Name: Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Öğrenin, hücre yüklü hidrojel üzerinde degrade statik zorlanma oluşturma yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliğinde hücre hizalanması ve kök hücre farklılaşmasını araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje Lisansüstü Öğrenci Çalışma yurtdışında Program (NSC-101-2917-I-007-010 tarafından) destek verdi; Biyomedikal Mühendisliği programı (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); ve nanoteknoloji Ulusal Program (NSC-101-2120-M-007-001-), R.O.C., Tayvan Ulusal Bilim Konseyi. Yazarlar Prof. Ali Khademhosseini, gülden Camci-Ünal, Arghya Paul ve Ronglih Liao, Harvard Tıp Okulu hidrojel ve hücre kapsülleme teknoloji paylaşımı için teşekkür etmek istiyorum.

1. GelMA Sentezi
<ol>
	<li>10 g jelatin tozunu tartın ve 100 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) içeren bir cam şişeye ekleyin. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu koyun ve şişeyi karıştıran bir sıcak plakaya yerleştirin.</li>
	<li>Suyun buharlaşmasını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile örtün. Jelatin tozunu iyice çözmek için sıcak plaka sıcaklığını 50-60 °C'ye ve karıştırıcıyı 1 saat boyunca 100 rpm'ye ayarlayın.</li>
	<li>Jelatin çözüldükten sonra, bir pipet kullanarak 8 mL metakrilik anhidrit çok yavaş (saniyede bir damla) ekleyin. 60 °C'de 3 saat reaksiyona girmesine izin verin.</li>
	<li>Şişeye önceden ısıtılmış DPBS (40 °C) ekleyin ve 500 mL'lik son hacme kadar pişirin ve reaksiyonu durdurmak için bu karışımın 15 dakika boyunca iyice çalışmasına izin verin.</li>
	<li>Bu arada, bir diyaliz membranını (14 kDa kesilmiş moleküler ağırlıklı) 25 cm uzunluğunda birkaç tüpe kesin. 15 dakika boyunca deiyonize (DI) suya batırın ve diyaliz tüplerinin bir ucunu kapatmak için bir düğüm atın.</li>
	<li>Uygun miktarda (30 - 60 mL) polimer solüsyonunu diyaliz tüplerine yükleyin ve diğer ucunu kapatın. Bunları bir hafta boyunca DI su ile 5 L'lik plastik bir behere koyun. DI suyunu günde iki kez yenileyin ve diyaliz işlemi sırasında çözeltiyi 40 - 50 °C'de tutun.</li>
	<li>Çözeltiyi tüpten 500 mL'lik bir cam şişede toplayın. 500 mL'lik bir filtre kabına (gözenek boyutu 0.22 μm) ~ 450 - 500 mL çözelti dökün ve çözeltiyi sterilizasyon için filtre zarından geçmeye zorlamak için filtre kabına bir vakum uygulayın.</li>
	<li>Sterilize edilmiş polimeri birkaç 50 mL sterilize tüpe aktarın ve bunları -80 ° C'lik bir dondurucuda 3-5 gün saklayın.</li>
	<li>-80 °C polimeri GelMA oluşturmak için bir dondurarak kurutucu kullanarak 1 hafta boyunca dondurarak kurutun. GelMA'yı -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.</li>
</ol>
2. 3-(Trimetoksisilil)propil Metakrilat (TMSPMA) Modifikasyonu
<ol>
	<li> Ticari cam slaytları iki küçük parçaya (25 mm x 37,5 mm) kesin ve 4 saat boyunca 0,5 M NaOH çözeltisine daldırın. Slaytları bol miktarda DI su ile yıkayın.</li>
	<li>Slaytı% 95 etanol içeren bir cam kabın içindeki bir rafa yerleştirin ve 15 dakika boyunca 43 kHz'de bir ultrasonicator kullanarak temizleyin.</li>
	<li>Cam slaytları 1 saat boyunca %99,5 etanol içinde %5 TMSPMA'ya daldırın.</li>
	<li>Slaytları %95 etanol içinde yıkayın, slaytları havayla kurutun ve TMSPMA kaplamasını 80 °C'de 2 saat fırında tavlayın.</li>
