Name: İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Öğrenin fare dişeti bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu ve karakterizasyonunu. Bu yöntem oral bağışıklık ve periodontitis patogenezindeki hücresel faktörleri incelemek için yeterli canlı hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar kısmen NIDCR'nin (NMM) intramural programı tarafından finanse edildi ve Wellcome Trust Stepping Stones Bursu (097820 / Z / 11 / B'den JEK'ye) ve Manchester İşbirlikçi İnflamasyon Araştırma Merkezi bursu (JEK'ye) tarafından desteklendi. Yazarlar, el yazmasını eleştirel bir şekilde gözden geçirdiği için Teresa Wild'a teşekkür eder.

Bu protokol açıklanan tüm deneysel prosedürleri gerekli kurallar takip ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, NIDCR / NIH tarafından kabul edildi. 1. Peşin hazırlayın <ol><li> Tam ortam hazırlayın: RPMI 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 10 FBS ile takviye edilmiştir. </li><li> 7.5 ug DNaz ile desteklenmiş RPMI medya 50 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): DNase ortamını hazırlayın. </li><li> DNaz medya artı 3.2 mg / kollajenaz Tipi IV ml 5 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): kollajenaz-DNAse ortamı hazırlayın. </li><li> Ön-serin FACS tamponu: PBS içinde seyreltilmiş% 0.5 FBS. </li><li> 4 ° C&#39;ye ön-serin santrifüj. </li><li> 37 ° C&#39;ye ısınmaya çalkalayıcı inkübatör. </li></ol> Dişeti Blokları 2. İzolasyon, Diseksiyon ve Hücre İzolasyonu <ol><li> ARAC kurallarına göre uygun bir odasında CO 2 onları teşhir ederek fareler Euthanize. </li> &lt;li&gt; kalp ve iç organları ortaya çıkarmak için göğüs ve karın boşluğu açın. serpmek için, inferior vena kava bir kesi yapmak ve bir 27 G iğne ile 3 ml şırınga kullanarak sol karıncığın yoluyla PBS 3 ml serpmek. </li><li> yukarı bakacak şekilde mide ile bir pad üzerinde vücut ve fare kafasını hareketsiz. </li><li> altta yatan dokuları ve kasları açığa mandibula ve boyun bölgesini kapsayan cilt ayıran, makasla boyuna doğru dudak her komissura kesin. mandibulayı ortaya çıkarmak için alt dudak teşrih. </li><li> alt ön dişlerin arasına Cut mandibula her iki tarafını ayrı ve ağız boşluğu erişmek için her tarafı hareketsiz hale getirmek. </li><li> Görselleştirmek ve uzak burun boşluğundan damak teşrih. </li><li> 10 bıçak kullanarak alanları incelemek ve dişeti (Şekil 1) çevreleyen maksiller ve mandibular molar alanları bulunmaktadır. Dikey kesiler sadece birinci molar ve posterior üçüncü molar ve yatay kesi de için ön yapmakDişeti sınır (doku çevreleyen diş beyaz yaka). </li><li> 5 ml kollajenaz / DNaz (buz üzerinde tutmak) ile 50 ml konik tüp içinde çene ve alt çene blok yerleştirin. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de çalkalamalı bir inkübatör içinde inkübe ve inkübasyon son 5 dakika boyunca 0.5 M EDTA, 50 ul ekle. </li><li> dokular ile 50 ml tüp soğuk DNaz medya 5 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın girdap. </li><li> petri üzerinde doku 4 blok aktarın ve DNaz medya 500 ul ile kaplayın. Bir neşter bıçak kullanarak ve dişeti ve diş arası alanlara bıçak işaret ederek, doku her bloğunun gingiva çıkarın. </li><li> hücre süzgeç (70 mikron boyut) ile yeni bir 50 ml tüp, petri yanı sıra diseksiyonu sırasında kullanılan önceki DNaz medyadan dokuları ve medya aktarın. DNaz medya (3-5 ml) kullanılan araçların ve filtrenin tüm yıkayın. </li><li> steril 3 ml şırınga