İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Bu yöntemin genel amacı, oral bağışıklık ve periodontitis ile ilgili immün yanıtların derinlemesine karakterizasyonu için dişeti immün hücrelerini izole etmektir. Bu yöntem, periodontitis patogenezinde hangi hücresel faktörlerin rol oynadığı gibi oral bağışıklık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, oral immün hücre ağının değerlendirilmesine ve aşağı akış in vitro araştırmalar için yeterli canlı hücrenin izolasyonuna izin vermesidir.

Bu protokolün ilk adımı olarak, farenin vücudunu hareketsiz hale getirmek için pimler yerleştirerek başlayın ve kalbi ve iç organları ortaya çıkarmak için göğüs ve karın boşluklarını açın. Daha sonra, vena kavada bir kesi yapın ve sol ventrikül yoluyla 3 mililitre PBS'yi bol miktarda tüketmek için 27 gauge iğne ile donatılmış 3 mililitrelik bir şırınga kullanın. Kanın tamamı temizlendiğinde, farenin başını mide yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon pedine sabitleyin.

Daha sonra dudağın her bir komiseriyle boynuna doğru kesmek, mandibula ve boyun bölgesini kaplayan cildi ayırmak ve alttaki dokuları ve kasları açığa çıkarmak için makas kullanın. Mandibulanın her iki tarafını ayırmak için alt kesici dişler arasında kesin. Ağız boşluğuna erişmek için ayrılmış mandibulanın her iki tarafını 25 gauge iğnelerle hareketsiz hale getirin.

Damağı belirledikten sonra, birinci azı dişinin hemen önünde ve üçüncü azı dişinin arkasında dikey kesiler yapmak için 10 numara cerrahi bıçak kullanın. Daha sonra dokuyu burun boşluğundan uzaklaştırın ve ayrıca blokları mandibuladan inceleyin. Daha sonra dişeti sınırındaki fazla dokuyu ortadan kaldırın ve maksiller ve mandibular blokları buz üzerinde 5 mililitre kollajenaz ve DNaz içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Dokuyu bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatörde sindirin ve son beş dakika boyunca 50 mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin. Daha sonra dokulara 5 mililitre soğuk DNaz ortamı ekleyin ve tüp içeriğini döndürerek hafifçe karıştırın. Ardından, dört doku bloğunu bir petri kabına aktarın.

Ve üzerlerini 500 mikrolitre taze DNase ortamı ile örtün. Diş etini her doku bloğundan çıkarmak için bir neşter kullanın. Ve yemeğin tüm içeriğini 50 mililitrelik bir tüpün üzerine 70 mikronluk bir hücre süzgecine aktarın.

Petri kabını ve süzgeci 3 ila 5 mililitre taze DNaz ortamı ile yıkayın. Ardından, diş eti dokusunu süzgecin ağına karşı ezmek için steril, 3 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın. Süzgeci 30 ila 35 mililter soğuk DNaz ortamı ile durulayın ve süzgeci santrifüjleyin.

Daha sonra damağı 1 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Az önce gösterildiği gibi bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve işlenmesi, hem vahşi tip hem de periodontite duyarlı hayvanlardan dişeti hücresi sitokin salgı paternlerinin ex-vivo stimülasyonunu ve karakterizasyonunu gerçekleştirmek için yeterli sayıda hücre verir. Gerçekten de, murin dişeti bağışıklık hücresi bileşimi, periodontitise duyarlı LFA nakavt farelerinde t ve doğal öldürücü hücre bölmelerini değerlendiren bu yoğunluk grafiklerinde gösterildiği gibi analiz edilebilir.

Uygun geçit stratejileri kullanılarak, TCR beta CD4 pozitif, TCR beta CD8 pozitif ve TCR gama delta pozitif t hücrelerinin yanı sıra NK ve doğuştan gelen lenfoid hücrelerin hücre içi sitokin üretimi de belirlenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse, hücreler immüno-boyama için üç saat içinde izole edilebilir. Bu prosedürü denerken, tüm adımları verimli ve hızlı bir şekilde tamamlamayı ve hücreleri manipüle edilmediklerinde buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu yordamı takiben, belirli hücre alt kümelerinin işleviyle ilgili ek soruları yanıtlamak için hücre sıralama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.