelin gücü yatıyor 3 gün; bu hayvanlar genetik olarak değiştirilmiş olabilir hangi ile kolaylığı; Çoğunlukla rahim dışı olduğunu yaşayan hayvanların ve gelişimi, hücre deplasman ve morfolojisi gözlem sağlayan şeffaflığı. nematod gelişim evreleri yetişkinlikte ardından embriyogenezis ve dört larva aşamalarını (L4 L1), içerir. embriyonik gelişim sırasında, epidermal morfogenezisi hücreleri onların kavşak yeniden nasıl bir grup olarak göç nasıl epitel daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve onların bireysel morfolojisi yanı sıra işlevsel epitel içinde göreceli konumunu değiştirmek kabiliyetini önemli ölçüde dikkat çekti.Epidermal morfogenezisi dört evreye ayrılır: dorsal epidermal hücrelerin yeniden organizasyonunda oluşan sırt interkalasyon, hipodermis olarak anılacaktır; böylece epitel hücre tek tabaka embriyo encasing ventral orta hat doğru ventral hipodermal hücrelerinin göç oluşan ventral muhafaza; erken ve geç uzama vermiform larva haline fasulye şeklinde embriyoyu dönüştürme. Aşağıdaki morfogenezi, embriyo kapak ve L1 larvaları kendi yakın çevrede mevcut bakterileri kullanarak beslemeye başlarlar. Embriyonik uzama nedenle embriyonik gelişim geç bir aşamasıdır. Bu uzunlamasına ekseni boyunca embriyo uzatılması ve enine çapa sahip bir azalma oluşur. Bu hipodermal hücre şeklinin dramatik bir değişiklik gerektirir. Uzama, erken ve geç faz ayrılmıştır. Vücut duvarı kasları w 1.75 kat aşamada sözleşme başladığınızda erken evre virgül aşamasında başlar ve biterILD tipi (WT) embriyo - olmayan uzatılmış embriyolar göre uzunluğu 1.75 kat olan embriyolar tekabül etmektedir. Bu aşamada ortaya çıkan morfojenik süreçler esas embriyo 2 anteroposterior ekseni boyunca onların uzama sürücü hipodermal hücrelerinin apikal kutbunda bulunan ipliksi aktin demetleri (FB&#39;ler) kasılmasıyla tarafından tahrik edilmektedir. FBs Daralma üç kinazlar LET-502 / ROCK, MRCK-1 ve PAK-1 5 ile miyozin-hafif zincirlerin fosforilasyon ile kontrol edilmesidir. vücut duvarı kasları işlevsel hale ve taahhüt başlattığınızda uzama geç faz başlar. Bu sırt ve karın hipodermal hücrelere vücut duvarı kasları gelen mechanotransduction sinyalizasyon içerir ve hayvanlar 3 yumurtadan biter. ve L1 larvaları (Larva tutuklama fenotip olarak bu durdurma onların gelişimi; uzama kusurları genellikle embriyolar olarak ölen hayvanların yüzdesi (Emb Embriyonik öldürücü); ile karakterize edilir Lva) ve ağırlık önemli ölçüde daha kısa olması. gelişimsel duraklama evresi tanımlanması ölü embriyo mikroskobik gözlem gerektirir ve Larva 3-6 tutukladı. Son zamanlarda, bu Cdc42 / rac regülatörü ve efektör pix-1 ve Pak-1 gibi birçok gen, erken ve geç uzama 3,7 sırasında hem morfojenik süreçlerini kontrol gösterilmiştir. Biz de son zamanlarda morfojenik süreçler erken uzama 3 7 sırasında embriyoların anteroposterior ekseni boyunca farklı olduğunu gösterdi. Bu bulgular, özellikle erken uzama sırasında ön-arka eksen boyunca embriyoların morfolojik karakterizasyonu sağlayan erken ya da geç uzama aşamalarını ve diğer ölçümleri hedefleyen yeni metrik gelişimini motive etti. Bu yeni yöntemler kendi genişliği yanı sıra başında ve erken uzama sonunda embriyoların uzunluğu ölçülerek ibaret oreklamlar ve kuyrukları. 7 İki protokolleri de L1 aşamada 7&#39;de senkronize yumurtadan yeni çıkmış larvaların uzunluğunu ölçmek için geliştirilmiştir. larva, yetişkin ve kültür ortamı mevcut bakteri tedavisi ile çözülür ise embriyoların yumurta kabukları alkali hipoklorit muameleye karşı korunmaları. Bu işlem daha sonra besili yetişkin 8 çoğunluğunu ihtiva eden bir senkronize olmayan nüfusu embriyolar saflaştırmak için kullanılır. Gıda kısıtlama yeni yumurtadan larva senkronize etmek için kullanılır. Bu larvaların uzunluğunun ölçülmesi sonra uzama kusurları tespit etmek için kullanılır. yumurtadan larva olmayan tam olarak uzatılmış embriyolar beslerken, &quot;normal uzunluğu&quot; olarak geri ancak gıda yokluğunda yakalandıklarında indirgenmiş büyüklüğünü korumak çünkü bu ölçüm kültür levhaları üzerinde tutuklandı larva ölçülmesi tercih edilmektedir. Burada, biz le ölçümünü sağlayan ayrıntılı protokolleri mevcutzaman atlamalı DIC mikroskopi ve görüntü analizi (Protokol 1) kullanılarak embriyolar ve bunların baş genişliği ve kuyruk uzatılması ngth. Biz de görüntü analizi (Protokol 2) ve Flow-Sitometri (Protokol 3) kullanılarak senkronize larva uzunluğunu ölçmek için ayrıntılı protokolleri sağlar.