pistonu kullanarak, süzgecin karşı doku püreSoğuk DNase medya (30 ila 35 ml) ile filtreleme. </li><li> Soğuk DNaz medya ile hücre süzgeç yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de santrifüj, 6 dakika boyunca 314 x g. </li><li> supernatant atmak eksiksiz bir medya 1 ml yeniden askıya. </li><li> Hücreleri saymak otomatik hücre sayacı kullanılarak (beklenen miktar&gt;% 80 canlılığı ile 6 10 x 1,2-5 10 x 8 arasındaki hücreleri arasında olmalıdır). </li></ol> Dişeti Hücrelerinin 3. stimülasyonu ve FACS Boyama <ol><li> Brefeldin A 1 ul / ml varlığında PMA (50 ng / ml) ve iyonomisin (2.5 ug / ml) ile tek bir hücre süspansiyonu teşvik </li><li> 37 ° C de 3.5 saat ve% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> Spin ve 4 ° C&#39;de PBS ve santrifüj ile yıkayın; 6 dakika 314 x g. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir canlılık leke kullanarak hücreleri leke. </li><li> dışı belirteçleri (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ veya karınca için Lekeüreticinin talimatlarına aşağıdaki seçim ibodies). </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de soğuk FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler yıkanır. </li><li> Yavaşça hücre pelletini bozmaya girdap. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehid hücreleri saptamak. </li><li> 4 ° C&#39;de, hücre içi sitokin 5 dakika ve leke 314 xg&#39;de soğuk FACS tamponu, santrifüj ile hücreler yıkanır. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj içinde seyreltilmiş, soğuk% 0.5 saponin çözeltisi ile FACS tüpler doldurun. </li><li> FACS tüpler% 0.5 saponin çözeltisi 300 ul ekle, 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edilir ve daha sonra 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 314 x g&#39;de santrifüj. </li><li> imalatçının talimatlarına uygun olarak hücre içi işaretleri (IL-17A ve IFNy ya da tercih edilen sitokinler) için hücrelerin lekelenmesi. 5 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de 314 xg% 0.5 saponin çözeltisi ve santrifüj ile hücreler yıkanır. </li><li> FACS ile tekrar yıkayıntampon ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 314 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> FACS tampon 300 ul hücrelerin yeniden askıya. </li></ol></li><li> Bir Akış sitometresindeki sonuçlarını analiz. </li></ol> 4. Akım Sitometri Analizi <ol><li> hücrelerin görselleştirmek enkaz dışlamak için ileri (FSC) ve yan dağılım (SCC) ve kapısı üzerinde analiz edilecek. </li><li> yüksekliği (FSC-H) parametreleri vs ileri dağılım alanı (FSC-A) Tek hücreleri seçin. </li><li> Daha fazla analiz (Şekil 2A ve 2C) için hematopoietik işaretleyici CD45 + için canlı (geçerlilik boyaması ile gösterildiği gibi) ve pozitif olan kapı hücreleri. </li><li> Şekil 2 ve Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, özel markörlerin analizi devam edin. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Mevcut teknik, başarılı bir şekilde uygun bir (tek bir fare), bağışıklık hücrelerinin büyük sayısını verir, sadece fenotipik karakterizasyon için değil, aynı zamanda fonksiyonel çalışmalar için ex vivo. Başka bir grup daha önce izole ve fare dişeti bağışıklık hücreleri karakterize bir protokol yayınlamıştır ve hayvan modellerinde 9 periodontitis çalışmada flow sitometri çok renkli kullanarak değerini tanıştırmıştı. Önemli sorun giderme Bu protokolde anahtar değişiklik aşağıdaki dişeti yaka alanları v...