</ol>
3. Çip İmalatı
<ol>
	<li>Bir adet 2 mm ve bir adet 0,3 mm kalınlığında polimetilmetakrilat (PMMA) plaka alın, PMMA yüzeyinin bir tarafına çift taraflı bant uygulayın ve bir taraftaki astarı serbest bırakın. İki adet 2 mm kalınlığında PMMA plakası ve bir adet 1 mm kalınlığında plakayı çift taraflı bant olmadan bırakın.</li>
	<li>Alt plakayı yapmak için çift taraflı bant olmadan 2 mm kalınlığında bir PMMA plakasını 42 mm x 30 mm'ye lazerle kesin. Dış boyutları 42 mm x 30 mm ve iç boyutları 37,5 mm x 25 mm olan sınır çerçevesini yapmak için çift taraflı bantla 2 mm kalınlığında bir PMMA plakası kesin.</li>
	<li>0,3 mm kalınlığındaki PMMA plakasını çift taraflı bantla, dairenin zıt taraflarında iki adet 2 mm genişliğinde ve 8 mm uzunluğunda akış kanalı bulunan 12 mm'lik bir merkez daireye lazerle kesin (Şekil 1a).</li>
	<li>PMMA kalıbını PDMS kapağını dökmek üzere hazırlamak için, 3.2-3.3 adımlarındaki (Şekil 1b) üç parça PMMA bileşenini çift taraflı bant kullanarak birleştirin.</li>
	<li>2 mm kalınlığında bir PMMA plakasını çift taraflı bantla 5 cm x 5 cm'lik bir parça halinde 3 x 3 dizi 8,5 mm x 8,5 mm içi boş dikdörtgenlerle lazerle kesin. 3 x 3'lük 4 mm'lik içi boş daireler dizisiyle 5 cm x 5 cm'lik bir parça daha kesin. 1 mm kalınlığındaki bir PMMA plakasını çift taraflı bant olmadan 5 cm x 5 cm'lik bir PMMA alt plakasına lazerle kesin.</li>
	<li>Adım 3.5'teki (Şekil 1c) üç parça PMMA bileşenini çift taraflı bant kullanarak bir araya getirerek PDMS fişini dökmek için PMMA kalıbını hazırlayın.</li>
	<li>30 g PDMS elastomer ve 3 g PDMS kürleme maddesini uygun şekilde karıştırarak PDMS kapağını ve PDMS fişini hazırlayın; karışımı 1 saat boyunca bir vakum odası altında gazdan arındırın.</li>
	<li>PDMS kapağı için PMMA kalıbına 1.8-2.0 g karışım dökün ve PDMS fişi için PMMA kalıbının her bir boşluğunu doldurmak için uygun miktarı kullanın. 10 g kürlenmemiş PDMS karışımını 10 cm'lik boş bir plastik tabağa dökün. Bu kalıpları 30 dakika boyunca gazdan arındırmak için bir vakum odasına koyun.</li>
	<li>PDMS'yi 80 ° C'de 2 saat kürleyin. Kürlenmiş PDMS'yi kalıp üzerinde soğuttuktan sonra, PDMS kapaklarını ve PDMS tapalarını PMMA kalıplarından ayırın.</li>
	<li>PDMS kapaklarının akış kanallarının uçlarına yaklaşık 3 mm çapında iki delik açın.</li>
	<li>10 cm'lik plastik plakadan kalıplanmış PDMS levhasını 1 cm x 1 cm'lik küpler halinde kesin ve her PDMS küpüne 3 mm'lik bir delik açın. İki kürlenmemiş 1 cm x 1 cm PDMS küpünü PDMS kapağının açıklıklarına yapıştırın (orta rezervuar görevi görmek ve gradyan dairesel hidrojel modellerinin kürleme işlemine yardımcı olmak için) ve 80 °C'de 1 saat kürleyin.</li>
	<li>PDMS kapağının ve TMSPMA kaplı kızağın yapıştırma tarafını bir oksijen plazma makinesi (30 W RF gücü (yüksek mod) ve 600 mTorr basınçlı hava) veya yüksek frekanslı elektronik korona jeneratörü (115 V, 50/60 Hz, 0.35 A) altında 90 s O2 plazma işlemi için ön işleme tabi tutarak PDMS kapaklarını iki PDMS rezervuarı ile TMSPMA kaplı bir slayt üzerine yapıştırın.</li>
	<li>PDMS kapaklarının plazma ile muamele edilmiş yüzeyine ve TMSPMA sürgüsüne temas edin ve bir Si-O-Si bağı oluşturarak kalıcı yapışma için bunları sıkıca bastırın. 