<table><tbody><tr><td>Ağar&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Bioshop</td><td></td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Kalsiyum Klorür)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Temizleme solüsyonu&nbsp;</td><td>birlik Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Cam kaydıraklar</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek floresan kontrol parçacıkları</td><td>birliği Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (potasyum fosfat, dibazik)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (potasyum fosfat, monobazik)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<alt > 4 < / alt > (magnezyum sülfat)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (sodyum fosfat, dibazik)</td> <td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (sodyum klorür)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Çekme Sakızı 45&nbsp; ML</td><td>P&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>herhangi bir sanat/zanaat mağazası</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Kılıf tampon</td><td>birliği Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>birliği Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

roman metrik nematodu embriyonik uzama karakterize etmek<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Embriyonik gelişim sırasında morfojenik süreçlerin değişimini kontrol eden sinyal yollarının incelenmesi, sağlam ve hassas ölçümler gerektirir. Nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzaması, embriyonun uzunlamasına ekseni boyunca uzamasından oluşan geç bir gelişim aşamasıdır. Bu gelişim aşaması, hipodermal hücreler ve altta yatan vücut duvarı kasları arasındaki hücreler arası iletişim tarafından kontrol edilir. Bu sinyal mekanizmaları, hücre iskeletini ve hücre-hücre bağlantılarını yeniden şekillendirerek hipodermal hücrelerin morfolojisini kontrol eder. Larva evrelerinde embriyonik ölümcüllüğün ve gelişimsel durmasının ölçülmesinin yanı sıra hipodermal ve kas hücrelerinde hücre iskeleti ve hücre-hücre adezyon yapılarının değiştirilmesi, bu sinyal yolaklarını incelemek için 25 yılı aşkın bir süredir kullanılan klasik fenotiplerdir. Son çalışmalar, özellikle erken veya geç uzamayı hedefleyen ve embriyonun antero-posterior ekseni boyunca morfojenik kusurları karakterize eden yeni metriklerin geliştirilmesini gerektirdi. Burada, uzayan embriyoların uzunluğunun ve genişliğinin yanı sıra senkronize larvaların uzunluğunun doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, uzamayı kontrol eden genleri tanımlamak, bu genlerin bu aşamanın hem erken hem de geç aşamalarını kontrol edip etmediğini ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca eşit olarak gerekli olup olmadığını değerlendirmek için yararlı araçlar oluşturur.