Gingival dokusu, insan ve murin diş yapısına çevreleyen sürekli diş 1 kompleks biyofilm maruz kalmaktadır. Dişeti bariyeri polislik bağışıklık hücre ağı patojenik meydan 2 karşı etkili bağışıklık sağlayan, aynı zamanda, doku bütünlüğünü korumak, yerel ortakçı mikroplarla homeostazisini sağlanması ve hayati önem taşımaktadır. Homeostazı elde etmek için, bağışıklık sistemi dikkatlice henüz küçük ayrıntı dişeti bağışıklık hücre popülasyonlarının ve doku bağışıklığı 2 korunmasında rolleri bilinen bir yüksek ihtisas bağışıklık hücre ağı oluşturma dişeti çevre için hazırlanmıştır. Immün homeostasisin gingiva de bozulduğu zaman, ya da daha büyük bir konakçı karşı duyarlılık ve / veya disbiyotik mikrobiyal topluluklar, enflamatuar bir durumun varlığı sayesinde, periodontit 3 4 ortaya çıkar. Periodontitis diş s kaybına yol açan yaygın bir inflamatuar bir hastalıktıraltlık yapılar. Onun ağır formlarında genel nüfusun 5 yaklaşık% 10&#39;unda görülür. Periodontitis duyarlılık ve ilerlemesinde rol önemli faktörler Kesme 6 zor olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hayvan modelleri periodontitis başlangıcında ve ilerlemesinde 7 mekanizmalarını anlamak son derece yararlı olmuştur. Modeller bağışıklık homeostazı ve periodontitis sürücü gelişimini sürdürmek için hayati önem taşımaktadır anahtar hücre popülasyonlarının ve moleküler mediatörler tanımlamak için kullanılabilir. Böyle bir anlayış bağışıklık homeostazı dişeti özgü kontrol anlayışımızı dönüşümü ve hastalık patogenezinde güncel anlamanız açısından çok önemlidir.

<table><tbody><tr><td>İnce Makas</td><td>Güzel bilim aletleri</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Sapı #3</td><td>Güzel bilim aletleri</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Bıçakları #10</td><td>İnce bilim aletleri</td><td>10010-00</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Kıymık Forseps</td><td>Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>Normal eğimli iğneler&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 G, 12,7 mm uzunluk</td></tr><tr><td>Monoject şırıngalar</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Luer-lock uç, 3 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-049</td><td>Kalsiyum ve Magnezyum RPMI Olmadan</td></tr><tr><td>1640</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td> Sığır pankreasından <td>L-glutamin</td></tr><tr><td>DNaz I</td> içermeyen <td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip IV</td><td>Gibco (Yaşam teknolojileri tarafından)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>İkizler Biyo-ürünler</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin 50 mg / ml</td><td>Kaliteli biyolojik</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco (Yaşam teknolojileri tarafından)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco (Yaşam teknolojileri tarafından)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Kalite biyolojik</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüpler</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Polipropilen, steril</td></tr><tr><td>70 & mu; M Hücreli Süzgeçler</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Steril</td></tr><tr><td>5 ml FACS tüpleri</td><td>Corning</td><td></td><td>352052 Steril</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Brefeldin A çözeltisi içerir</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Miristat 13-Asetat (PMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin Kalsiyum Tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Quillaja kabuğundan Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD4 eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare TCR beta APC eFluor 780 eBioscience</td><td></td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare gama delta TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare IFN-&gama; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare NK1.1 PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare TCR beta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon, karakterizasyonu ve dişeti bağışıklık hücre ağı fonksiyonel sınav

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Dokulardaki immün hücre ağları, lokal bağışıklığa aracılık etmede ve doku homeostazını korumada hayati bir rol oynar, ancak oral mukoza ve dişetindeki yerleşik immün hücre popülasyonları hakkında çok az şey bilinmektedir. Sürekli mikrobiyal maruziyet alanı ve yaygın bir enflamatuar hastalık olan periodontitise karşı savunmasız bir bölge olan murin dişeti dokularından bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve incelenmesi için bir teknik oluşturduk. Protokolümüz, kararlı durumda bile dişetinde yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonlarının ayrıntılı bir fenotipik karakterizasyonuna izin verir. Prosedürümüz ayrıca, sitokin sekresyonunun ex vivo olarak değerlendirilmesi gibi fonksiyonel çalışmalarda kullanım için yüksek canlılığa sahip yeterli hücre verir.Dişeti immün hücre ağının fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunun bu kombinasyonu, oral bağışıklık ve periodontal homeostaz ile ilgili mekanizmaların araştırılmasına yardımcı olacaktır, ancak aynı zamanda lokal immünopatolojide yer alan mekanizmaları anlamamızı da ilerletecektir.

