Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Bu gradyan gerinim çipinin genel amacı, bir dizi gerinim koşulu altında hücre davranışlarının araştırılması için bir 3D hidrojel üzerinde sürekli olmayan gradyan statik suşlar oluşturmak için basit bir yaklaşım sağlamaktır. Bu yöntem, bir kök hücre farklılaşmasının uyarılması ve yapay doku organı gelişimi için hücresel hizalamanın düzenlenmesi gibi biyomühendislik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre davranışının karşılaştırılması için hücre tabakası ve aynı mikro ortamdaki hidrojeller üzerine çeşitli suşların uygulanabilmesidir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü çip hazırlama adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü yüksek hücre değişkenliğini sağlamak için deney temeli için ışığın üç ila dört saat içinde tamamlanması gerekir. 10 gram jelatin tozunu tartın ve 100 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su veya DPBS içeren bir cam şişeye ekleyin. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu koyun ve şişeyi karıştıran bir sıcak plakaya yerleştirin.

Suyun buharlaşmasını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile örtün. Jelatin tozunu çözmek için sıcak plaka sıcaklığını 50 ila 60 dereceye ve karıştırıcıyı bir saat boyunca 100 RPM'ye ayarlayın. Jelatin çözüldükten sonra, bir pipet kullanarak çok yavaş bir şekilde sekiz mililitre metakrilik anhidrit ekleyin.

Üç saat boyunca 60 santigrat derecede reaksiyona girmesine izin verin. Ardından, önceden ısıtılmış DPBS'yi şişeye 500 mililitrelik bir son hacme ekleyin. Reaksiyonu durdurmak için çözeltinin 15 dakika iyice karışmasına izin verin.

Bu arada, bir diyaliz membranını 25 milimetre uzunluğunda birkaç tüpe kesin. Onları 15 dakika boyunca deiyonize suya batırın. Ve diyaliz tüplerinin bir ucunu kapatmak için bir düğüm atın.

Uygun miktarda polimer solüsyonunu diyaliz tüplerine yükleyin ve diğer ucunu kapatın. Daha sonra doldurulmuş tüpleri bir hafta boyunca deiyonize su ile beş litrelik plastik bir behere yerleştirin. Deiyonize suyu günde iki kez yenileyin ve diyaliz işlemi sırasında çözeltiyi 40 ila 50 santigrat derecede tutun.

Diyalize girdikten sonra, çözeltiyi tüplerden 500 mililitrelik bir cam şişeye toplayın. 500 mililitrelik bir filtre kabına yaklaşık 450 ila 500 mililitre çözelti dökün. Ve çözeltiyi sterilizasyon için filtre zarından geçmeye zorlamak için bir vakum uygulayın.

Daha sonra sterilize edilmiş polimeri birkaç 50 mililitrelik sterilize edilmiş tüpe aktarın. Sterilize edilmiş polimeri birkaç 50 mililitrelik sterilize edilmiş tüpe aktarın ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda üç ila beş gün saklayın. Eksi 80 santigrat derece polimeri, daha sonra eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklanabilen GelMA oluşturmak için bir dondurarak kurutucu kullanarak bir hafta boyunca dondurarak kurutun.

Çip üretimi için önce metin protokolünde açıklandığı gibi oynatılan ve kalıplanan polimetakrilat veya PMMA'yı hazırlayın. Ardından, 30 gram PTMS elastomeri ve üç gram PTMS kürleme maddesini uygun şekilde karıştırarak PTMS kapağını ve PTMS tapasını hazırlayın. Karışımı bir vakum odası altında bir saat boyunca gazdan arındırın.

PTMS kapağı için karışımın 1.8 ila iki gramını PMMA kalıbına dökün. Ayrıca, PTMS tapası için PMMA kalıbı için her bir boşluğu doldurmak için uygun miktarı kullanın. Ek olarak, 10 gram kürlenmemiş PTMS karışımını 10 santimetrelik boş bir plastik plakaya dökün.

Bu kalıpları 30 dakika boyunca gazdan arındırmak için bir vakum odasına koyun. PTMS'yi 80 santigrat derecede iki saat kürleyin. Kalıp üzerinde kürlenmiş PTMS'yi soğuttuktan sonra, PTMS kapaklarını ve PTMS tapalarını PMMA kalıplarından ayırın.

Daha sonra, PTMS kapaklarının akış kanallarının uçlarında yaklaşık üç milimetre çapında iki delik açın. 10 santimetrelik plastik plakadan kalıplanmış PTMS levhasını bir santimetreye bir santimetre küpler halinde kesin. Ve her PTMS küpüne üç milimetrelik bir delik açın.

Orta rezervuarlar olarak hizmet etmek ve gradyan dairesel hidrojel modellerinin kürleme işlemine yardımcı olmak için iki kürlenmemiş bir santimetreye bir santimetre PTMS küpünü PTMS kapağının açıklıklarına yapıştırın. Daha sonra 80 santigrat derecede bir saat kürleyin. Daha sonra, PTMS kapaklarını iki PTMS rezervuarı ile TMSPMA kaplı bir kızağa yapıştırın.