Baş, bagaj ve Baş / Kuyruk genişliği Oranı Sağlam Metrik vardır. Burada anlatılan protokoller başarılı düzenleyiciler ve Rho GTPases pix-1 efektör işlevini, pak-1 karakterize ve let-502 erken uzama 7 sırasında kullanılmıştır. Bir guanin-değişim faktörü ...

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Bu deney grubunun genel amacı, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzama sürecinin erken ve geç evrelerindeki gelişimsel kusurları belirlemektir. Bu yöntem, gelişimsel genetik alanındaki temel bir soruyu yanıtlayabilir. Caenorhabditis elegans embriyonik gelişiminin embriyonik uzama olarak adlandırılan geç bir evresini kontrol eden genlerin karakterize edilmesine olanak tanır.Bu teknik grubunun temel avantajı, uzamanın hem erken hem de geç aşamalarını kontrol eden genlerin yanı sıra embriyonun ön veya arka kısmındaki morfogenik süreçleri kontrol eden genleri tanımlamalarıdır. Prosedürü, laboratuvarın eski bir öğrencisi olan Olivier Rocheleau-Leclair ile birlikte uygulamalı olarak göstereceğim. Bu prosedür; Z yığınlarının zaman ayarlı mikroskobisi için DIC lensleri, prizma ve bir video kayıt sistemi gerektirir.İlk olarak, lam üzerine monte edilmiş örneği görüntüleme için konumlandırın. Hazırlama detayları metin protokolünde yer almaktadır. Düşük büyütme ile başlayarak, pre-morfogenez aşamalarındaki embriyoları tanımlayın.Ardından, bir damla yağ ekleyin ve daha güçlü bir objektif kullanın. Şimdi, Z yığını parametrelerini belirlemek ve kaydetmek için embriyoların üst ve alt noktalarını tanımlayın. Time-lapse ayarını her iki dakikada bir görüntü alacak şekilde yapın.Görüntü alımları arasında ışık panjurunun kapalı olduğundan emin olun. Erken uzama olayını yakalamak için gereken süre, embriyonun evresine bağlı olarak bir ile sekiz saat arasında değişebilir. Şimdi, görüntü alım programını çalıştırın ve sonuçları kaydedin.Ardından, Fiji ImageJ yazılımını kullanarak analizlerine geçin. Görüntüler yüklendikten sonra, Hyperstack görüntüleme modunu seçin. Burada, Lookup Tables kısmındaki Auto Mode'u uygulayarak parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.Ardından, Ölçüm Setini Analiz Et (Analyze Set Measurements) sekmesine gidin ve parametreleri ayarlayın. Her embriyo için, embriyonun merkez noktası için iyi bir referans olan farinkse odaklanacak şekilde Z Ölçek çubuğunu ayarlayın. Şimdi, belirli bir embriyo için Zaman Ölçek çubuğunu erken uzamanın başlangıcına getirin.Bu saati not edin. Ardından, Analyze Measure aracını kullanarak kuyruk ucundan ağza kadar orta hat boyunca bir çizgi çizerek embriyonun uzunluğunu hesaplayın. Bu uzunluğu not edin.Ardından, zaman noktasını erken uzama olayının sonuna ayarlayın ve uzunluk ölçümünü tekrarlayın. Erken uzama süresini ve erken uzama sırasındaki uzunluk artışını hesaplamak için bu değerleri kullanın. Genişlikteki değişim, başın orta hattı boyunca bir çizgi çizmek için düz çizgi aracı kullanılarak da ölçülebilir.Burası tutarlı ölçümler için uygun bir konumdur. Aynı işlemi kuyruğun orta hattı için de gerçekleştirin, ardından herhangi bir zaman noktası için baş-kuyruk oranını hesaplayın ve bunu genişlikteki değişimleri puanlamak için kullanın. Bu protokol için, bir akış sitometresinin büyük partikül akışı için hazırlanmış olması gerekir.Böyle bir makine temel olarak bir solucan ayıklayıcıya dönüşür. Başlamadan önce lazer bloğunu, kompresörü, solucan ayıklayıcıyı ve yazılımı çalıştırın. Yazılımda, Başlat'a basın ve Argon Lazer Kontrolünü kontrol edin.Çalıştırma (Run) modunu seçin ve lazerin gücü yaklaşık 10 milliwatt seviyesine gelene kadar ısınmasını bekleyin, ardından Tamam (Done) seçeneğini belirleyin. Basıncın dengelenmesi için en az 15 dakika bekleyin. Şimdi, numuneyi hazırlayın.