(- / - Şekil 2A - C LFA vs WT) protokolünün uygulanmasını göstermek için, bağışıklık hücresi ile ve periodontitis olmayan farelerin dişetinde ağı inceleyen temsili sonuçlar göstermektedir. Temsilcisi FACS araziler dişeti (Şekil 2A, 2C) canlı CD45 + hematopoetik hücreler gösterir. Bu protokol ile bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve işleme ex vivo uyarılması ve sitokin salgı desen karakteri...

Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Bu yöntemin genel amacı, ağız immünitesi ve periodontitis ile ilişkili immün yanıtların derinlemesine karakterizasyonu için gingival immün hücreleri izole etmektir. Bu yöntem, periodontitis patogenezinde hangi hücresel faktörlerin rol oynadığı gibi ağız immünitesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, ağız immün hücre ağının değerlendirilmesine ve sonraki in-vitro araştırmalar için yeterli miktarda canlı hücrenin izole edilmesine olanak tanımasıdır.Bu protokolün ilk adımı olarak, farenin gövdesini sabitlemek için iğneler yerleştirerek başlayın ve kalbi ile iç organları açığa çıkarmak için toraks ve abdominal boşlukları açın. Ardından, vena cava'da bir insizyon yapın ve sol ventrikül üzerinden 3 mililitre PBS infüze etmek için 27 gauge iğne uçlu 3 mililitrelik bir şırınga kullanın. Tüm kan temizlendiğinde, farenin başını karın bölgesi yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon pedine iğneleyin.Ardından, alt çene ve boyun bölgesini örten deriyi ayırmak ve alttaki dokuları ve kasları açığa çıkarmak için makas kullanarak dudağın her bir komissürünü boyuna doğru kesin. Alt çenenin her iki yanını ayırmak için alt kesici dişlerin arasından kesin. Ağız boşluğuna erişmek için ayrılan alt çenenin her iki yanını 25-gauge iğnelerle sabitleyin.Damak belirlendikten sonra, birinci molar dişin hemen önüne ve üçüncü molar dişin arkasına dikey insizyonlar yapmak için 10 numara cerrahi bıçak kullanın. Ardından dokuyu nazal boşluktan ayırarak diseke edin ve blokları mandibuladan diseke ederek ayırın. Sonrasında diş eti sınırındaki fazla dokuları temizleyin; maksiller ve mandibular blokları, buz üzerinde 5 mL kollajenaz ve DNaz içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Dokuları, son beş dakikada 50 µL 0,5 M EDTA ekleyerek, bir çalkalayıcı inkübatörde 37 °C'de bir saat boyunca sindirin. Ardından dokulara 5 mL soğuk DNaz medyumu ekleyin ve tüp içeriğini dairesel hareketlerle nazikçe karıştırın. Son olarak, dört doku bloğunu bir petri kabına aktarın.Ve üzerlerini 500 µL taze DNaz besiyeri ile kapatın. Her bir doku bloğundan diş etini uzaklaştırmak için bir skalpel kullanın. Ve kaptaki tüm içeriği, 50 mL'lik bir tüpün üzerindeki 70 µm'lik hücre süzgecine aktarın.Petri kabını ve süzgeci 3 ila 5 mililitre taze DNase medyumu ile yıkayın. Daha sonra, diş eti dokusunu süzgeç telinin üzerine bastırarak ezmek için steril, 3 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın. Süzgeci 30 ila 35 mililitre soğuk DNase medyumu ile durulayın ve filtratı santrifüjleyin.Ardından pellet'i 1 milliliter tam medyuma resüspande edin ve canlı hücre sayısını belirleyin. Az önce gösterilen immün hücrelerin izolasyonu ve işlemesi, hem yabani tip hem de periodontite yatkın hayvanlardan gingival hücre sitokin sekresyon paternlerinin ex-vivo stimülasyonunu ve karakterizasyonunu gerçekleştirmek için yeterli sayıda hücre sağlar. Nitekim, periodontite yatkın LFA knockout farelerde t ve doğal öldürücü hücre kompartmanlarını değerlendiren bu yoğunluk grafiklerinde gösterildiği gibi, murin gingival immün hücre kompozisyonu analiz edilebilir.Uygun kapılama (gating) stratejileri kullanılarak TCR beta CD4 pozitif, TCR beta CD8 pozitif ve TCR gama delta pozitif T hücrelerinin yanı sıra NK ve doğal lenfoid hücrelerin hücre içi sitokin üretimi de belirlenebilir. Teknik doğru şekilde uygulandığında, yöntem uzmanlaşıldıktan sonra hücreler immünoboya için üç saat içinde izole edilebilir. Bu prosedürü uygularken, hücreler manipüle edilmediği her an buz üzerinde tutularak tüm adımların verimli ve hızlı bir şekilde tamamlanması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, spesifik hücre alt kümelerinin fonksiyonuna ilişkin ek soruları yanıtlamak için hücre ayıklama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