	NOT: Çipi 1 saat boyunca 80 °C'de bir fırına yerleştirmek, yapışma gücünü daha da artırabilir.</li>
	<li>Soğuduktan sonra cipsleri 15 dakika boyunca %95 etanole batırın ve havayla kurutun. Daha sonra talaşları UV ışınlaması altında 1 saat sterilize edin ve laminer başlıkta alüminyum folyoya sarılmış bir kutuda saklayın.</li>
</ol>
4. Hücre Yüklü Hidrojel Üzerindeki Statik Gradyan Gerinimi
<ol>
	<li>25 mm x 37,5 mm boyutunda bir fotoğraf maskesi parçası yazdırın ve kesin, düzeni şeffaf bir film üzerine Şekil 2b'de yazdırın. Şekil 2b'nin yazdırılan boyutunu, Şekil 2a'daki boyutla eşleşecek şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamı olarak kullanmak için 37 ° C'lik bir su banyosunda %10 FBS, %1 Pen-Strep ve 250 mL DPBS içeren 100 mL DMEM ortamı hazırlayın.</li>
	<li>25 mg dondurularak kurutulmuş GelMA'yı 1.5 mL'lik siyah mikrosantrifüj tüpünde 0.3 mL önceden ısıtılmış (37 °C) hücre kültürü ortamına tartın. Mikrosantrifüj tüpünü, GelMA ortamda çözünene kadar bir laboratuvar karıştırıcısı/sıcak plakası üzerine koyun.</li>
	<li>50 mg foto başlatıcıyı bir mikrosantrifüj tüpünde 1 ml DPBS'ye tartın ve 15 dakika veya foto başlatıcı çözünene kadar 80 ° C'lik bir fırına koyun.</li>
	<li>Adım 4.4'ten %10'luk foto başlatıcının 25 μL'sini alın ve adım 4.3'ten itibaren mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. İyice karıştırmak için birkaç kez pipetleyin.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 3 x 106 NIH 3T3 hücresi sayın. Süspansiyonu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 175 μL hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>% 5 GelMA,% 0.5 foto başlatıcı ve ~ 6 x 106 3T3 hücre / mL'lik bir prepolimer hücre çözeltisi elde etmek için adım 4.6'daki hücre çözeltisini adım 4.5'teki mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Karıştırdıktan sonra, 100 μL'lik bir mikro şırıngaya 100 μL hücre prepolimeri yükleyin.</li>
	<li>Fotoğraf maskesinin bir parçasını sterilize edilmiş gradyan gerinim çipinin alt sürgüsüne manuel olarak hizalayın (bkz. Şekil 3a) ve arada küçük bir damla DI su kullanarak konumu sabitleyin. Prepolimer hücre çözeltisi yüklü 100 μL'lik mikro şırıngayı çipin girişine bağlayın.</li>
	<li>Mikro şırınga kullanarak akış kanalına 50 μL prepolimer hücre solüsyonu yerleştirin (bkz. Şekil 3b) ve ardından bir PDMS fişi kullanarak prizi takın. Dairesel PDMS membranında dışbükey bir çıkıntı oluşturmak için fazladan 40 μL'lik bir çözelti enjekte edin.</li>
	<li>Çipi fotomaske (alt), mikro şırınga (giriş) ve PDMS fişi (çıkış) ile 4.9. adımdan itibaren bir UV lambası (365 nm, 9 mW/cm2) altında hareket ettirin ve akışkan haznesindeki eşmerkezli dairesel hidrojeli çapraz bağlamak için 30 - 45 s maruz bırakın.</li>
	<li>Sıvı basıncını boşaltmak için PDMS tapasını ve mikro şırıngayı çıkarın (bkz. Şekil 3c). Çapraz bağlanmamış reçineleri girişten çıkışa kadar yıkayarak 3 kez yıkamak için önceden ısıtılmış DPBS ile yüklenmiş 1 mL'lik bir şırınga kullanın.</li>
	<li>Akış kanalını yaklaşık 100 μL hücre kültürü ortamı ile doldurun.</li>
	<li>Çipi sterilize edilmiş bir kültür kabına yerleştirin ve bir hafta boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde kültürleyin. Ortamı her gün yenileyin.</li>
	Kontrol <li>grubu olarak 4 saatlik inkübasyondan sonra 0. günde üç çipin ve deney seti olarak 3. günde üç çipin 20X objektifli bir mikroskop kullanarak görüntülerini alın. Sıkıştırma suşlarını hesaplamak için yazılım (örn. ImageJ) kullanarak her bir hidrojelin satır 1'den satır 12'ye kadar olan çizgi genişliğini ölçün ( Şekil 4). 