İlk olarak, senkronize vahşi tip L1'den 10 µL'yi bir saat camına alın ve mikroskop altında ölü yumurtaların oranını tahmin edin. Tahmin %20'den fazlaysa örneği kullanmayın. M9 çözeltisi içindeki yaklaşık 700 µL senkronize L1'i 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve propidyum iyodür miktarını 10 µg/mL olacak şekilde ekleyin.Boyanın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca etki etmesini bekleyin. Şimdi sistemi hazırlayın. Kılıf ve Örnek Akış Kontrolcülerini kullanarak akış hızını sırasıyla 5.1 ve 5.51 olarak ayarlamak kritik önem taşır.Basınçlar stabilize olduğunda, Basınç Tamam kutusuna tıklayın. Ardından, Acquire komutunu kullanın ve örnek kabı ile analiz odası arasındaki kanaldaki hava kabarcıklarını gidermek için tübülü manuel olarak hafifçe vurun. Edinme Penceresi, nihayetinde hiçbir hava kabarcığı kalmadığını gösterecektir.Bu durum deney için ayrıca hayati önem taşımaktadır. Şimdi, Floresan ve TOF ölçümleri için parametreleri belirleyin. TOF, EXT, Yeşil, Sarı ve Kırmızı ölçeklerini 256 olarak ayarlayın.Ardından, Kazancı belirtildiği şekilde ayarlayın. Sonra, PMT Kontrolünü hem Yeşil hem de Sarı için 700'e, Kırmızı için ise 900'e ayarlayın. Şimdi, solucan ayıklayıcıyı kalibre edin.20 mililitre genel amaçlı yüksek floresanslı kontrol partikülünü bir örnek kabına doldurun ve kabı ayırıcıya yerleştirin. Yazılımda, Araçlar menüsünden Kontrol Partiküllerini Çalıştır seçeneğini belirleyin ve Edin seçeneğine tıklayın. Elde edilen varyasyon katsayısının 11'e eşit veya daha büyük olduğunu ve ortalamanın 21 artı veya eksi altı olduğunu kontrol edin.Eğer durum böyle değilse, Temizle düğmesine tıklayarak veya akış kanalını hızla hareket ettirerek tübülleri temizlemeyi deneyin. Şimdi, Araçlar kısmındaki komutun işaretini kaldırarak Kontrol Partikülleri modundan çıkın. Solucanların propidium iodide ile 30 dakikalık boyama işlemi tamamlandığında, boyanmış solucanlara 10 milliliters M9 ekleyin ve karıştırın.Oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. Şimdi, dilüsyondan beş mililitre alın ve bunu 15 mililitre M9 içeren bir numune kabına ekleyin. Bu dilüsyonu solucan ayırıcıdan geçirin. Acquire düğmesine basın ve akış hızını gözlemleyin.Saniyede 15 ile 25 nesne arasında iyi bir akış elde etmek için solucan konsantrasyonunu ayarlamak gerekebilir. Nesnelerin uygun konsantrasyonu sağlandığında, çözeltide yaklaşık 0,5 ila 1x son kontrol partikül konsantrasyonu elde etmek için teste kontrol partikülleri ekleyin. Şimdi, Gating menüsü altındaki Gating Parametresini TOF versus Green olarak ayarlayın.Ardından, Sıralama parametrelerini TOF ile Red şeklinde ayarlayın. Bu işlem, kontrol partikülleri ölü hayvanlardan ve canlı hayvanlardan ayıracaktır. Şimdi, Acquire butonuna tıklayarak deneyi başlatın.Yaklaşık 8.000 hayvana tekabül eden yaklaşık 10.000 nesneyi analiz edin. Ardından deneyi durdurun ve verileri analiz için bir metin dosyası olarak kaydetmek üzere Store düğmesine tıklayın. Baş genişliği ölçümünün sağlamlığını belirlemek için, 1,2 kat evresindeki 12 vahşi tip embriyoda ölçüm bağımsız olarak beş kez gerçekleştirilmiştir.Brown-Forsythe testi uygulandığında veriler arasında herhangi bir varyans saptanmamıştır. Baş genişliği ölçümüyle ilişkili tekrarlanabilirlik ve seri etkileri, üç farklı günde 4D DIC görüntüleme kullanılarak test edilmiştir. Bu üç ölçüm grubu arasında herhangi bir varyans veya seri etkisi bulunmamıştır.Her iki tanımlanan protokol, yabanı tip ve mutant arka planlardaki gelişim durmuş larvaların uzunluğunu değerlendirmek için kullanılmıştır. Görüntü analizi, uzunluğun mikrometre cinsinden mutlak ölçümlerini sağlamıştır. Bu deneyde mutantlar, yabanı tiplerden daha küçüktür.Akış sitometrisi ile yapılan uzunluk ölçümleri benzer sonuçlar vermiştir. Ancak, bu ölçümler çok daha güvenilirdi. Bu nedenle, bu yöntemin mutant popülasyonlardaki daha belirgin olmayan etkileri aydınlatması beklenmektedir.Bu prosedür uygulanırken, analiz edilen suşlar arasında adil bir karşılaştırma sağlamak için deney boyunca sabit bir akış hızının korunması önemlidir. Yönteme hakim olunduğunda, akış sitometrisi kullanılarak larval uzunluğun ölçülmesi, ekipmanın ilk kalibrasyonu dikkate alınsa bile günde 18 ila 24 kondisyon veya mutant suşun karakterize edilmesine olanak tanır. Bu prosedürün ardından, hipodermal hücrenin morfolojisini inceleyebilmekteyiz.Bunu yapmak için, tanımlanan genlerin moleküler fonksiyonlarını karakterize etmek amacıyla floresan işaretleyici ve konfokal mikroskopi kullanabiliriz. Propidium iyodürün son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Biz kayıt ve sayısal bir video-hızı izleme mikroskop sistemi...