isolation-characterization-functional-examination-gingival-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Bu video, bir fare modelinden dişeti bağışıklık hücresi ağının izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim, diş eti dokusunu bağlı dişlerden ve kemikten serbest bırakır, bu da mekanik olarak daha fazla sindirilir ve diş etinden bağışıklık hücrelerini serbest bırakır. İzole edilen hücreler immünolojik deneyler için hazırdır.

Murin Diş Bloklarından Dişeti İmmün Hücre Ağının İzolasyonu

Bu çalışma, bir tek hücre kültürü üretmek için fare ağız boşluğundan gingival dokular izole etmek ve işlemek için etkili bir yöntem açıklanır. Ortaya çıkan hücreler bir başka akış sitometri analizi ve klinik çalışmalar için kullanılabilir.

Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

Bu makale iki protokol sunar: biri konakçıyı başarılı bir şekilde istila edebilen ve hayatta kalabilen anaerobik bakterileri ölçmek, diğeri ise konakçı hücrelerle etkileşime giren anaerobik bakterileri görselleştirmek için. Bu çalışma, yetiştirilebilir herhangi bir anaeroba ve herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Protokol amacı bir enflamatuar insan jinjiva modeli içinde vitrooluşturmaktır. Bu doku model insan hücreleri, HaCaT keratinositler, dişeti fibroblastlar ve THP-1 makrofajlar, üç boyutlu koşullar altında üç tür ortak yetiştirerek. Dişeti iltihabı ve periodontitis gibi periodontal hastalıkların araştırılması için bu modeli uygulayabilirsiniz.

Üç boyutlu inflamatuar insan dokusu jinjiva karşılıkları

Bu protokolde, kısmi cerrahi tonsillektomi uygulanan sağlıklı insanlardan bademcikler mononükleer hücrelerin invazyon asyonunu inceleyip mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebileceğimizi açıklıyoruz.

Bademcikler Mononükleer Hücrelerin İzolasyon Ex Vivo Doğuştan Gelen Bağışıklık Yanıtları Bir İnsan Mukozal Lenfoid Doku Çalışma

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Mevcut protokol, sürekli büyüyen bir fare kesici dişinden, fare azı dişinden ve insan dişlerinden tek hücreli RNA-seq analizine uygun tek hücreleri izole etmek için hızlı, verimli ve nazik bir yöntem sunar.

Fare ve İnsan Dişlerinden Tek Hücrelerin Hızlı İzolasyonu

Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

Bu protokolün amacı, fırın diş eti epitel bariyerinin bütünlüğünü nicel olarak değerlendirmek için standart bir yaklaşım sağlamaktır; diş eti yüzeyine farklı moleküler boyutlarda floresans etiketli dekstransları in vivo uygulanarak ve ardından tek foton mikroskopi sistemiyle ex vivo görüntüleme uygulanır.

Fusesans İzleyicilerle Fare Diş Etili Epitelyal Bariyerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

Öğrenin fare dişeti bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu ve karakterizasyonunu. Bu yöntem oral bağışıklık ve periodontitis patogenezindeki hücresel faktörleri incelemek için yeterli canlı hücre sağlar.

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Daha fazla video keşfet