	NOT: Uzama yüzdesi, 40 μL ile 0 μL arasındaki çizgi genişliği farkının değerinin 40 μL'deki çizgi genişliğine bölünmesiyle hesaplanır.</li>
</ol>
5. Hizalama Analizi için Hücre Boyama
<ol>
	<li>Hücre yüklü hidrojelin sabitlenmesi için RT'de DPBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) 15 dakika boyunca akış çipine enjekte etmek için bir şırınga kullanın. 
	NOT: Dikkat. PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.</li>
	<li>RT'de hücre zarına nüfuz etmek için çözeltiyi DPBS'de% 0.5 hücre zarı geçirgen çözeltisi ile 10 dakika boyunca değiştirin.</li>
	<li>PBS, numuneleri yıkamalar arasında 5 ila 10 dakikalık aralıklarla 3 kez yıkayın (adım 5.1'deki gibi yüklü bir şırınga kullanarak).</li>
	<li>RT'de 45-60 dakika boyunca akışkan kanala% 1 BSA çözeltisi yükleyin (giriş portundan yüklü bir şırınga kullanarak).</li>
	<li>Alexa Fluor 488 phalloidin ile şişeye 1.5 mL metanol ekleyin ve 6.6 μM stok çözeltisinin nihai konsantrasyonunu elde edin.</li>
	<li>Adım 5.5'ten 5 μL Alexa Fluor 488 phalloidin alın ve 0.165 μM Alexa Fluor 488 phalloidin'lik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için% 0.1 BSA ile 200 μL DPBS içinde seyreltin.</li>
	<li>Bir mikropipet kullanarak akışkan kanala 200 μL karışım çözeltisi ekleyin ve aktin boyama için çipi 37 °C'de 45 - 60 dakika inkübe edin. PBS numuneleri (yukarıdaki gibi) 3 kez yıkayın.</li>
	<li>PBS'de 1 μg/mL DAPI hazırlayın, çipten geçirin ve hücre çekirdeklerini 37 °C'de 5 dakika boyayın.</li>
	<li>Boyama solüsyonunu yıkamak için DPBS'yi akışkan kanala pipetleyin ve floresan mikroskobu ile görüntü almak için akışkan odasını PBS solüsyonu ile yeniden doldurun.</li>
	<li>Alexa Fluor 488 phalloidin (aktin) ve DAPI (çekirdek) için sırasıyla 488/520 nm ve 358/461 nm'de ex/em filtre setleri ve bir CCD dedektörü ile 40X büyütme altında ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak hidrojellerdeki 3T3 hücrelerinin floresan görüntülerini yakalayın.</li>
</ol>

<ol><li>Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystems+for+biomimetic+stimulation+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells.</a> Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulation+of+the+cardiac+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+tissue+constructs+that+mimic+myocardium+structure+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics.</a> Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).</li>
<li>Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes+in+a+compliant+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system.</a> Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+effects+of+mechanical+strain+on+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).</li>
<li>Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+strain+stimulates+fibroblastic+phenotype+shift+in+smooth+muscle+cells+in+an+engineered+tissue+model+of+the+aortic+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall.</a> Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).</li>
<li>Ramon-Azcon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacrylate+as+a+promising+hydrogel+for+3D+microscale+organization+and+proliferation+of+dielectrophoretically+patterned+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells.</a> Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).</li>
<li>Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-Based+Comparison+of+the+Osteogenesis+of+Human+Bone+Marrow-+and+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+under+Mechanical+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation.</a> PLoS One. 7 (9), e46689(2012).</li>
<li>Gould, R. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22281945">Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture.</a> Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17060641">Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells.</a> Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).</li>
<li>Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-Induced+Alignment+in+Collagen+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strain-Induced Alignment in Collagen Gels.</a> PLoS One. 4 (6), e5902(2009).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li>
<li>Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/4/2/1084">Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery.</a> Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+Counts%3A+Microenvironmental+Regulation+of+Stem+Cells+by+Biophysical+and+Material.+Cues%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).</li>
<li>Segers, V. F., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+therapy+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell therapy for cardiac disease.</a> Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).</li>
<li>Hsieh, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+static-strain+stimulation+in+a+microfluidic+chip+for+3D+cellular+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment.</a> Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yazıda, hücre hizalama davranışını hidrojel şekil rehberlik ve gerilme streç sonra karşılaştırmak için basit bir yaklaşım üzerinde rapor. Esnek PDMS membran konsantrik dairesel hydrogels farklı yükseklikte üretmek için bir kubbe seklinde eğrilik oluşturur. Basınç bırakmadan sonra PDMS membran degrade zorlanma/uzama, en merkezi ve en azından dış sınır oluşturmak için mikro-desenli hydrogels için kuvvet otomatik olarak uygular. Degrade zorlanma oluşumu esnek PDMS membran ve sıvı çip işlenmesi tarafından tasarlandığı gib...