Bunu yapmak için, PTMS kapağının bağlayıcı tarafını ve TMSPMA kaplı sürgüyü 90 saniyelik oksijen plazma işlemi için bir oksijen plazma makinesi altında ön işleme tabi tutun. PTMS kapaklarının plazma ile muamele edilmiş yüzeyine ve TMSPMA sürgüsüne temas edin ve silikon oksijen silikon bağının oluşumu yoluyla kalıcı yapışma için bunları sıkıca bastırın. Oluşturulan düzeni şeffaf bir film üzerine yazdırarak bir fotoğraf maskesi yazdırın.

Ardından basılı fotoğraf maskesini 25 milimetre x 37,5 milimetre boyutunda kesin. 25 miligram dondurularak kurutulmuş GelMA'yı 1.5 mililitrelik siyah mikrosantrifüj tüpünde 0.3 mililitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamına tartın. Mikrosantrifüj tüpünü, GelMA ortamda çözünene kadar bir laboratuvar karıştırıcı sıcak plakasına koyun.

Bir mikrosantrifüj tüpündeki bir mililitre DPBS'ye 50 miligram foto başlatıcı ekleyin. Ve 15 dakika veya foto başlatıcı çözülene kadar 80 derecelik bir fırına koyun. Mikrosantrifüj tüpüne 25 mikrolitre% 10 foto başlatıcı ekleyin.

İyice karıştırmak için birkaç kez pipetleyin. Ardından, otomatik bir hücre sayacı kullanarak üç milyon NIH3T3 hücresini sayın. Süspansiyonu beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve hücreleri 175 mikrolitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.

% 5 GelMA,% 0.5 foto başlatıcı ve% altı milyon 3T3 mililitre başına hücreden oluşan bir ön polimer hücre çözeltisi elde etmek için hücre çözeltisini mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Karıştırdıktan sonra, 100 mikrolitrelik bir mikroşırıngaya 100 mikrolitre hücre prepolimeri yükleyin. Fotoğraf maskesinin bir parçasını sterilize edilmiş gradyan gerinim çipinin alt sürgüsüne manuel olarak hizalayın.

Ve arada küçük bir damla deiyonize su kullanarak konumu sabitleyin. Prepolimer hücre çözeltisi ile yüklenmiş 100 mikrolitrelik mikroşırıngayı çipin girişine bağlayın. Daha sonra mikroşırıngayı kullanarak akış kanalına 50 mikrolitre prepolimer hücre çözeltisi yerleştirin ve bir PTMS fişi kullanarak prizi kapatın.

Dairesel PTMS membranında dışbükey bir çıkıntı oluşturmak için fazladan 40 mikrolitre çözelti enjekte edin. Çipi fotomaske, mikroşırınga ve PTMS fişi ile bir UV lambasının altına getirin. Ve akışkan odasındaki eşmerkezli dairesel hidrojeli çapraz bağlamak için 30 ila 45 saniye maruz bırakın.

Çapraz bağladıktan sonra, sıvı basıncını boşaltmak için PTMS tapasını ve mikroşırıngayı çıkarın. Çapraz bağlanmamış reçineleri girişten çıkışa yıkayarak üç kez yıkamak için önceden ısıtılmış DPBS ile yüklenmiş bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra akış kanalını yaklaşık 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile doldurun.

Çipi sterilize edilmiş bir kültür kabına yerleştirin ve bir hafta boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde kültürleyin. Ortamı her gün yenileyin. Kontrol grubu olarak dört saatlik inkübasyondan sonra sıfırıncı günde üç çipin görüntülerini alın.

Ve üçüncü günde, 20 kat objektifli bir mikroskop kullanılarak deney seti olarak üç çip. Kompres lekelerini hesaplamak için yazılım kullanarak her bir hidrojelin çizgi genişliğini birinci satırdan 12. satıra kadar ölçün. Burada, UV çapraz bağlama ve dört saatlik inkübasyondan sonra sıfır mikrolitre ve 40 mikrolitre enjeksiyon ile hidrojel modellerinin temsili sonuçları gösterilmiştir.

Aşırı enjeksiyonsuz kontroldeki 3D hidrojelin çizgi genişliği beklendiği gibi tek tip görünüyor. Bununla birlikte, 40 mikrolitre fazla enjeksiyonlu hidrojel desenleri, birinci satırdan 12. satıra kadar azalan bir hidrojel gradyan çizgi genişliği verir. Üç günlük inkübasyondan sonra, hidrojeldeki hücreler farklı yönlere uzanır.

Birinci sıradaki hücreler, hidrojel uzamasının uyarılması nedeniyle radyal yön boyunca hizalanır. Aksine, 12. satırdaki hücreler, geometri işaretinin hücresel hizalamaya hakim olduğu hidrojel şekli boyunca hizalanır. 7. satırda, birinci ve 12. satırdaki iki hücresel hizalama ipucunun birbirini dengelediği belirli bir hücre hizalaması yoktur.

3D hidrojel üzerindeki gradyan suşlarının mikro ortamını ölçtükten sonra, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, gradyan gerinim çipi tarafından iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hücre prepolimer çözeltisini yüklemeden önce gradyan gerinim çipini sterilize etmeyi unutmamak önemlidir. Ayrıca, çipleri hücre kültürü inkübatörüne yerleştirmeden önce çipin yüzeyini %75 etanol ile iyice silin.

Bu videoyu izledikten sonra, emperyal farklı suşlar altında hücre davranışlarını araştırmak için bir gradyan gerinim çipinin nasıl oluşturulacağını çok iyi anlamış olmalısınız.