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

Bu video, vahşi tip veya ALS-mutant insan TDP-43 proteinini eksprese eden C. elegans'daki motor disfonksiyonu değerlendirmek için bir radyal hareket testinin kullanımını göstermektedir. Farklı seviyelerde vahşi tip veya mutant TDP-43 ekspresyonuna sahip solucanların sürünmesine izin verilir ve hareketleri, tahlil plakası üzerindeki merkezi noktadan kat edilen radyal mesafe ile ölçülür. Test, farklı C. elegans suşlarının kat ettiği mesafeye bağlı olarak hafif, orta ve şiddetli motor bozukluklar...

C. elegans Modellerinde Motor Bozukluğun Radyal Hareket Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Sperm, bir ooksit döllemek için ovidukt üzerinden başarılı bir şekilde gezinmelidir. Burada, C. elegans hermafrodit uterusun içinde sperm göçünü ölçmek için bir tahlil açıklanmaktadır. Bu tahlil çiftleşme sonra rahim içinde sperm dağılımı nicel veri sağlayabilir, yanı sıra hız, yönlü hız, ve ters frekans.

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

Burada, C. elegans model organizmasını kullanarak embriyonik canlılığı ve üretilen toplam embriyo sayısını (kuluçka) belirlemek için genel bir yöntem sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Keşfedin Caenorhabditis elegans embriyonik uzamasındaki morfojenetik defektleri zaman atlamalı mikroskopi ile. Bu yöntem erken ve geç evre genlerini belirleyerek gelişimsel biyoloji araştırmalarına değerli katkılar sağlar.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek

Daha fazla video keşfet