Yerel bir microenvironment taklit eden bir blok malzeme olarak hizmet veren, hücre dışı Matriks (ECM) içeren bir hidrojel yeniden hücre büyümesini desteklemek için biomimetic doku iskele inşa edebilirsiniz. Bir doku fonksiyonları sahip olmak, organize hücre hizalama temel bir gereksinimdir. Çeşitli (Yani, bir yüzeye kültürlü hücreleri) 2D ve 3D (Yani, bir hidrojel kapsüllenmiş hücreleri) kültür veya hücreleri veya mikro esnek yüzeyler üzerinde Kapsüllenen tarafından elde hücre hizalamaları-ya da nano kalıpları1. Microenvironment yerel doku yapısı2,3,4' e daha yakın olduğu gibi 3D hücre hizalama mikro mimarisi içinde daha çekicidir. 3D hücre hizalama için bir ortak yaklaşım hidrojel şekil2,3geometrik işaretimiz. Nedeniyle kısıtlı alan kısa eksenli yönde hücre çoğalması için hücreleri mikro desenli hidrojel uzun ekseni yönünde boyunca Hizala hedefliyoruz. Çekme dayanımı streç hücre hizalama streç yön4,5' e paralel elde etmek için hydrogels uygulamak için başka bir yaklaşımdır.
Biyofiziksel stimülasyon basınç zorlanma gibi ECM hydrogels üzerinde veya bir elektrik alanı, hücre fonksiyonları için uygun doku Tümleştirme, yayılması ve farklılaşma1,2,3düzenleyen. Hücresel davranış birden çok mekanik denetim birimleri4,6,7,8,9kullanarak bir defada bir yük durumu uygulayarak araştırmak için çok araştırma yapılmıştır. Örneğin, mekanik adım motorlar kullanımı sıkılmış veya 3D cep kapsüllenmiş kollajen hidrojel üzerinde gerilmiş ortak bir yaklaşım7,10oldu. Ancak, bu tür kontrol araçlar ilave alanı gerektirir ve kirlenme kuluçka makinesi7,9,11,12sorunu karşı karşıya. Buna ek olarak, büyük araç yüksek tekrarlanabilirlik13sağlamak için bir hassas kontrol ortamı veremem.
Hücre yüklü hydrogels genellikle Biyomedikal uygulamalar için mikro ölçekte istihdam edilmektedir göz önüne alındığında, MEMS teknikleri zorlanma/streç stimülasyon aynı anda 3D biomimetic yapıları vitro2,14,15,16,17,18cep davranışları araştırmak için bir dizi oluşturmak için birleştirmek için avantajlıdır. Örneğin, gaz basıncı PDMS membran mikrosıvısal fiş deforme kullanarak çeşitli suşları, hücre farklılaşması farklı soy9,16' sürüş için çıkmasına neden olabilir. Ancak, karmaşık çip üretim süreçlerinde bir temiz oda ve yazılım denetim Tümleştirme motor, pompa, vanalar ve sıkıştırılmış gazlar gibi pek çok teknik sorun vardır.
Bu çalışmada, biz kendi kendini idame ettiren bir degrade statik yük mikrosıvısal çip bir eş merkezli dairesel hidrojel desen ve esnek bir PDMS membran istihdam ederek elde etmek için basit bir yaklaşım göstermek. Varolan yaklaşımlar en aksine, bizim bu sarı odanın dışında sahte olduğu ve kuluçka sırasında dış mekanik aletler olmadan konsantrik hücre kapsüllü hydrogels üzerinde gradyan suşları kendini üreten sahip bir taşınabilir ve tek kullanımlık minyatür aygıt platformudur. Çekme dayanımı streç rehberlik ipuçları çeşitli degrade zorlanma yongası 3D ECM mimetic ortamlar içinde hücre hizalama 3 gün boyunca gözlem sırasında gösterdi ve 3T3 fibroblast hücre davranışları hidrojel şekil kombinasyonu tarafından etkiledi.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL siyah mikrosantrifüj tüpü</td><td>Argos Technologies&nbsp;</td><td>03-391-161</td><td>Bu, aluminun folyo ile kaplanmış 1,5 mL'lik nötr bir renkle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 falloidin&nbsp;</td><td>İnvitrogen</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Moleküler Prob</td><td>C1430</td><td>Canlı hücreleri CCD PCO'yu etiketlemek için</td></tr><tr><td></td><td>. Görüntüleme</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>Hücre zarı geçirgenlik çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Hücre zarına nüfuz etmek için% 0.5 Triton X-100</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Hücre çekirdeği boyama</td></tr><tr><td>Diyaliz membranı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Moleküler ağırlık kesme = 14.000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>jel mukavemeti 300, tip A, domuz derisinden</td></tr><tr><td>Yüksek frekanslı elektronik korona jeneratörü</td><td>Elektro-teknik ürünler</td><td>MODEL BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Metakrilik Anhidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>Mikro şırınga</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>50 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>İki filtre seti içerir: Semrock Oxygen plazma makinesinden LF405/LP-B-000 ve LF488/LP-C-000</td></tr><tr><td></td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Hücre</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>DOW CORNING</td><td>Sylgard 184</td><td>PDMS çip döküm kalıplama imalatı için karışım</td></tr><tr><td>Kalem-Strep</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>penisilin / streptomisin</td></tr><tr><td>Foto başlatıcı</td><td>CIBA</td><td>Irgacure 2959</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Ölü hücreleri etiketlemek için</td></tr><tr><td>Steril Filtrasyon kabı Hidrojel</td><td></td> immobilizasyonu için <td>Milipore</td> SCGPT05RE <td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Ultrasonikatör</td></tr><tr><td></td><td>Delta</td><td>D150H</td><td>150W, 43kHz</td></tr><tr><td>UV ışığı</td><td>DAIHAN</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>Dondurarak Kurutucu</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3(fibroblast)</td><td>Gıda Endüstrisi Araştırma ve Geliştirme Enstitüsü (FIRDI)</td> <td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Hücresel hizalama için yapay rehberlik, doku mühendisliği alanında sıcak bir konudur. Önceki araştırmaların çoğu, genellikle kontaminasyon sorunlarıyla ilişkili olan karmaşık deneysel süreçler ve kütle kontrol sistemleri kullanarak, hücre yüklü bir hidrojel üzerinde tek suş kaynaklı hücresel hizalamayı araştırmıştır. Bu nedenle, bu makalede, bir 3D hidrojelde hücresel davranışın uyarılması için plastik bir PDMS kaplamalı akışkan bir çip ve bir UV şeffaf cam alt tabaka kullanarak bir gradyan statik gerinim oluşturmak için basit bir yaklaşım öneriyoruz. Akışkan haznesindeki foto-desenli hücre prepolimerinin aşırı yüklenmesi, kapak üzerinde dışbükey kavisli bir PDMS membranı oluşturabilir. UV çapraz bağlamadan sonra, kavisli PDMS membranı altında eşmerkezli dairesel bir mikro model ve tampon yıkama yoluyla, çeşitli gradyan suşları altında hücre davranışlarını araştırmak için bir mikro ortam, harici aletler olmadan tek bir akışkan çipte kendi kendine kurulur. NIH3T3 hücreleri, hidrojeller üzerinde% 15 - 65 arasında değişen gerinim stimülasyonu ile işbirliği içinde, geometri rehberliğinde hücresel hizalama eğilimindeki değişikliği gözlemledikten sonra gösterildi. 3 günlük bir inkübasyondan sonra, hidrojel geometrisi, hücrelerin yüksek basınç gerilimi altında hidrojel uzama yönü boyunca hizalandığı düşük basınçlı gerinim altında hücre hizalamasına hakim oldu. Bunlar arasında, hücreler, hidrojel uzamasının radikal kılavuzluğunun ve desenli hidrojelin geometri kılavuzluğunun dağılması nedeniyle rastgele hizalama gösterdi.

Mekanik varyasyonları arasında tamamlanan degrade zorlanma stimülasyon yongası dairesel her hidrojel karşılaştırmak için iki enjeksiyon miktarlar 0 µL (şekil 4a) ve 40 µL (şekil 4b) ile aynı fiş dairesel her hidrojel çizgi genişlikleri sırasıyla şiddetindeydi. Her daire, yüzde elongations karşılık gelen hydrogels 0 µL enjekte yongası (şekil 4 c) çizgi genişlikleri 40 µL enjekte yongası elongations bö...

Bu makalede sürekli sigara degrade statik suşlar doku mühendisliği için hücre hizalama düzenleyen konsantrik bir hücre yüklü hidrojel Tarih sağlamak için basit bir yaklaşım sunar.

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Bu gradyan gerinim çipinin genel amacı, bir dizi gerinim koşulu altında hücre davranışlarının araştırılması için bir 3D hidrojel üzerinde sürekli olmayan gradyan statik suşlar oluşturmak için basit bir yaklaşım sağlamaktır. Bu yöntem, bir kök hücre farklılaşmasının uyarılması ve yapay doku organı gelişimi için hücresel hizalamanın düzenlenmesi gibi biyomühendislik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre davranışının karşılaştırılması için hücre tabakası ve aynı mikro ortamdaki hidrojeller üzerine çeşitli suşların uygulanabilmesidir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü çip hazırlama adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü yüksek hücre değişkenliğini sağlamak için deney temeli için ışığın üç ila dört saat içinde tamamlanması gerekir. 10 gram jelatin tozunu tartın ve 100 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su veya DPBS içeren bir cam şişeye ekleyin. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu koyun ve şişeyi karıştıran bir sıcak plakaya yerleştirin.Suyun buharlaşmasını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile örtün. Jelatin tozunu çözmek için sıcak plaka sıcaklığını 50 ila 60 dereceye ve karıştırıcıy

gradient-strain-chip-for-stimulating-cellular-behaviors-cell-laden

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, iyi tanımlanmış mikroçevresinin mekansal ve zamansal degradeleri üretebilir degrade üreten mikroakışkan cihaz mikroimalat için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, degrade üreten mikroakışkan cihaz yönlendirilmiş hücre göçü, embriyogenez, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı çalışma için kullanılabilir.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Kondrositler tarafından kıkırdak ekstraselüler matriks biyosentezi mekanik uyaranlara uygulama etkilenebilir. Bu yöntem, 3D yapıları ve kondrosit metabolizması bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi kapsüllü kondrositler dinamik basınç suşların uygulama tekniği anlatılmaktadır.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro fabrikasyon cihazlar, in vivo mikro ortamı taklit eden hücre çalışmaları için in vitro bir platform sağlar. Tek veya bir arada bulunan kimyasal/elektriksel/kesme gerilimi uyaranları altında hücresel tepkileri incelemek için polimetilmetakrilat bazlı mikroakışkan çipler geliştirdik.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Biz yenidoğan kardiyomiyositlerde izolasyonu ve doku mühendisliği için fibrin hidrojel yapıları kapsülleme hücrelerin hazırlanması açıklar. Biz elektrik stimülasyonu ve hücre canlılığı ve immünohistolojik boyama üzerine oluşturulan etkin bir güç de dahil olmak üzere kültür süre sonra doku mühendislik miyokardın analiz yöntemleri açıklanmaktadır.

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Öğrenin, hücre yüklü hidrojel üzerinde degrade statik zorlanma oluşturma yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliğinde hücre hizalanması ve kök hücre farklılaşmasını araştırmak için kullanılır.

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Daha fazla video keşfet